本发明属于dna提取技术领域，尤其涉及一种福尔马林浸泡组织dna提取试剂盒及提取方法。
背景技术：
近年来，世界范围内癌症的发病率越来越高，而肿瘤的发生大都为多个基因突变的结果。与传统一代测序相比，二代测序(next-generationsequencing，ngs)是一种能够同时检测多个基因的测序技术。二代测序的快速发展为肿瘤的个性化诊断和精准治疗带来了福音，极大地提高了癌症患者的生命质量。但是，这些大规模基因检测的首要条件是获得较好质量的dna样本。肿瘤基因检测最直接的对象是患者组织标本，但由于新鲜癌组织样本取样与运输均比较困难，且长时间保存后，样本dna的降解有可能影响基因检测的结果，并最终影响癌症患者的诊断。石蜡包埋组织(formalin-fixedparaffin-embedded，ffpe)常规保存于医院病理科，但受切片和组织处理的影响，通常难以获得高质量的dna。因此，石蜡包埋组织从质和量上均难以满足大规模基因检测的需要。一般来说，医生在进行外科手术后，会将样本保存在福尔马林(10％中性甲醛)中，这些样本成为癌症病人个体化精准诊疗的重要dna来源。但是，由于福尔马林在固定dna的同时，使得细胞膜以及核膜变得难以破裂，阻止了dna和rna的释放，而且还会引起dna与蛋白质或其他核酸有不同程度的交联作用，提取dna时，交联作用的不完全逆转会影响dna测序或qpcr等后续实验。目前常用的方法主要包括长时间蛋白酶k消化法及机械破碎结合蛋白酶k消化法等。目前这些方法的提取时间较长，不能满足临床快速检测的需求，也不能很好的破碎细胞，解除核酸-蛋白质交联作用，因此难以获得高质量的dna。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够快速、高质量的提取福尔马林浸泡组织dna的提取试剂盒及提取方法
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种福尔马林浸泡组织dna提取试剂盒，包括以下组分：sds缓冲液、结合缓冲液、蛋白酶k、dna纯化磁珠、第一洗液、第二洗液和洗脱液；所述sds缓冲液的浓度为0.03～0.04mol/l；所述结合缓冲液包括3.0～3.5mol/lguhcl,0.5～1.0mol/lnacl,0.01～0.02mol/lsds，0.08～0.15mol/ltritonx-100，1.25～1.30mol/ledta和0.8～1.2mol/ltris-hcl；所述第一洗液包括0.60～0.65mol/lguhcl,0.40～0.50mol/lnacl,和8.0～8.5mmol/ltween20；所述第二洗液包括0.8～1.2mol/ltris和体积分数为20～30％乙醇；所述洗脱液为0.008～0.012mol/ltris溶液。
优选的，所述sds缓冲液的浓度为0.035mol/l；所述结合缓冲液包括3.3mol/lguhcl,0.75mol/lnacl,0.014mol/lsds，0.11mol/ltritonx-100，1.28mol/ledta和1.0mol/ltris-hcl；所述第一洗液包括0.63mol/lguhcl,0.45mol/lnacl,和8.22mmol/ltween20；所述第二洗液包括1.0mol/ltris和体积分数为26％乙醇；所述洗脱液为0.01mol/ltris溶液。
优选的，还包括pbs缓冲液和异丙醇。
本发明还提供了一种利用所述试剂盒提取福尔马林浸泡组织dna的方法，包括以下步骤：
1)将福尔马林浸泡组织与sds缓冲液混合后超声破碎获得裂解液；
2)将所述裂解液与蛋白酶k混合后，54℃～58℃消化50～70min获得消化液；
3)将所述消化液于78℃～82℃二次消化40～80min，冷却、固液分离收集液相组分为待提取液；
