一种小鼠胚胎干细胞单细胞融合方法与流程

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种小鼠胚胎干细胞单细胞融合方法。

背景技术：

细胞融合主要用于制备诊断试剂，治疗疾病和运载药物的单克隆抗体，近年来细胞融合也被应用于基础研究，例如周琪团队利用细胞融合技术产生具有胚胎干细胞特性的异种二倍体杂合干细胞，为进化生物学、发育生物学和遗传学等研究提供新的模型和工具。细胞融合对于基础研究至关重要，也具备重要的应用价值。细胞融合过程分为4个阶段：细胞间接触、细胞质膜融合、细胞质重组和遗传物质的选择。迄今为止细胞融合方法主要有三种，仙台病毒、电融合和聚乙二醇(peg)。但是目前主要利用聚乙二醇介导细胞融合，cowan利用5×10⁷个人的胚胎干细胞与5×10⁷个体细胞融合，融合效率仅为0.000004％，得到2个克隆。yu通过1.3×10⁷个人的干细胞和4.7×10⁷个骨髓前体细胞融合，效率也只有0.00067％，2010年hasegawa将融合效率提高到0.005％通过融合人成纤维细胞和人es，sumer在进行融合研究时，融合效率有了质的提升，将0.5×10⁶个小鼠es细胞与1×10⁶个小鼠胎儿成纤维细胞融合效率达0.77％，而0.5×10⁶个小鼠诱导干细胞(mips)和1x10⁶个小鼠胎儿成纤维细胞融合效率为1.74％。上述细胞融合方法中细胞融合的效率均较低。

技术实现要素：

针对目前细胞融合效率低的问题，本发明提供了一种小鼠胚胎干细胞单细胞融合方法，将小鼠胚胎干细胞经胰酶消化成单细胞后，利用细胞凝集素构建一对一的单细胞对，所述单细胞对在聚乙二醇的作用下进行融合培养后获得融合细胞。

所述融合方法具体包括如下步骤：

1)细胞培养：选择小鼠胚胎干细胞在es培养液中进行培养,获得小鼠胚胎干细胞细胞克隆；

2)单细胞融合：将小鼠胚胎干细胞细胞克隆经胰酶消化后获得单细胞，无血清的es培养液与细胞凝集素制备成小滴，所述小滴中细胞凝集素的终浓度为100μg/ml；所述单细胞在每个小滴中贴合构建成一对一的单细胞对，然后在聚乙二醇的作用下经融合培养获得融合细胞。

优选地，步骤1)所述的小鼠胚胎干细胞的培养是在饱和湿度、37℃、体积分数5％的co2、体积分数21％的o2的条件下进行的，每天更换es培养液，每2天用胰酶质量分数为0.25％的胰酶消化液消化处理后传代一次。

优选地，步骤1)所述es培养液的基础培养基为dmem，所述es培养液中还含有质量分数15％的胎牛血清、2mm谷氨酰胺、0.1mmβ-巯基乙醇、1000u/ml白细胞抑制因子、质量分数1％非必需氨基酸和质量分数1％双抗，所述各添加的成分浓度为其在es培养液中的终浓度，所述双抗是指同时含有青霉素和链霉素两种抗生素的试剂。

优选地，步骤2)所述无血清的es培养液的基础培养基为dmem，所述无血清的es培养液中还含有2mm谷氨酰胺、0.1mmβ巯基乙醇、1000u/ml白细胞抑制因子、质量分数1％非必需氨基酸、质量分数1％双抗、3μmchir99021和1μmpd0325901，所述各添加的成分浓度为其在无血清的es培养液中的终浓度，所述双抗是指同时含有青霉素和链霉素两种抗生素的试剂。

优选地，步骤2)所述融合培养前向每对单细胞对中加入1μl聚乙二醇体积分数为50％的聚乙二醇1500的水溶液，静置1min后转入融合培养液中培养。

优选地，步骤2)所述的胰酶消化是指每个小鼠胚胎干细胞克隆用20μl经37℃预热的胰酶质量分数为0.25％的胰酶消化液进行消化，条件为37℃消化1min，然后用与胰酶消化液等量的es培养液终止消化。

优选地，步骤2)所述融合培养所用的培养液为es培养液。

优选地，步骤2)所述融合培养时间为7天，7天后用胰酶质量分数为0.25％的胰酶消化液对融合培养后的细胞团进行消化，条件为37℃消化3min，并用与胰酶消化液等量的es培养液终止后进入传代培养。

优选地，步骤2)所述胰酶为trypleexpress酶。

有益效果

细胞融合具有多种应用价值，可被用于研究细胞的核质关系，揭示疾病发生的机制，动物细胞融合用于动物育种，生产单克隆抗体等。

本发明所述的单细胞融合方法，需要融合的细胞每种只需要40个，获得融合细胞的克隆数与传统方法1×10⁶获得的克隆数相近，其生物学特性与之前报道的传统方法获得的融合细胞一样，单细胞融合融合克隆效率达46.25％左右，对于细胞融合实验是一个质的突破。

