MSMEG_6171在调节耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性中的应用的制作方法

本发明生物技术领域，特别涉及msmeg_6171在调节耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性中的应用。

背景技术：

耻垢分枝杆菌(m.smegmatis)属于革兰阳性腐生菌，具有快速增长，无致病性，与结核分枝杆菌(m.tuberculosis)基因高度同源、细胞结构相似等特点，较多应用于分支杆菌感染及相关免疫学研究，是一种相对理想的实验模型。同时，其在非分枝杆菌感染及其他相关免疫研究中也有拓展性的应用。

耻垢分枝杆菌具有富含脂质的细胞壁，其组成成分复杂，功能也多样，是分枝杆菌抵御外界环境的压力，逃逸宿主免疫攻击重要屏障。耻垢分枝杆菌细胞壁由两部分组成：内层和外层。外层是由脂质和蛋白质组成的细胞壁的可溶组分，长链和短链脂肪酸镶嵌其中。内层由肽聚糖(pg)、阿拉伯半乳聚糖(ag)、分枝菌酸(ma)构成。研究发现，越来越多的蛋白参与到细胞壁的合成，这些蛋白通过参与脂肪酸酰基链的合成、糖肽脂(gpls)、肽的修饰以及细胞膜上各种合成酶的组装等以影响细胞壁的生成，从而影响细菌对药物的抵抗力。许多抗分枝杆菌药物专门用于对抗这种良好的保护屏障。

msmeg_6171是耻垢分枝杆菌中的一个功能未知的蛋白，msmeg_6171的氨基酸序列如seqidno.1所示，其编码基因如seqidno.2所示，msmeg_6171蛋白功能研究尚未有报道，其在结核分枝杆菌中的同源蛋白是rv3660c。2011年england.k的一项研究表明rv3660c过表达时可抑制隔膜生成而引起菌体纤丝化，该研究通过转录组学分析，发现过表达该蛋白可以引起一些细胞调控因子的mrna表达量发生显著变化，这些调控因子包括休眠调节子和一些被认为在适应性代谢中发挥作用的sigma因子，同时发现rv3660c缺失可以抵消上述调控因子的表达量变化，并导致菌体缩短。目前暂无msmeg_6171及其同源蛋白rv3660c对细菌的抗生素敏感性的调节作用的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供msmeg_6171在调节耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种调节耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性的方法，通过调节msmeg_6171表达量实现。

进一步地，抑制msmeg_6171表达增强耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性，促进msmeg_6171过表达减弱耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性。

进一步地，msmeg_6171表达量为msmeg_6171蛋白表达量。

进一步地，抗生素为作用于耻垢分枝杆菌细胞壁合成的抗生素。

进一步地，抗生素为万古霉素、头孢噻肟、头孢西丁和头孢吡啶中的任意一种或几种。

调节msmeg_6171表达量的试剂在制备调节耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性的试剂盒中的应用。

进一步地，使用抑制msmeg_6171表达的试剂制备增强耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性的试剂盒，使用促进msmeg_6171过表达的试剂制备减弱耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性的试剂盒。

进一步地，msmeg_6171表达量为msmeg_6171蛋白表达量。

进一步地，抗生素为作用于耻垢分枝杆菌细胞壁合成的抗生素。

进一步地，抗生素为万古霉素、头孢噻肟、头孢西丁和头孢吡啶中的任意一种或几种。

本发明的有益效果是：

本发明中公开了msmeg_6171与耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性之间的关系，具体地，抑制msmeg_6171表达增强耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性，促进msmeg_6171过表达减弱耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性。本发明为调节耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性提供了新的方法。