4)将所述待提取液、pbs缓冲液、结合缓冲液、dna纯化磁珠和异丙醇混合，于54～56℃加热10～15min后，磁分离收集结合dna的磁珠；
5)依次用第一洗液和第二洗液漂洗所述结合dna的磁珠；所述漂洗结束后，将漂洗后的结合dna的磁珠进行3～5min的自然风干获得干燥磁珠；
6)将所述干燥磁珠与洗脱液混合于54～56℃加热8～12min后，磁分离，收集液相组分即为提取获得的福尔马林浸泡组织dna。
优选的，所述福尔马林浸泡组织为直径0.8～1.2mm的颗粒状；所述福尔马林浸泡组织与sds缓冲液的质量体积比为(0.3～1)g:10ml。
优选的，所述超声破碎的负载比为18～22％；所述超声破碎的瞬间最大功率为70～80w；所述超声破碎的每个脉冲的循环数为180～220；所述超声破碎的时间为120～360s；所述超声破碎的温度为18～26℃。
优选的，所述裂解液与蛋白酶k的体积比为(4～6)：1。
优选的，所述待提取液、pbs缓冲液、结合缓冲液、dna纯化磁珠和异丙醇的体积比优选为(100～140)：(350～450)：(450～550)：(80～160)：(35～45)。
优选的，所述第一洗液与dna纯化磁珠的体积比为15：(2～4)；所述第二洗液与dna纯化磁珠的体积比为15：(2～4)。
优选的，所述洗脱液与dna纯化磁珠的体积比为5：(4～8)。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明所述福尔马林浸泡组织dna提取试剂盒及提取方法，能够实现对福尔马林浸泡组织dna的提取，提取获得的dna质量好，回收率高。
本发明所述的福尔马林浸泡组织dna提取方法，利用超声破碎细胞，超声破碎的原理是利用超声波推动介质，使液体中压力变化而形成无数气泡并迅速内爆，产生的激能将物体打散从而达到破碎的目的；超声破碎能够在很短的时间内帮助破碎细胞膜，将胞内dna，rna，蛋白质等释放出来。
本发明所述的福尔马林浸泡组织dna提取方法，通过两步蛋白酶k消化逆转核酸-蛋白质的交联作用，能够更好的释放dna。本发明中所述dna纯化磁珠能够回收所有dna片段，提高dna回收率；本发明中第一洗液和第二洗液多次漂洗结合dna的磁珠，将多余杂质清洗掉，提取高质量的基因组dna。
附图说明
图1为不同超声时间对dna提取总量的影响；
图2为不同超声时间dna2100图；
图3为不同超声温度对dna提取总量的影响
图4为不同超声温度dna2100图；
图5为不同起始量对dna提取总量的影响；
图6为不同起始量dna2100图；
图7为不同提取试剂盒对dna提取总量的影响；
图8为不同试剂盒dna2100图；
图9为小鼠肺和肝组织dna2100图。
具体实施方式
本发明提供了一种福尔马林浸泡组织dna提取试剂盒，包括以下组分：sds缓冲液、结合缓冲液、蛋白酶k、dna纯化磁珠、第一洗液、第二洗液和洗脱液；所述sds缓冲液的浓度为0.03～0.04mol/l；所述结合缓冲液包括3.0～3.5mol/lguhcl,0.5～1.0mol/lnacl,0.01～0.02mol/lsds，0.08～0.15mol/ltritonx-100，1.25～1.30mol/ledta和0.8～1.2mol/ltris-hcl；所述第一洗液包括0.60～0.65mol/lguhcl,0.40～0.50mol/lnacl,和8.0～8.5mmol/ltween20；所述第二洗液包括0.8～1.2mol/ltris和体积分数为20～30％乙醇；所述洗脱液为0.008～0.012mol/ltris溶液。
在本发明中，所述试剂盒包括sds缓冲液，所述sds缓冲液的浓度优选为0.032～0.038mol/l，更优选为0.035mol/l；本发明中，所述sds缓冲液的溶剂优选为tris-hcl，所述tris-hcl的ph值优选为8.1；本发明中所述sds缓冲液的作用为裂解细胞。