单细胞融合方法的优势在于，高效获得融合细胞，细胞数目较少的细胞同样也可以高效的获得融合细胞；需要融合的细胞无需荧光标记，节省了融合实验的时间；融合细胞不需要进行流式筛选，这对于不能便捷的使用流式细胞仪的科研工作者更是一个大的吸引力。

附图说明

图1小鼠胚胎干细胞多能性检测，其中a为ap检测；b为核型检测；c为oct4、sox2、nanog免疫荧光检测；d为real-time分析oct4、sox2、nanog、rex1的表达，横坐标为待检测目的基因，纵坐标为基因相对表达量。

图2标记细胞系的获得，其中a为r1细胞系；b为r1-fd细胞系；c为r1细胞系；d为r1-fe细胞系。

图3单细胞融合，其中a为单细胞融合示意图；b为单细胞融合得到的融合细胞。

图4传统的细胞融合，其中a为正常细胞融合示意图；b为秋水仙素处理的r1细胞系进行流式分析，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数；c为流式筛选融合细胞系(筛选效率为：1.84％)横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数；d为正常细胞融合得到的融合细胞。

图5融合细胞鉴定，其中a为ap检测；b为拟胚体的形成；c为real-time分析融合细胞的oct4,sox2,nanog的表达；d为融合细胞分化能力检测，图示为个基因电泳片段的大小，sm22-a(中胚层),afp(内胚层)，ncam(外胚层)，mef为小鼠胎儿成纤维细胞；mmf为小鼠es细胞融合细胞。

具体实施方式

本发明所用的小鼠胚胎干细胞系r1，由哈尔滨医科大学组织胚胎学教研室提供，也可经商业化途径购买获得。

dmem培养液(dulbecco'smodifiedeaglemedium)购买自gibco，货号：12100-046；

dpbs(dulbecco'sphosphatebufferedsaline)，1l去离子水溶解dpbs粉末至终浓度为0.01m/l，过滤后4℃保存备用。购买自gibco，货号：21600-010；

胎牛血清(fbs)购买自bioind，货号：04-001-1a；

谷氨酰胺购买自sigma，货号：g8540-100g；

β巯基乙醇购买自gibco，货号：21985-023；

白细胞抑制因子购买自millipore，货号：lif1107；

非必需氨基酸购买自invitrogen，货号：11140-050；

2％fbs细胞培养液：质量分数2％fbs+质量分数98％dmem；

双抗是指同时含有青霉素和链霉素的试剂，购买自hyclone，货号：30-002-ci；

chir99021购买自stemgent，货号：04-0004；

pd0325901购买自stemgent，货号：04-0006；

细胞凝集素购买自sigma，货号：l1668；

胰酶消化液如无特殊说明，为动物来源的胰酶，购买自，货号：25200；

获得融合细胞后进行消化所用的胰酶为重组型胰酶tryple^tmexpress酶，购买自gibco，货号：12605-10；

fuw-egfp病毒载体：由东北农业大学动物胚胎工程实验室提供，也可经商业化购买；

fuw-dsred病毒载体：由东北农业大学动物胚胎工程实验室提供，也可经商业化购买；

质粒提取试剂盒为tianprepminiplasmidkit，购买自天根生化科技(北京)有限公司，货号：dp103；

病毒转染用试剂盒为lipofectamineltxandplus，购买自invitrogen，货号：15338-100；

293t细胞由哈尔滨医科大学组织胚胎学教研室提供，也可经商业化途径购买；

石蜡油购买自fisherchemical，型号为nf/fcc；

病毒浓缩柱购买自millipore，货号：ufc910096；

dyecycle^tmgreenstain购买自invitrogen，货号：v35004；

细胞分选仪购买自bd公司，型号：bdfacsmelody^tm；

bcip/nbt碱性磷酸酯酶显色试剂盒购买自碧云天，货号：c3206；

其他试剂以及所用的仪器设备、耗材，如离心机、荧光显微镜，玻璃管、口吸管、培养皿、用于细胞培养的6孔板、96孔板等均可通过商业化途径购买获得。

实施例1.小鼠胚胎干细胞单细胞融合方法。

下面结合图1具体描述本发明所述的单细胞融合的方法。

1.细胞培养

为保证融合细胞生物学特性研究具有可比性，对融合实验使用的小鼠胚胎干细胞系r1首先进行多能性鉴定。

①碱性磷酸酶活性检测

获得的融合细胞经dpbs清洗3次，质量分数为4％的多聚甲醛固定克隆90s，弃掉多聚甲醛，dpbs洗涤3次，根据bcip/nbt碱性磷酸酯酶显色试剂盒进行检测，克隆显色呈紫色状态即可停止显色。去除染色液，dpbs清洗3次，镜下观察照相。

