本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用谷氨酸发酵液生产γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术：
γ-聚谷氨酸(polyγ-glutamnicacid，γ-pga)作为一种生物高分子材料具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害的优点。因此，γ-聚谷氨酸及其衍生物在食品、化妆品、医药和水处理等方面具有广泛的用途。
目前合成γ-聚谷氨酸的方法主要有化学合成法、提取法和微生物合成法等。但是化学合成法合成路线长、副产物多、收率低，并且产物的分子量小、难于满足作为新型药物载体材料的要求，没有工业应用价值。而提取法由于γ-聚谷氨酸浓度较低，且随条件不同，含量变化大。因此，提取工艺十分复杂，生产成本甚高，同样难以进行大规模的工业生产。
而虽然γ-聚谷氨酸的发酵生产取得了较大的进展，但是仍然存在发酵过程耗用原材料较多、产量低，能耗高等缺点，从而导致生产成本较高地问题，严重制约了聚谷氨酸产品的大规模的工业应用。
因此，目前存在的问题是亟需研究开发一种原料产率较高，能耗较低的聚谷氨酸生产工艺。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供了一种生产γ-聚谷氨酸的方法。该方法在发酵过程耗用原材料较低、产量高，能耗低，适合聚谷氨酸产品的大规模的工业应用。
为此，本发明提供了一种生产γ-聚谷氨酸的方法，其包括：
步骤b，将谷氨酸发酵菌种接种至谷氨酸发酵培养基中进行发酵培养获得谷氨酸发酵液；
步骤c，将谷氨酸发酵液进行菌体分离处理，并对菌体分离处理后的谷氨酸发酵液的上清液进行稀释，获得谷氨酸发酵稀释液；
步骤e，将聚谷氨酸发酵菌种接种至谷氨酸发酵稀释液中进行发酵培养获得聚谷氨酸发酵液；
其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得。
本发明中，所述谷氨酸发酵菌种的相应的菌株为谷氨酸棒杆菌菌株。
在一些实施例中，所述谷氨酸棒杆菌菌株为来自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为：ciccno.23707的菌株。
本发明中，所述聚谷氨酸发酵菌种为枯草芽孢杆菌菌株。
在一些实施例中，所述枯草芽孢杆菌菌株为来自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为：ciccno.20643的菌株。
本发明中，所述谷氨酸发酵稀释液的浓度为50-70g/l，优选为60-70g/l，进一步优选为60-63.6g/l。
在本发明的一些优选的实施方式中，在步骤c中，采用离心处理的方式进行菌体分离处理，且离心处理的条件为：温度为4-6℃，转速为8000-12000rpm，时间为20-40min。
根据本发明的一些实施方式，所述谷氨酸发酵培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
在一些实施例中，所述谷氨酸发酵培养基的ph值为6.5-7.0。
根据本发明的一些实施方式，所述聚谷氨酸发酵培养基包括步骤c获得的谷氨酸发酵稀释液以及以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
在一些实施例中，所述聚谷氨酸发酵培养基的ph值为6.5-7.0。
在本发明的一些实施方式中，在步骤b中，谷氨酸发酵菌种以种子培养液的方式加入，种子培养液的加入量以发酵培养基的总体积计为5v％-10v％；优选种子培养液的ph值为6.5-7.0。
在本发明的另一些实施方式中，在步骤e中，聚谷氨酸发酵菌种以种子培养液的方式加入，种子培养液的加入量以发酵培养基的总体积计为5v％-10v％；优选种子培养液的ph值为6.5-7.0。
本发明所提供的生产γ-聚谷氨酸的方法采用分步发酵的方式可以有效提高原料利用率和聚谷氨酸产率。采用该方法生产γ-聚谷氨酸，产物分子量分布窄，且分子量最高可达870kda。该方法在发酵过程耗用原材料较低、产量高，能耗低，适合聚谷氨酸产品的大规模的工业应用。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。