附图说明

图1为msmeg_6171基因的pcr产物琼脂糖电泳图；

图2为msmeg_6171过表达的耻垢分枝杆菌菌液pcr验证，1、2、3泳道均为验证阳性的菌株；

图3为msmeg_6171-3xflag融合蛋白表达的westernblot鉴定结果，泳道1：蛋白marker；泳道2：空载对照；泳道3：过表达重组菌株；

图4为msmeg_6171缺失的耻垢分枝杆菌pcr产物琼脂糖电泳图，泳道1：缺失菌株；泳道2：空载对照；m：d2000dnamarker；

图5为pulldown实验结果；

图6为荧光染色图，其中a为野生型耻垢分枝杆菌、b为msmeg_6171过表达的耻垢分枝杆菌、c为msmeg_6171缺失的耻垢分枝杆菌、d为回补菌株。

具体实施方式

下面将结合具体实施例进一步阐述本发明。

实施例1

利用分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pmv261-3xflag(newuseofbcgforrecombinantvaccines,nature,1991.351(6326):456-60；公众可从广东省结核病控制中心获得)表达msmeg_6171蛋白，获得过表达msmeg_6171的耻垢分枝杆菌。

一、构建msmeg_6171表达质粒

以耻垢分枝杆菌mycobacteriumtuberculosismc²155的基因组dna为模板，通过正向引物5’-agaattcatgccgtcgagtcgtaagg-3’(seqidno.3)和反向引物5’-taaaagcttccgccgcctcccgcacag-3’(seqidno.4)进行pcr扩增，获得msmeg_6171基因编码片段，凝胶电泳检测结果如图1所示，通过neb公司的ecori、hindiii和t4连接酶将msmeg_6171基因编码片段连到pmv261-3xflag载体，获得msmeg_6171-3xflag融合蛋白表达质粒pmv261-htpg-3xflag。将重组质粒测序，确认正确。

二、制备pmv261-msmeg_6171-3xflag耻垢分枝杆菌

(1)耻垢分枝杆菌mycobacteriumsmegmatismc²155菌株在含有0.5％甘油和0.05％吐温80的7h9液体培养基中37℃振荡培养3天，1％转接新鲜培养基，37℃振荡培养至对数期(od600约为0.6)，收集菌体，10％无菌甘油(去离子水配置)清洗菌体3次制备电转感受态。

(2)取感受态300μl分别加入10μl质粒(100ng/μl)pmv261-htpg-3xflag和pmv261-3xflag，转移至电转杯，设置电转化仪参数为2.5kv、25μf、1000ω，电击完成后加入800μl预冷的新鲜培养基，37℃振荡培养2h使细菌复苏。

(3)将复苏的细菌取1/3涂布含有kanamycin30μg/ml的7h10固体培养基，37℃静置培养3天，得到耻垢分枝杆菌重组菌pmv261-msmeg_6171-3xflag/mc²155和pmv261-3xflag/mc²155。

(4)挑取重组菌pmv261-msmeg_6171-3xflag/mc²155和pmv261-3xflag/mc²155单菌落，接种含有kanamycin30μg/ml、0.5％甘油和0.05％吐温80的7h9液体培养基，37℃振荡培养3天，吸取50μl菌液离心沉淀菌体；10μl去离子水重悬菌体，取1μl进行pcr反应，引物为构建msmeg_6171表达质粒使用的正向引物和反向引物，验证msmeg_6171基因是否成功导入耻垢分枝杆菌，结果如图2所示。

三、采用westernblot检测msmeg_6171-3xflag融合蛋白是否表达

取20μgpmv261-msmeg_6171-3xflag/mc²155细胞裂解液进行westernblot检测，结果如图3所示，可以得到明显的荧光信号，证明msmeg_6171-3xflag确实表达了。

实施例2

通过同源基因重组的方法构建msmeg_6171基因敲除菌株。

表1.同源基因重组相关的重组质粒

一、自杀性质粒的构建

(1)pcr扩增msmeg_6171上下游同源臂：由msmeg_6171基因及其上下游dna序列，设计引物6171-uf：5’-cccaagcttatgtagtcacgcatccggtcc-3’(seqidno.5)(下划线序列表示表示hindiii位点)，6171-ur：5’-gagtgcctcgtcgagacccggttcgtcgcatccgatcac-3’(seqidno.6)，利用m.smegmatis基因组dna为模板扩增得到msmeg_6171基因上游同源臂(up,855bp)。用6171-df：5’-gtgatcggatgcgacgaaccgggtctcgacgaggcactc-3’(seqidno.7)和6171-dr：5’-ttaattaacggtgttgagcgcggcg-3’(seqidno.8)(下划线序列表示表示paci位点)，利用m.smegmatis基因组dna为模板扩增得到msmeg_6171基因下游同源臂(down,849bp)。上下游同源臂片段分别纯化回收，利用overlappcr的方法，以上游同源臂和下游同源臂为模板，以6171-uf和6171-dr为引物扩增重叠片段。