②拟胚体形成情况检测

使用tryple对融合细胞团消化3min，细胞分离成小的团块后接种在无基质包被的平皿中，在含有质量分数为15％的胎牛血清fbs的es培养液中培养7-10天。

③rna提取，反转录，real-timepcr

利用rna纯化试剂盒(purelinkrnaminikit，life)对融合细胞的rna进行提取。

利用反转录highcapacitycdnareversetranscriptionkits(abi)试剂盒进行反转录。

real-timepcr利用sybrpremixextaq(takara)进行基因定量检测，所述定量检测用的引物序列如下表1所示：

表1引物序列统计表

结果表明：

小鼠胚胎干细胞r1呈碱性磷酸酶(ap)阳性(图1中a所示)；具有40条染色体，核型正常(图1中b所示)；利用免疫荧光对r1细胞的多能性标记进行检测，结果显示，该细胞系在蛋白水平表达多能性基因oct4，sox2和nanog(图1中c所示)；real-time结果显示r1细胞在mrna水平表达多能性基因oct4，sox2，nanog和rex1(图1中d所示)。

然后，将小鼠胚胎干细胞系r1接种在含饲养层细胞的培养板(每管冻存的细胞可接种在1个6孔板中)，培养液为es培养液，以dmem为基础培养基，所述es培养液中含有质量分数15％胎牛血清、2mm谷氨酰胺、0.1mmβ巯基乙醇、1000u/ml白细胞抑制因子、质量分数1％非必须氨基酸和质量分数1％双抗，其中的青霉素的工作浓度为100u/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml；所述各添加的成分浓度为其在es培养液中的终浓度，培养条件为饱和湿度、37℃、5％co2(体积分数)、21％o2(体积分数)。每天换液，每2天用500μl质量分数为0.25％的胰酶消化液消化后，传代一次。

2.单细胞融合

为方便观察获得融合细胞，我们对r1细胞系进行了荧光蛋白标记。具体方法如下：分别将含有fuw-egfp和fuw-dsred质粒载体的大肠杆菌jm109，利用hipureplasmidmaxiprepkit进行质粒的大量提取，利用lipofectamineltxandplus转染试剂盒，转染293t细胞，转染12h后更换15ml2％fbs培养液，换液后继续培养，在24h和48h分别收集病毒。收集后的病毒用100.000nmwl的病毒浓缩柱进行浓缩，保存在-80℃备用。每次浓缩病毒后，病毒感染效率不同，需要和对照组比较筛选出最佳使用剂量。

将小鼠胚胎干细胞系r1细胞接种到24孔板中进行传代培养，将冻存的fuw-egfp和fuw-dsred病毒分别加入到24孔板中，在48小时后，荧光显微镜下分别挑取带有红色荧光的克隆r1-fd和绿色荧光的克隆r1-fe进行传代，最终得到r1-fd细胞系(如图2中a、b所示)和r1-fe细胞系(如图2中c、d所示)。

单细胞融合流程如图3中a所示，具体方法如下所述：

玻璃管(烧成尖状)挑取r1-fd克隆3个和r1-fe克隆3个，将上述的2种克隆，分别用口吸管转移至含质量分数为0.25％的胰酶(经37℃预热)的20μl的胰酶消化液中，37℃1min，然后加20μl的es培养液终止消化，细胞被消化成单细胞，使用无血清的es培养液，所述无血清的es培养液的基础培养基为dmem，所述无血清的es培养液中还含有质量分数为15％的胎牛血清、2mm谷氨酰胺、0.1mmβ巯基乙醇、1000u/ml白细胞抑制因子、质量分数1％非必需氨基酸、质量分数1％双抗,其中的青霉素的工作浓度为100u/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml、3μmchir99021和1μmpd0325901，所述各添加的成分浓度为其在无血清的es培养液的终浓度。加入细胞凝集素，所述细胞凝集素终浓度100μg/ml，获得无血清的es培养液与细胞凝集素的混合液，在35mm培养皿中，制成2μl小滴30个，用石蜡油覆盖，然后将r1-fd单个细胞加入1个小滴中，再将r1-fe单个细胞贴合r1-fd细胞，构建成单细胞对，20min后，将2个贴附在一起的细胞吸入至玻璃管，然后再吸入1μl聚乙二醇体积分数为50％聚乙二醇peg1500水溶液中，静置1min后，将玻璃管中的单细胞对以及聚乙二醇peg1500水溶液加至96孔板中，进行融合培养。其余各小滴、r1-fd单个细胞、r1-fe单个细胞，重复上述融合处理过程。