如前所述，在目前合成γ-聚谷氨酸的方法中，化学合成法合成路线长、副产物多、收率低，并且产物的分子量小、难于满足作为新型药物载体材料的要求，没有工业应用价值。而提取法的提取工艺十分复杂，生产成本甚高，同样难以进行大规模的工业生产。虽然γ-聚谷氨酸的发酵生产取得了较大的进展，但是仍然存在发酵过程耗用原材料较多、产量低，能耗高等缺点，从而导致生产成本较高地问题，严重制约了聚谷氨酸产品的大规模的工业应用。因而，目前亟需研究开发一种原料产率较高，能耗较低的聚谷氨酸生产工艺。鉴于此，本发明人对γ-聚谷氨酸的生产方法进行了大量研究。
本发明人研究发现，本领域技术人员根据本领域的一般发酵经验，通常采用混菌发酵培养的方式生产谷氨酸，认为这样比较有利于发酵培养基的充分利用，产率高，能耗低，并基于此对混菌培养条件进行了不断的优化，但是结果并不尽如人意。本发明人进一步研究意外发现，采用传统的混菌发酵培养的方式生产谷氨酸，发酵过程中两种菌株相互竞争导致培养基利用率底下，尤其是采用一次性高浓度添加pga发酵培养基、影响菌株对培养基的利用，同时，为优化发酵过程而通过温度调控菌株生长导致发酵过程能耗较高。基于此，本发明人经过大量试验，发现采用分步发酵的方式可以有效提高原料利用率和聚谷氨酸产率。
因此，本发明所提供的生产γ-聚谷氨酸的方法主要包括：
步骤b，将谷氨酸发酵菌种接种至谷氨酸发酵培养基中进行发酵培养获得谷氨酸发酵液；
步骤c，将谷氨酸发酵液进行菌体分离处理，并对菌体分离处理后的谷氨酸发酵液的上清液进行稀释，获得谷氨酸发酵稀释液；
步骤e，将聚谷氨酸发酵菌种接种至谷氨酸发酵稀释液中进行发酵培养获得聚谷氨酸发酵液；
其中，所述发酵菌种由相应的菌株经过种子培养获得。
根据本发明的一些实施方式，所述谷氨酸发酵菌种的相应的菌株为谷氨酸棒杆菌菌株。例如，在一些实施例中，所述谷氨酸棒杆菌菌株为来自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为：ciccno.23707的菌株。
根据本发明的一些实施方式，所述聚谷氨酸发酵菌种为枯草芽孢杆菌菌株。例如，在一些实施例中，所述枯草芽孢杆菌菌株为来自中国工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为：ciccno.20643的菌株。
根据本发明的一些实施方式，本发明所涉及的生产γ-聚谷氨酸的方法还包括在步骤b之前种子培养的步骤a：将斜面谷氨酸棒杆菌菌种接种至种子培养基中，震荡培养，完成谷氨酸棒杆菌的扩增，获得种子培养液(谷氨酸发酵菌种)。
在本发明的一些实施例中，步骤a中的种子培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
本发明人进一步对步骤a中的种子培养基进行了优化研究，结果表现该种子培养基按照以下组成配制有利于谷氨酸棒杆菌菌种的扩增，所述种子培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
在本发明的一些实施例中，在步骤a中，采用40％(wt/v)的氢氧化钠溶液和36％(v/v)盐酸溶液调整种子培养基的初始ph值，所述种子培养基的ph值为6.5-7.0，所述种子培养基的ph值为7.0。
在本发明的一些具体实施例中，将斜面谷氨酸棒杆菌菌种接种至含有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，ph7.0，培养温度30±0.5℃，置于摇床上，以175rmp的转速振荡培养8-12h，获得谷氨酸发酵菌种的种子培养液。
在本发明的一些具体实施例中，在所述种子培养液中，菌种的菌落形成单位(cfu)为(8-27)×108/ml。
根据本发明的一些实施方式，所述发酵培养为菌种游离的发酵培养，发酵菌种以种子培养液的形式接种到发酵培养基。例如，在步骤b中，发酵菌种以种子培养液的方式加入，种子培养液的加入量以发酵培养基的总体积计为5v％-10v％，优选为5v％。
在本发明的一些实施例中，所述种子培养液的ph值为6.5-7.0，优选种子培养液的ph值为7。
根据本发明的一些实施方式，所述谷氨酸发酵培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
为获得较高的谷氨酸的产率，本发明人对发酵培养基进行了优化研究，结果表现发酵培养基按照以下组成配制有利于发酵培养，所述发酵培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
在本发明的一些实施例中，采用40％(wt/v)的氢氧化钠溶液和36％(v/v)盐酸溶液调整发酵培养基的初始ph值，所述谷氨酸发酵培养基的ph值为6.5-7.0，所述谷氨酸发酵培养基的ph值为7.0。