本发明中，所述试剂盒包括结合缓冲液，在本发明中，所述结合缓冲液包括3.0～3.5mol/lguhcl,0.5～1.0mol/lnacl,0.01～0.02mol/lsds，0.08～0.15mol/ltritonx-100，1.25～1.30mol/ledta和0.8～1.2mol/ltris-hcl；优选的包括3.3mol/lguhcl,0.75mol/lnacl,0.014mol/lsds，0.11mol/ltritonx-100，1.28mol/ledta和1.0mol/ltris-hcl。本发明中，所述结合缓冲液的作用是促进dna与dna纯化磁珠结合。
本发明中所述试剂盒还包括蛋白酶k，本发明所述蛋白酶k的来源没有特殊限定，采用市售蛋白酶k即可。本发明中，所述蛋白酶k的活力优选为500～700mau/ml，更优选为550～650mau/ml，最优选为600mau/ml。在本发明中，所述蛋白酶k的作用为消化细胞裂解液中的蛋白质；同时逆转核酸-蛋白质的交联作用，使dna充分释放。
在本发明中，所述试剂盒还包括dna纯化磁珠，本发明对所述dna纯化磁珠的来源没有特殊限定，采用市售的dna纯化磁珠即可。在本发明具体实施过程中，所述dna纯化磁珠为商业化的dna纯化磁珠。本发明中所述dna纯化磁珠的作用为与释放出的dna结合。
本发明中，所述试剂盒还包括第一洗液和第二洗液，所述第一洗液包括0.60～0.65mol/lguhcl，0.40～0.50mol/lnacl,和8.0～8.5mmol/ltween20，优选的包括0.63mol/lguhcl，0.45mol/lnacl和8.22mmol/ltween20。所述第二洗液包括0.8～1.2mol/ltris和体积分数为20～30％乙醇，优选的包括1.0mol/ltris和体积分数为26％乙醇。本发明中，所述第一洗液和第二洗液的作用是将磁珠上多余杂质清洗掉，提高提取的dna的质量。
本发明中，所述试剂盒还包括洗脱液，所述洗脱液为0.008～0.012mol/ltris溶液，优选为0.009～0.011mol/l，更优选为0.010mol/l。本发明中所述洗脱液的作用是将结合在磁珠上的dna洗脱下来。
本发明中，所述试剂盒优选的还包括pbs缓冲液，所述pbs缓冲液的浓度优选为0.01mol/l，ph值优选为7.4；所述pbs缓冲液的作用为调节ph值在一定范围内；本发明所述试剂盒优选的还包括异丙醇，本发明中所述异丙醇优选为分析纯的异丙醇，所述异丙醇的作用为促进dna的析出。
本发明中所述试剂盒的一个优选方案为包括0.035mol/lsds缓冲液、结合缓冲液(包括3.3mol/lguhcl,0.75mol/lnacl,0.014mol/lsds，0.11mol/ltritonx-100，1.28mol/ledta和1mol/ltris-hcl)、第一洗液(包括.63mol/lguhcl,0.45mol/lnacl和8.2mmol/ltween20)、第二洗液(包括1mol/ltris和体积分数为26％乙醇)和洗脱液(0.01mol/ltris)。
本发明还提供了一种利用所述试剂盒提取福尔马林浸泡组织dna的方法，包括以下步骤：1)将福尔马林浸泡组织与sds缓冲液混合后超声破碎获得裂解液；2)将所述裂解液与蛋白酶k混合后，54℃～58℃消化50～70min获得消化液；3)将所述消化液于78℃～82℃二次消化40～80min，冷却、固液分离收集液相组分为待提取液；4)将所述待提取液、pbs缓冲液、结合缓冲液、dna纯化磁珠和异丙醇混合，于54～56℃加热10～15min后，磁分离收集结合dna的磁珠；5)依次用第一洗液和第二洗液漂洗结合dna的磁珠；所述漂洗结束后，将漂洗后的结合dna的磁珠进行3～5min的自然风干获得干燥磁珠；6)将所述干燥磁珠与洗脱液混合于54～56℃加热8～12min后，磁分离，收集液相组分即为提取获得的福尔马林浸泡组织dna。