(2)利用hindiii和paci酶切位点，将连接好的上下游同源臂插入p1nil载体，然后将pgoal19载体里的用于筛选的基因片段用paci酶切后回收，再将此片段连入含有同源臂的p1nil重组载体内。

(3)将自杀性质粒转入e.colitop10，pcr及测序验证，提质粒备用。

二、碱处理自杀性质粒

取少量的保存质粒测定其浓度，并根据其浓度取20μg左右的质粒，加ddh2o至100μl，然后加入100μl0.4mol/l的naoh。37℃，30min。加入20μl的3m醋酸钠后再加入140μl异丙醇，-80℃沉淀1h或过夜，离心弃上清，加700μl75％乙醇，离心弃上清，重复清洗一次。室温静置5min后，加7μlddh2o溶解。

三、筛选单交换菌株

将7μl碱处理后的质粒加入到350μl的感受态细胞中(注意：200μl感受态细胞所对应质粒体积不超过5μl)，37℃孵育10～20min，然后将菌液转入电转杯中。确认电转杯外壁上干净后，电击(电压2.5kv，电阻1000ω，电容25μf)，立即加入0.7ml的7h9液体培养基。将菌体吸出，置于50ml离心管中，补加7h9液体培养基至4ml(通常复苏所用培养基为感受态的体积的10倍)。37℃下振荡培养2～3天复苏。复苏后，6000rpm离心15min，取200μl培养基重悬菌体，涂布7h10平板(含oadc，50μg/ml潮霉素，50μg/ml卡那霉素，和50μg/mlxgal)，避光培养30～40天观察是否有蓝斑生成，若有，则表明单交换成功。

四、筛选双交换菌株

避光培养30～40天观察是否有蓝斑生成，若有，则表明单交换成功，挑蓝斑，于7h9液体培养基中培养。分别在4h、8h、12h、16h时取200μl涂7h10平板(含oadc，x-gal，2％sucrose)。37℃培养箱中避光培养2-3天，挑取白色菌落，于2ml7h9培养基中培养2天后进行pcr验证。

五、耻垢分枝杆菌msmeg_6171缺失菌株回补

(1)回补质粒为pmv361-msmeg_6171。

(2)结核分枝杆菌msmeg_6171缺失菌株感受态细胞的制备：参考上述耻垢分枝杆菌感受态细胞的制备。msmeg_6171缺失的耻垢分枝杆菌pcr鉴定结果如图4所示。

(3)感受态细胞的电击转化：参考上述转化步骤。

实施例3

野生型耻垢分枝杆菌、msmeg_6171缺失的耻垢分枝杆菌、回补菌株及msmeg_6171过表达的耻垢分枝杆菌对10种抗生素的mic检测。

利用稀释法检测msmeg_6171对抗生素的敏感性。将倍比稀释后不同浓度的抗生素溶液(利福平，异烟肼，链霉素，万古霉素，乙硫异烟胺，环丝氨酸，美罗培南，头孢羟唑，头孢西丁，头孢噻肟)分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中。第1至第11孔加药，每孔10μl，第12孔不加药作为生长对照，3个平行样品。将菌液稀释至0.5麦氏比浊度后，再用7h9液体培养基按1∶1000稀释后，向每孔中加90μl稀释后的菌液，密封后置37℃摇床孵育2～3h，能够抑制细菌生长的最低浓度即为mics。

通过10种不同抗生素的最小抑制浓度(mic)的测定结果可知，对所有细菌而言，异烟肼、利福平、链霉素、环丝氨酸均处于同一水平。msmeg_6171基因缺失后，耻垢分枝杆菌对万古霉素、头孢噻肟、头孢西丁和头孢吡啶的敏感性增强，对应的mic值减小；同时，msmeg_6171过表达的耻垢分枝杆菌对万古霉素、头孢噻肟、头孢西丁和头孢吡啶的敏感性减弱，对应的mic值增大。