在本发明的一些具体实施例中，将谷氨酸种子培养液加入发酵培养基中，谷氨酸种子培养液的加入量为5v％，ph7.0，培养温度30±0.5℃，置于摇床上，以300rmp的转速振荡培养40-48h，获得谷氨酸发酵液。
本发明人研究发现，通过控制用于聚谷氨酸发酵培养的培养基中谷氨酸发酵液的浓度可以更为有效地提高原料利用率和聚谷氨酸产率，降低发酵过程的能耗。进一步研究发现，所述谷氨酸发酵稀释液的浓度较低，例如低于60g/l会导致pga产量下降，所述谷氨酸发酵稀释液的浓度较高，例如高于63.6g/l会导致pga成本上升。例如，glu浓度为50g/l时，pga产量下降了7％-15％；在pga浓度为70g/l时，pga的产量仅上升了4％-7％，部分情况下甚至下降了5％，据此认为63.6g/l为谷氨酸发酵稀释液的最佳浓度。
在本发明的一些实施例中，所述谷氨酸发酵稀释液的浓度为50-70g/l，优选为60-70g/l，进一步优选为60-63.6g/l，甚至更为优选的是63.6g/l。
另外，本发明人经研究还发现，生产γ-聚谷氨酸的过程中，脱除谷氨酸发酵液中的菌体，能够减少谷氨酸棒杆菌对下一步聚谷氨酸发酵的负面影响。在本发明的一些优选实施例中，在步骤c中，采用离心处理的方式进行菌体分离处理，且离心处理的条件为：温度为4-6℃，转速为8000-12000rpm，时间为20-40min。
在本发明的一些具体优选的实施例中，在步骤c中，向谷氨酸发酵液中加入0.5％(w/v)的硅藻土，4℃，8000rpm，离心30min，获得谷氨酸发酵液的上清液。
根据本发明的一些实施方式，本发明所涉及的生产γ-聚谷氨酸的方法还包括在步骤e之前种子培养的步骤d：将斜面枯草芽孢杆菌菌种接种至种子培养基中，震荡培养，完成枯草芽孢杆菌的扩增，获得种子培养液(聚谷氨酸发酵菌种)。
在本发明的一些实施例中，步骤a中的种子培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
本发明人进一步对步骤d中的种子培养基进行了优化研究，结果表现该种子培养基按照以下组成配制有利于谷氨酸棒杆菌菌种的的扩增，所述种子培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
在本发明的一些实施例中，在步骤d中，采用40％(wt/v)的氢氧化钠溶液和36％(v/v)盐酸溶液调整种子培养基的初始ph值，所述种子培养基的ph值为6.5-7.0，所述种子发酵培养基的ph值为7.0。
在本发明的一些具体实施例中，将斜面谷氨酸棒杆菌菌种接种至含有50ml种子培养基的250ml三角瓶中，ph7.0，培养温度30±0.5℃，置于摇床上，以175rmp的转速振荡培养12-16h，获得聚谷氨酸发酵菌种的子培养液。
在本发明的一些具体实施例中，在在步骤d的种子培养液中，菌种的菌落形成单位(cfu)为(8-27)×108/ml。
根据本发明的一些实施方式，步骤e的所述发酵培养为菌种游离的发酵培养，发酵菌种以种子培养液的形式接种到发酵培养基。例如，在步骤e中，发酵菌种以种子培养液的方式加入，种子培养液的加入量以发酵培养基的总体积计为5v％-10v％，优选为5v％。
在本发明的一些实施例中，步骤e的所述发酵培养液的ph值为6.5-7.0，优选发酵培养液的ph值为7。
根据本发明的一些实施方式，在步骤e中，所述聚谷氨酸发酵培养基包括步骤c获得的谷氨酸发酵稀释液以及以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
为获得较高的聚谷氨酸的产率，本发明人对步骤e的发酵培养基进行了优化研究，结果表现步骤e的发酵培养基按照以下组成配制有利于发酵培养，所述发酵培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
在本发明的一些实施例中，采用40％(wt/v)的氢氧化钠溶液和36％(v/v)盐酸溶液调整发酵培养基的初始ph值，所述聚谷氨酸发酵培养基的ph值为6.5-7.0，所述聚谷氨酸发酵培养基的ph值为7.0。
在本发明的一些具体实施例中，将聚谷氨酸种子培养液加入发酵培养基中，聚谷氨酸种子培养液的加入量为5v％，ph7.0，培养温度30±0.5℃，置于摇床上，以200rmp的转速振荡培养72h，获得聚谷氨酸发酵液。
根据本发明的一些实施方式，本发明所涉及的生产γ-聚谷氨酸的方法还包括在步骤e之后谷氨酸分离纯化的步骤f，其包括：
步骤s1，对聚谷氨酸发酵液进行菌体分离处理，获得聚谷氨酸发酵液的上清液；
步骤s2，对聚谷氨酸发酵液的上清液进行沉淀处理，获得聚谷氨酸粗沉淀物；
步骤s3，对聚谷氨酸粗沉淀物进行除杂处理，获得聚谷氨酸除杂沉淀物；
步骤s4，对聚谷氨酸除杂沉淀物进行冷冻干燥，获得聚谷氨酸纯品。
