本发明属于生物技术及食品工程应用领域，涉及一种灵芝液体发酵天然培养及发酵产物全利用方法。
背景技术：
灵芝又称为仙草、瑞草、神芝、不老草，属担子菌纲、伞菌目、多孔菌科、灵芝属真菌，是我国中医药宝库中的珍品，深受人们喜欢。灵芝在我国、韩国及日本等亚洲国家已有2000多年的药用历史。目前灵芝主要用于肝炎、糖尿病、高血压、高血脂和胃癌等疾病的预防及治疗。除具有极高的药用价值外，目前灵芝还是一种人们日常食用的补品，具有预防疾病、增强体力以及延年益寿等功效。近年来灵芝需求不断增长。
目前灵芝生产主要采用人工栽培法获得其子实体，使用的栽培原料主要为木屑或椴木，在我国已大规模商业化生产，但该生产方法具有周期长、产品质量不稳定以及不易采用工业化生产技术等缺点。不同于人工栽培法，液体深层发酵法具有生产周期短，产品质量稳定以及易工业化生产等优点，此外近年来的研究表明灵芝液体发酵产物如多糖和三萜具有与子实体来源的多糖及三萜具有相近的生物活性，因此，液体深层发酵法用于灵芝的生产受到人们的高度重视，显示出巨大的发展潜力。
灵芝液体发酵通常以葡萄糖、蔗糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨和酵母粉等为主要成分配制发酵培养基，发酵结束后主要收集灵芝菌丝体，用于提取灵芝功能成分多糖或三萜，或菌丝体直接加工为菌粉作为一种营养保健品；发酵液由于活性成分含量较低，其回收成本高，另外由于发酵培养基中含大量不可食用成分，发酵液不能直接用于食品及保健品的开发，因此，菌丝体分离后的发酵液多作为废弃物直接加以排放，不但造成资源浪费，且污染环境。本发明公布了一种灵芝液体发酵天然培养及发酵产物全利用方法，可显著提高灵芝液体发酵的经济效益，不带来资源浪费及环境污染，具有极大的推广应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种灵芝液体发酵天然培养及发酵产物全利用方法。配制一种液体天然培养基，发酵后菌丝体用于多糖及三萜共提取，发酵液用于灵芝发酵保健饮料开发，实现灵芝液体发酵产物的全利用，不造成资源浪费及环境污染，经济效益显著。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
所述方法包括如下步骤：
（1）天然发酵培养基制备，以每升计：西红柿或胡萝卜去皮，切成细块状；称取200g西红柿或200g胡萝卜，和150克麸皮放置于1000ml纯净水，煮沸30min，过滤弃渣，用纯净水补充至1000ml，加入40g蔗糖，其配方即为：200g/l西红柿或200g/l胡萝卜，150g/l麸皮，蔗糖40g/l；
（2）将培养基加入空消过的发酵罐，121℃实消30min；
（3）按5%（v/v）接种量将灵芝液体种接种至发酵罐。发酵条件：转速150rpm，温度28℃，通气量0.5vvm，ph自然，发酵5d；
（4）收集菌丝体及发酵液；菌丝体洗涤后60℃烘干；
（5）菌丝体多糖及三萜共提取方法：
提取溶剂40%乙醇，料液比1:30g/ml,提取温度80℃，提取时间3h，提取次数2-3次；将提取液合并，真空浓缩，冷冻干燥获得提取物。检测显示所制备的提取物多糖含量46%以上（苯酚-硫酸法测定，以葡萄糖为对照）及三萜含量42%以上（高氯酸-香草醛法测定，以熊果酸为对照），其可作为高效灵芝产品的生产原料；
（6）去除菌丝体的发酵液的利用方法：
1）调配：去除菌丝体的发酵液用纯净水5倍稀释，加入蔗糖，终浓度为5wt.%；同时添加终浓度2.5wt.%柠檬酸、1wt.%ß-环糊精以及0.1wt.%食品级羧甲基纤维素纳，搅拌均匀；
2）澄清：将料液加热至90℃后再冷却至45℃，加入终浓度0.4wt.%壳聚糖并搅拌，保温30min，冷却后过滤；
3）灌装灭菌：过滤后的料液迅速加热至90℃，罐装至消毒过的塑料瓶，留2cm空隙封口，80℃灭菌50min，即为灵芝发酵保健饮料，适宜成年人及老年人饮用。
本发明的有益效果是:
1.发酵培养基成本低；
2.发酵培养基均由可食用原料配制而成，发酵所获得的菌丝体具有高安全性；
3.发酵液可直接用于高安全性灵芝保健饮料的开发，无食品安全问题；传统灵芝发酵培养基中由于含大量非食用成分，其发酵液不能用于保健饮料开发；
4.灵芝菌丝体采用经正交试验获得的优化条件用于多糖及三萜的共提取，提取物中同时含有高含量的灵芝多糖和三萜，是一种优良的原料，可用于高效灵芝产品的开发；
5.采用本发明的培养基用于灵芝发酵，全部发酵产物均可充分利用，无环境污染问题，显著提高生产企业经济效益。
具体实施方式