本发明将福尔马林浸泡组织与sds缓冲液混合后超声破碎获得裂解液。在本发明中，所述福尔马林浸泡组织优选为来源于人体或动物体的病变组织；本发明中所述福尔马林优选的医用福尔马林溶液，用于保存病变组织样本，具体的可为质量百分含量为10％中性甲醛。在本发明中所述福尔马林浸泡组织在使用前优选的进行切碎处理，本发明对所述切碎的工具和方法没有特殊限定；本发明中所述切碎后的福尔马林浸泡组织优选为直径0.8～1.2mm的颗粒状，更优选为直径1.0mm的颗粒状；本发明中在获得福尔马林浸泡组织颗粒后，将所述福尔马林浸泡组织与sds缓冲液混合；所述福尔马林浸泡组织与sds缓冲液的质量体积比优选为(0.2～1)g:10ml，更优选为(0.4～0.8)g:10ml。本发明在将所述福尔马林浸泡组织与sds缓冲液混合后，对混合液进行超声破碎获得裂解液。在本发明中，所述超声破碎的的dutyfactor优选为18～22％，更优选为20％；所述超声破碎的peakincidentpower优选为70～80w，更优选为75w；所述超声破碎的cyclesperburst优选为180～220，更优选为200；所述超声破碎的时间优选为120～360s，更优选为200～280s，最优选为240s；所述超声破碎的温度优选为18～26℃，更优选为19～24℃，最优选为20℃。在本发明中所述福尔马林浸泡组织与sds缓冲液混合后进行超声破碎，利用超声破碎细胞，能够在很短的时间内帮助破碎细胞膜，将胞内dna，rna，蛋白质等释放出来。
本发明在获得所述裂解液后，将所述裂解液与蛋白酶k混合后，54℃～58℃消化50～70min获得消化液。在本发明中所述裂解液与蛋白酶k的体积比优选为(4～6)：1，更优选为5:1。在本发明中所述消化的温度优选为55～57℃，更优选为56℃；所述消化的时间优选为55～65min，更优选为58～62min。在本发明中所述消化的目的是溶解蛋白，释放细胞中的dna。
本发明在获得所述消化液后，将所述消化液于78℃～82℃二次消化40～80min，冷却、固液分离收集液相组分为待提取液。在本发明中，所述二次消化的温度优选的为80℃，所述二次消化的时间优选为45～75min，更优选为55～65min。在本发明中所述二次消化的作用是使蛋白酶k进一步逆转核酸-蛋白质的交联作用，充分释放dna。本发明在所述二次消化后，进行自然冷却，然后将所述二次消化后的液体进行固液分离，收集液相组分为待提取液。在本发明中，所述固液分离的方法优选为离心，所述离心的转速优选为12000～18000rpm，更优选为15000rpm；所述离心的时间优选为3～8min，更优选为5min。
本发明在获得所述待提取液后，将所述待提取液、pbs缓冲液、结合缓冲液、dna纯化磁珠和异丙醇混合，于54～56℃加热10～15min后，磁分离收集结合dna的磁珠。在本发明中，所述待提取液优选的先与pbs缓冲液混合，然后再与结合缓冲液、dna纯化磁珠和异丙醇混合。在本发明中，所述待提取液、pbs缓冲液、结合缓冲液、dna纯化磁珠和异丙醇的体积比优选为(100～140)：(350～450)：(450～550)：(80～160)：(35～45)，更优选为(110～130)：(380～420)：(480～520)：(100～120)：(38～42)，最优选为120:400:500:110:40。本发明在所述混合后，将混合液于54～56℃加热10～15min后，磁分离收集结合dna的磁珠。在本发明中所述加热的温度优选为55℃，所述加热的时间优选为11～14min，更优选为12～13min。在本发明中，所述磁分离优选的利用磁分离架进行，所述磁分离的时间优选为1～5min，更优选为2min。本发明在所述磁分离结束后，优选的弃去上清，收集结合dna的磁珠。