在本发明的一些优选实施例中，在步骤s1中，采用离心处理的方式进行菌体分离处理，且离心处理的条件为：温度为4-6℃，转速为8000-12000rpm，时间为20-40min。
在本发明的一些具体优选的实施例中，在步骤s1中，向聚谷氨酸发酵液中加入0.5％(w/v)的硅藻土，4℃，8000rpm，离心30min，获得聚谷氨酸发酵液的上清液。
在本发明的另一些优选实施例中，在步骤s2中，采用醇沉法对聚谷氨酸发酵液的上清液进行沉淀处理。
在本发明的一些具体优选的实施例中，在步骤s2中，按照1:5(v/v)比例向聚谷氨酸发酵液的上清液中加入无水乙醇，醇沉两次，聚谷氨酸粗沉淀物。
在本发明的又一些优选实施例中，在步骤s3中，采用透析和/或超滤醇等方法对聚谷氨酸粗沉淀物进行除杂处理，获得聚谷氨酸除杂沉淀物。
本发明中所述用语“700葡萄糖流加至140”是指用浓度为700g/l的葡萄糖溶液流加，发酵结束时发酵液总糖量为140g/l；类似地，所述用语“700葡萄糖流加至70”是指用浓度为700g/l的葡萄糖溶液流加，发酵结束时发酵液总糖量为70g/l。
本发明中所述“水”一词，在没有特别限定或说明的情况下是指去离子水或蒸馏水。
本发明中采用gpc-20a凝胶色谱仪(岛津，日本)通过gpc法(高效液相色谱法)检测产物的分子量，标准品为葡聚糖。
实施例
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：利用谷氨酸发酵液生产聚谷氨酸：
(1)谷氨酸棒杆菌种子液发酵：
菌种来自中国工业微生物菌种保藏中心(cicc)，保藏编号为：ciccno.23707。
种子培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
该种子培养基的ph值为7.0。
250ml三角瓶内装50ml种子培养基，接种活化后的斜面菌种一环，温度30℃转速175r/min，摇床培养12h，获得谷氨酸发酵菌种的种子培养液。
经检测，该种子培养液中种的菌落形成单位(cfu)为27×108/ml。
(2)谷氨酸发酵：
所述谷氨酸发酵培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
该谷氨酸发酵培养基的ph值为7.0。
种子液接种量为5％，温度30℃转速300r/min，通气量3.5l/(l×min)，培养48h。得到118g/l谷氨酸发酵液。
(3)谷氨酸发酵液处理：
向谷氨酸发酵液中加入0.5％(w/v)的硅藻土，4℃，8000rpm离心30min。离心分离后稀释至60g/l，获得谷氨酸发酵稀释液。
(4)枯草芽孢杆菌种子液发酵：
菌种来自中国工业微生物菌种保藏中心(cicc)，保藏编号为：ciccno.20643。
所述种子培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
该种子培养基的ph值为7.0。
250ml三角瓶内装50ml种子培养基，接种活化后的斜面菌种一环，温度30℃转速175r/min，摇床培养16h，获得聚谷氨酸种子培养液。
(5)聚谷氨酸发酵：
聚谷氨酸发酵培养基以1l水计，包括在1l水中的以下组分：
该聚谷氨酸发酵培养基的ph值为7.0。
向第(3)步获得的谷氨酸发酵液稀释液中按上述浓度加入各类物质。种子液接种量为5％，温度30℃转速200r/min，培养72h。得到46g/l聚谷氨酸发酵液。经分离纯化后，所制得的聚谷氨酸的产量为35-39g/l，产率为58-63％，分子量为800-850kda。
实施例2：
实施例2采用与实施例1相同的方法制备生产聚谷氨酸，所不同的是，在步骤(3)中，离心分离后稀释至50g/l。所制得的聚谷氨酸的产量为33-36g/l，产率为66-72％，分子量为800-830kda。
实施例3：
实施例2采用与实施例1相同的方法制备生产聚谷氨酸，所不同的是，在步骤(3)中，离心分离后稀释至63.6g/l。所制得的聚谷氨酸的产量为39-45g/l，产率为61-71％，分子量为850-870kda。
实施例4：
实施例4采用与实施例1相同的方法制备生产聚谷氨酸，所不同的是，在步骤(3)中，离心分离后稀释至70g/l。所制得的聚谷氨酸的产量为39-42g/l，产率为56-60％，分子量为830-870kda。
通过上述实施例可以看出采用谷氨酸发酵液耦合发酵相比采用谷氨酸粉末发酵，所得聚谷氨酸的产量和分子量均无明显下降。而采用发酵液发酵省去谷氨酸分离成本并明显节约用水。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。