本发明提供了一种灵芝液体发酵培养及发酵产物全利用方法，下面实施例来进一步描述本发明的使用方法，但这些实施例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。此外，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换仍在本发明保护范围。
实施例1
1．菌种活化：将保存的灵芝斜面菌种转至马玲薯葡萄糖琼脂（pda）斜面，25℃培养7d。
2．液体菌种制备：将活化后的菌种接种至80ml马玲薯葡萄糖液体培养基（pdb）（装于250ml三角瓶）；28℃、160rev/min培养4d，为一级种；将一级种超声破碎，吸取20ml接种至400mlpdb培养基（装于1000ml三角瓶）；28℃、120rev/min培养3d，形成大量致密小菌丝球，作为二级种用于发酵接种；
3.天然发酵培养基制备（以每升计）：西红柿去皮，切成细块状；称取200g西红柿和150g麸皮放置于1000ml纯净水，煮沸30min，过滤弃渣，用纯净水补至1000ml，加入40g蔗糖，其配方即为：200g/l西红柿，150g/l麸皮，蔗糖40g/l；
4．将6.65l天然发酵培养基转移至空消过的10l发酵罐，121℃实消30min；
5．发酵培养基冷却至约30℃时将350ml二级种接入培养基；
6．发酵条件为转速150rpm，温度28℃，通气量3.5l/min；发酵时间5d；
7．发酵结束后过滤分离菌丝体；菌丝体60℃烘干，用于多糖及三萜共提取；去除菌丝体后的发酵液用于灵芝保健饮料生产；
8．菌丝体的利用：多糖及三萜的共提取
提取条件经正交试验获得：提取溶剂40%乙醇，料液比1:30g/ml提取温度80℃，提取时间2h，提取次数3次。将提取液合并，真空浓缩，冷冻干燥获得提取物，检测显示所制备的提取物中灵芝多糖含量46%以上及三萜含量42%以上，可作为高效灵芝产品的生产原料。
9．去除菌丝体的发酵液的利用：灵芝发酵保健饮料生产
（1）调配：将去除菌丝体的发酵液用纯净水5倍稀释，加入蔗糖，含量为5%，以及添加2.5%柠檬酸、1%ß-环糊精以及0.1%食品级羧甲基纤维素纳，搅拌均匀；
（2）澄清：将料液加热至90℃后冷却至45℃，加入终浓度0.4%的壳聚糖并搅拌，保温30min，冷却后过滤；
（3）灌装灭菌，过滤液快速加热至90℃，罐装至消毒过的塑料瓶，留2cm空隙封口，80℃灭菌50min，即为灵芝发酵保健饮料，适宜成年人及老年人饮用。
（4）经检测，灵芝多糖含量约250mg/l，灵芝三萜含量约150mg/l。
实施例2
1．灵芝菌种活化同实施例1；
2．一级种及二级种制备同实施例1；
3．天然发酵培养基制备；以每升计：胡萝卜去皮，切成细块状；称取200g胡萝卜，和150克麸皮放置于1000ml纯净水，煮沸30min，过滤弃渣，用纯净水补充至1000ml，加入40g蔗糖，其配方即为：200g/l胡萝卜，150g/l麸皮，蔗糖40g/l；
4．将10l种子罐121℃空消30min，加入6.65l发酵培养基，121℃实消30min
冷却后接入350ml二级种，28℃、160rpm培养4d，用于接种发酵；
5.将47.5l发酵培养基加入空消过的100l发酵罐，121℃实消30min；
6.发酵培养基冷却至30℃时将种子罐内的2.5l液体种经移种管压入100l发酵罐；
7．发酵条件为转速140rpm，温度28℃，通气量25l/min，发酵时间4d；
8．发酵结束后过滤分离菌丝体。菌丝体自来水洗涤后60℃烘干，用于多糖及三萜的共提取；去除菌丝体的发酵液用于灵芝保健饮料生产；
9．菌丝体的利用：多糖及三萜的共提取
提取条件经正交试验获得：提取溶剂40%乙醇，料液比1:30g/ml，提取温度80℃，提取时间2小时，提取次数2次。将提取液合并，真空浓缩，冷冻干燥获得提取物，提取物中灵芝多糖含量46%以上（苯酚-硫酸法测定，以葡萄糖为对照）及三萜含量42%以上（高氯酸-香草醛法测定，以熊果酸为对照），可作为高效灵芝产品生产原料。
10．去除菌丝体发酵液的利用：灵芝发酵保健饮料制备
（1）调配：去除菌丝体的发酵液用纯净水5倍稀释，加入5%蔗糖，以及添加2.5%柠檬酸、1%ß-环糊精以及0.1%食品级羧甲基纤维素纳，搅拌均匀；
（2）澄清：将料液加热至90℃后冷却至45℃，加入0.4%壳聚糖并搅拌，保温30min，冷却后过滤；
（3）灌装灭菌，过滤液快速加热至90℃，罐装至消毒过的塑料瓶，留2cm空隙封口，80℃灭菌50min，即为灵芝发酵保健饮料，适宜成年人及老年人饮用。
（4）经检测，灵芝多糖含量约180mg/l，灵芝三萜约120mg/l。