本发明在获得结合dna的磁珠后，依次用第一洗液和第二洗液漂洗结合dna的磁珠。在本发明中，所述第一洗液与dna纯化磁珠的体积比优选为15：(2～4)，更优选为15：3；所述第二洗液与dna纯化磁珠的体积比为15：(2～4)，更优选为15：3。在本发明具体实施过程中，优选的用第一洗液漂洗结合dna的磁珠2～3次后，再用第二洗液漂洗结合dna的磁珠2～3次。在本发明中，所述漂洗过程优选的用移液器缓慢吹打磁珠与第一洗液或第二洗液的混合液8～15次，使磁珠与第一洗液或第二洗液充分混匀；室温放置1min，置于磁性分离架上静置2min，弃上清。本发明在所述漂洗结束后，将漂洗后的结合dna的磁珠进行3～5min的自然风干获得干燥磁珠，在本发明中所述自然风干优选的至磁珠表面无明显光泽停止，本发明中所述干燥时间不宜过长，以防止磁珠干燥过度，dna无法洗脱下来。
本发明在获得干燥磁珠后，将所述干燥磁珠与洗脱液混合于54～56℃加热8～12min后，磁分离，收集液相组分即为提取获得的福尔马林浸泡组织dna。在本发明中，所述洗脱液的体积与所述dna纯化磁珠的体积比优选为5：(4～8)，更优选为5：(5～7)。本发明中所述磁分离的方法和步骤与上述磁分离一致，在此不再赘述。
通过本发明所述方法提取获得的福尔马林浸泡组织dna浓度高，质量好，能够应用于后续的pcr扩增测序、qpcr等试验。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
福尔马林浸泡组织dna提取试剂盒
1.sds缓冲液的配制：取1gsds，加入50mmtris-hcl(ph8.1)混匀，定容至100ml。
2.结合缓冲液的配制:称取31.84gguhcl，4.38gnacl，0.42gsds，70gtritonx-100，加入80ml超纯水，混匀，加入0.5mledta，5mltris-hcl，定容至100ml。
3.1.28mol/ledta的配制:称取18.61gedta至50ml烧杯中，并加入40ml超纯水。将烧杯置于磁力搅拌器上，边搅拌边加入naoh固体直至溶液变澄清，将ph调至8.0，定容至50ml。
4.1mol/ltris-hcl(ph8.1)溶液配制:称取12.11gtris至100ml烧杯中，并加入80ml超纯水使其完全溶解，用ph计测定ph，并用浓盐酸调节ph值。将溶液转移至100ml容量瓶中，加入纯化水定容至100ml。
5.第一洗液的配制：称取6gguhcl、2.63gnacl、1gtween20(8.2mmol/l)加超纯水定容至100ml。
6.第二洗液的配制:12.11gtris,加入60ml超纯水，混匀，加入26ml26％乙醇，用浓盐酸将溶液ph的调节至8.0，加入纯化水定容至100ml。
7.洗脱液的配制:1.2gtris,加入800ml超纯水，完全溶解后，滴加浓盐酸调节ph值至8.0。
实施例2
预处理
1.选取一例福尔马林浸泡过的癌症病人的肺组织，用18号穿刺针取组织，用手术刀片将组织切碎至直径为1mm的颗粒状，平均分成5份重量为4.2mg的样本。打开microtube的螺旋盖，加入100μlsdsbuffer，将切碎的组织加入到buffer中，拧紧盖子，分别编号1-5。
2.打开超声破碎仪，设置程序，在其他参数都相同的情况下，1-5号样本的破碎时间依次递增，分别为120s、180s、240s、300s、360s。1号和2号样本可看到有少量组织块存在，未完全均质化，其他三组均完全匀质化。超声破碎参数见表1。
表1超声破碎参数
3.打开盖子，把样品从microtube中吸到1.5mlep管中。
4.向样本中加入20μl蛋白酶k，混匀。
5.56℃孵育1h。
6.80℃孵育1h，室温冷却。
7.15000g，离心5min，取上清。
磁珠纯化dna
1.在上清液中加入400μl的1×pbs，混匀。