经培养获得的融合细胞，如图3中b所示，最左侧图可见融合细胞形态不是mes(小鼠胚胎干细胞)的隆起状，而趋于扁平状；中间及右侧图示分别为荧光显微镜下检测到融合细胞中绿色荧光与红色荧光，表明小鼠胚胎干细胞单细胞融合成功。

在上述单细胞融合过程中，如不加荧光标记，可通过细胞染色体倍型分析方法对获得融合细胞进行鉴定。

融合细胞培养7天后可进行传代，用trypleexpress酶37℃消化3min，用与酶等量的es培养液终止消化，然后将细胞培养在含有饲养层细胞的24孔板中，在饱和湿度、37℃、体积分数5％的co2、体积分数21％的o2的条件下，培养获得的融合细胞，所述融合细胞培养所使用的培养液为es培养液。

对比例1.传统细胞融合方法。

传统细胞融合的技术路线如图4中a所示。用dyecycle^tm染料对融合的细胞进行染色，6小时后进行流式筛选。选择秋水仙素处理的r1细胞作为流式筛选的对照组，对照组细胞停滞在有丝分裂中期，以此作为流式筛选参照。如图4中b所示，融合细胞经流式分选获得染色体倍型大于4n的细胞，即融合成功的细胞如图4中c所示。获得的融合细胞经培养获得细胞克隆，如图4中d所示，细胞呈团块生长且为隆起形状。

具体方法如下：将37℃预热胰酶质量分数为0.25％的胰酶消化液，1min消化小鼠胚胎干细胞，加同胰酶消化液等量的es培养液终止，1200g离心3min弃液，然后用500μles培养液重悬，细胞接种至提前铺有明胶的6孔板中，再加入2mles培养液，培养细胞至饲养层细胞完全清除，收集悬液，1200g离心3min，混合1×10⁸个r1-fd(感染了fuw-dsred病毒，表达红色荧光)细胞和1×10⁸个r1-fe(感染了fuw-egfp病毒，表达绿色荧光)细胞，1200g离心3min，dpbs洗一次，1200g离心3min，弃液加入1×sds，37℃孵育3min，1200g离心3min，弃液加提前37℃温育的1ml50％peg1500，37℃孵育1min，滴加10mldmem，1200g离心3min，细胞接种到含基质胶的6孔板培养6小时。收集悬液，1200g离心3min，0.01m磷酸盐缓冲液dpbs洗三次，细胞计数每1ml的1×10⁶个细胞加2μl的dyecycle^tmgreenstain，37℃孵育30min，利用bdfacsmelody^tm进行流式筛选，然后将细胞培养在含有饲养层细胞的24孔板中，培养后获得融合细胞，7天后传代，用trypleexpress酶37℃消化3min，用与酶等量的es培养液终止，融合细胞的培养液为es培养液。

所述流式筛选程序如下：

(1)上样前准备：体积分数为75％的乙醇，无菌水，dpbs；(2)在鞘液桶中加入3l体积分数为75％乙醇，盖好盖子后，摇晃鞘液桶；(3)连接机器；(4)打开软件，建立新的实验，上样，分析细胞并设置筛选门；(5)安装2支bd收集管其中加入500μldpbs；(6)筛选细胞；(7)断开鞘液桶，加入3ml无菌水，进行清洗；(8)最后使用清洗液，进行清洗；(10)关机。

细胞融合方法效率对比：

传统融合实验中需要2×10⁶个细胞，显著差异获得克隆34±4个(细胞呈团块生长且为隆起形状，既表达红色荧光也表达绿色荧光)；而本发明所述的单细胞融合方法仅需操作80个细胞，就能够获得克隆37±3个。对传统融合方法与本发明所述的单细胞融合方法克隆效率进行统计分析，p值＜0.01差异极显著。详细结果如表2。

表2融合数据统计表

同一列中的不同上标代表差异极显著(p<0.01)，n代表实验重复次数。

融合细胞的生物学特性检测：

本发明对获得的小鼠干细胞融合细胞其生物学特性与之前报道的传统方法获得的融合细胞一样，细胞形态与小鼠es具有很大的差异，细胞间的间隙较大，细胞不能密集生长。

经生物学特性检测，结果表明，ap表达呈阳性，如图5中a所示；融合细胞可以体外自发分化形成拟胚体如图5中b所示，具有向三胚层分化能力；荧光定量pcr检测融合细胞表达oct4、sox2、nanog，如图5中c所示，以小鼠胎儿成纤维细胞为对照，本发明获得的小鼠干细胞融合细胞表达sm22-a(中胚层marker)，afp(内胚层marker)，ncam(外胚层marker)如图5中d所示。综上，本发明获得的融合细胞具有多能性。

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