2.结合：加入500μl结合缓冲液，120μl的磁珠，40μl异丙醇，振荡混匀，整个体系于55℃加热10-15min，置于磁性架上静置2min，弃上清。
3.洗涤：加入600μl第一洗液，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分混匀。室温放置1min。置于磁性架上静置2min，弃上清。
4.重复步骤3。
5.加入600μl第二洗液，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分混匀。室温放置1min。置于磁性架上静置2min，弃上清。
6.重复步骤5，尽量除尽洗涤液。
7.干燥：保持离心管于磁力架上，打开盖子风干3～5min，至磁珠表面无明显光泽。
干燥时间不宜过长，以防止磁珠干燥过度。
8.洗脱：加入100μl洗脱液。将离心管置于55℃加热10min(期间颠倒混匀一次)。置于磁性架上静置2min，将上清液移至新的离心管，即为纯化得到的dna。
9.用qubit对样本进行定量，2100分析dna片段大小。
不同超声时间dna提取总量见表2。
表2不同超声时间dna提取总量结果
超声时间对dna提取总量的影响及dna2100图见图1和图2；图2中a-e代表超声时间分别为120s、180s、240s、300s、360s。
结论：超声时间为240s时，dna提取量最大，随着超声时间的增大，dna提取量反而减少，故240s为超声最适时间。
实施例3
1.选取一例福尔马林浸泡过的癌症病人的肺组织，用18号穿刺针取组织，用手术刀片将组织切碎至直径为1mm的颗粒状，平均分成5份重量为3.9mg的样本。打开microtube的螺旋盖，加入100μlsdsbuffer，将切碎的组织加入到buffer中，拧紧盖子，分别编号1-5。
2.打开超声破碎仪，设置程序破碎组织，在其他参数都相同的情况下，1-5号样本的破碎温度依次递增，分别为18℃、20℃、22℃、24℃、26℃。可以看到5组样本均完全匀质化。超声破碎参数见表3。
表3超声破碎参数
3.打开盖子，把样品从microtube中吸到1.5mlep管中。
4.向样本中加入20μl蛋白酶k，混匀。
5.56℃孵育1h。
6.80℃孵育1h，室温冷却。
7.15000g，离心5min，取上清。
磁珠纯化dna
1.在上述上清液中加入400μl的1×pbs，混匀。
2.结合：加入500μlbindingbuffer，120μl的磁珠，40μl异丙醇，振荡混匀，整个体系于55℃加热10-15min，置于磁性架上静置2min，弃上清。
3.洗涤：加入600μlwashingbufferi，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分混匀。室温放置1min。置于磁性架上静置2min，弃上清。
4.重复步骤3。
5.加入600μlwashingbufferii，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分混匀。
室温放置1min。置于磁性架上静置2min，弃上清。
6.重复步骤5，尽量除尽洗涤液。
7.干燥：保持离心管于磁力架上，打开盖子风干3～5min，至磁珠表面无明显光泽。
干燥时间不宜过长，以防止磁珠干燥过度。
8.洗脱：加入100μlelutionbuffer。将离心管置于55℃加热10min(期间颠倒混
匀一次)。置于磁性架上静置2min，将上清液移至新的离心管，即为纯化得到的dna。
9.用qubit对样本进行定量，2100分析dna片段大小。
不同超声温度的dna提取总量结果见表4。
表4不同超声温度的dna提取总量结果
超声温度对dna提取总量的影响及dna2100图见图3和图4；图4中a-e分别代表超声温度为18℃、20℃、22℃、24℃、26。
结论：当超声温度分别为18℃、20℃、22℃、24℃、26℃，dna提取量之间并无显著性差异，但在20℃时，dna产量略高，片段分布较为集中。
实施例4
预处理
1.选取一例福尔马林浸泡过的小鼠肺组织，用18号穿刺针取组织，用手术刀片将组织切碎至直径为1mm的颗粒状，分为重量为4mg、6mg、8mg、10mg的4份。打开microtube的螺旋盖，加入100μlsdsbuffer，将切碎的组织加入到buffer中，拧紧盖子，分别编号1-4。
2.使用超声破碎仪及以下程序破碎组织。1-3号样本均完全匀质化，4号可看到有少量组织块存在，未完全均质化。超声破碎参数见表5。
表5超声破碎参数
3.打开盖子，把样品从microtube中吸到1.5mlep管中。
4.向样本中加入20μl蛋白酶k，混匀。
5.56℃孵育1h。
6.80℃孵育1h，室温冷却。
7.15000g，离心5min，取上清。
磁珠纯化dna
1.在上述上清液中加入400μl的1×pbs，混匀。
2.结合：加入500μlbindingbuffer，120μl的磁珠，40μl异丙醇，振荡混匀，整个体系于55℃加热10-15min，置于磁性架上静置2min，弃上清。
3.洗涤：加入600μlwashingbufferi，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分混匀。室温放置1min。置于磁性架上静置2min，弃上清。
4.重复步骤3。
5.加入600μlwashingbufferii，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分混匀。
室温放置1min。置于磁性架上静置2min，弃上清。
6.重复步骤5，尽量除尽洗涤液。
7.干燥：保持离心管于磁力架上，打开盖子风干3～5min，至磁珠表面无明显光泽。
干燥时间不宜过长，以防止磁珠干燥过度，造成核酸难以洗脱。
8.洗脱：加入100μlelutionbuffer。将离心管置于55℃加热10min(期间颠倒混
匀一次)。置于磁性架上静置2min，将上清液移至新的离心管，即为纯化得到的dna。
9.用qubit对样本进行定量，2100分析dna片段大小。
不同起始量的dna提取总量结果见表6。
表6不同起始量的dna提取总量结果
起始量对dna提取总量的影响及dna2100图见图5和图6；a-d代表福尔马林浸泡组织起始量分别为4mg、6mg、8mg、10mg。结论：随着起始量的增加，dna浓度越高，8mg起始量时，浓度达到最大值。当起始量增加至10mg时，由于裂解不充分，dna浓度反而下降。
实施例5
预处理
1.选取一例福尔马林浸泡过的癌症病人的肝组织，用18号穿刺针取组织，用手术刀片将组织切碎至直径为1mm的颗粒状，平均分为2份，重量为4.6mg。分别编号1、2。
2.1号样本按照常规机械破碎，蛋白酶k消化法进行提取。对得到的dna进行qubit定量和2100片段大小分析。
3.2号样本使用超声破碎仪及以下程序破碎组织。破碎后的组织会匀质化。超声破碎参数见表7。
表7超声破碎的参数
4.打开盖子，把样品从microtube中吸到1.5mlep管中。
5.向样本中加入20μl蛋白酶k，混匀。
6.56℃孵育1h。
7.80℃孵育1h，室温冷却。
8.15000g，离心5min，取上清。
磁珠纯化dna
1.在上清液中加入400μl的1×pbs，混匀。
2.结合：加入500μlbindingbuffer，120μl的磁珠，40μl异丙醇，振荡混匀，整个体系于55℃加热10-15min，置于磁性架上静置2min，弃上清。
3.洗涤：加入600μlwashingbufferi，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分混匀。室温放置1min。置于磁性架上静置2min，弃上清。
4.重复步骤3。
5.加入600μlwashingbufferii，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分混匀。
室温放置1min。置于磁性架上静置2min，弃上清。
6.重复步骤5，尽量除尽洗涤液。
7.干燥：保持离心管于磁力架上，打开盖子风干3～5min，至磁珠表面无明显光泽。
干燥时间不宜过长，以防止磁珠干燥过度。
8.洗脱：加入100μlelutionbuffer。将离心管置于55℃加热10min(期间颠倒混
匀一次)。置于磁性架上静置2min，将上清液移至新的离心管，即为纯化得到的dna。
9.用qubit对样本进行定量，2100分析dna片段大小。
不同试剂盒的dna提取总量比较结果见表8。
表8不同试剂盒的dna提取总量结果比较
不同提取试剂盒对dna提取总量的影响及dna2100图见图7和图8；图8中a代表普通试剂盒，b代表本发明。本实施例中的普通试剂盒为市售浸提试剂盒。
结论：同样的样本分别用普通试剂盒和本发明提取，普通试剂盒dna浓度很低，且片段弥散。本发明提取的dna浓度很高，片段也很集中。
实施例6
预处理
1.选取一例福尔马林浸泡过的小鼠肺组织和肝组织，用18号穿刺针取组织，用手术刀片将组织切碎至直径为1mm的颗粒状，重量分别为5.4mg和4.9mg。打开microtube的螺旋盖，加入100μlsdsbuffer，将切碎的组织加入到buffer中，拧紧盖子，分别编号1、2。
2.1号样本按照常规机械破碎，蛋白酶k消化法进行提取。对得到的dna进行qubit定量和2100片段大小分析。
3.2号样本使用超声破碎仪及以下程序破碎组织。破碎后的组织会匀质化。超声破碎参数见表9。
表9超声破碎参数
4.打开盖子，把样品从microtube中吸到1.5mlep管中。
5.向样本中加入20μl蛋白酶k，混匀。
6.56℃孵育1h。
7.80℃孵育1h，室温冷却。
8.15000g，离心5min，取上清。
磁珠纯化dna
1.在上清液中加入400μl的1×pbs，混匀。
2.结合：加入500μlbindingbuffer，120μl的磁珠，40μl异丙醇，振荡混匀，整个体系于55℃加热10-15min，置于磁性架上静置2min，弃上清。
3.洗涤：加入600μlwashingbufferi，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分混匀。室温放置1min。置于磁性架上静置2min，弃上清。
4.重复步骤3。
5.加入600μlwashingbufferii，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分混匀。
室温放置1min。置于磁性架上静置2min，弃上清。
6.重复步骤5，尽量除尽洗涤液。
7.干燥：保持离心管于磁力架上，打开盖子风干3～5min，至磁珠表面无明显光泽。
干燥时间不宜过长，以防止磁珠干燥过度。
8.洗脱：加入100μlelutionbuffer。将离心管置于55℃加热10min(期间颠倒混
匀一次)。置于磁性架上静置2min，将上清液移至新的离心管，即为纯化得到的dna。
9.用qubit对样本进行定量，2100分析dna片段大小。
不同试剂盒的dna提取总量结果见表10。
表10不同试剂盒的dna提取总量结果
两种组织类型dna2100图见图9，其中a代表小鼠肝组织，b代表小鼠肺组织。结论：用本发明提取福尔马林浸泡过的小鼠肺和肝组织，dna浓度都很高，片段也很集中。
由上述实施例可知，本发明提供的福尔马林浸泡组织dna提取试剂盒及提取方法，能够实现对福尔马林浸泡组织dna的提取，提取获得的dna质量好，回收率高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。