实施例4

pulldown实验垂钓耻垢分枝杆菌中与msmeg_6171互作的蛋白，结果如图5所示，将差异条带酶解后通过质谱鉴定复合物中与msmeg_6171相互作用的蛋白质，通过对msmeg_6171相互作用蛋白的分析发现msmeg_6171与脂肪酸合成酶、甘油-3-磷酸脱氢酶等胞壁合成相关的酶存在相互作用，说明msmeg_6171作为蛋白复合物中的一员，参与到细菌细胞壁合成。

实施例5

荧光染色试验验证msmeg_6171是否会影响耻垢分枝杆菌的细胞核和隔膜的形成。

用bodipy标记的万古霉素和dapi染色后，用zeisslsm880荧光共聚焦显微镜进行观察，结果如图6所示。通过对野生型耻垢分枝杆菌、msmeg_6171过表达的耻垢分枝杆菌，msmeg_6171缺失的耻垢分枝杆菌及回补菌株的荧光染色发现，四种菌在体外培养下隔膜和细胞核的生成没有明显差异，说明msmeg_6171对耻垢分枝杆菌的隔膜和细胞核的生成没有影响。

sequencelisting

<110>广东省结核病控制中心

<120>msmeg_6171在调节耻垢分枝杆菌对抗生素敏感性中的应用

<130>2018.8.10

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>316

<212>prt

<213>msmeg_6171

<400>1

metproserserarglysalatrpleuseralaalaalavalleuleu

151015

aspalaseralaalaargargcysalaaspargglyleuproargarg

202530

aspargvalleuvalileglycysaspgluproglyproalaasptrp

354045

glnalaalailealavalglyalaglnhisvalvalthrleuproarg

505560

glnaspthraspleuvalalaalaleuservalvalaspgluglygly

65707580

glyhisargglyprovalvalalavalvalalaalalysglyglyala

859095

glyalaservalphealaalaalaleualaleuseralaproglyala

100105110

leuleuvalaspalaaspprotrpserglyglyileaspleuvalleu

115120125

glysergluaspglnproglyleuargtrpalaaspleualaleugln

130135140

glyglyargleuglytyrglyalaleuargaspalaleuproargarg

145150155160

glygluileservalleuserglyglyargalaglyvalaspilethr

165170175

alaalaalaleuhisalavalileaspalaglycysargglyalathr

180185190

leuvalvalcysaspvalproargargserthraspalaalagluala

195200205

alaleuglualaalaaspleuvalvalvalvalalaargalaaspval

210215220

argsercysalaalaalaalaalaalaglysertrpilealathrcys

225230235240

asnproasnileglyvalvalvalargglyproalaproglyglyleu

245250255

argalaalagluvalalaaspilevalaspleuproleuleualaser

260265270

metargproglnproglyleuaspglualaleugluargglyglyleu

275280285

argleuthrargargserproleualathralaalaargargvalleu

290295300

glyvalleualaglnhisprovalargglualaala

305310315

<210>2

<211>812

<212>dna

<213>msmeg_6171

<400>2

atgccgtcgagtcgtaaggcctggctgtccgcggcggccgtgctgctcgacgcgtcggcc60

gcgcggcggtgcgccgaccggggactgccgcgccgcgaccgggtgctcgtgatcggatgc120

gacgaaccgggtccggccgattggcaggccgcgatcgccgtcggtgcgcaacacgtcgtg180

acgctgccccgccaggacaccgatcttgtggcggcgctgtctgtcgtcgacgagggcggt240

ggacaccgcggaccggtggttgcggtggtcgcggcgaaaggcggcgccggggcatcggtg300

ttcgccgccgcgcttgccctgtcggcgccgggagcgttgctcgtcgacgccgacccgtgg360

agcggcggcatcgacctcgtgctcggcagtgaggatcagccgggtctgcggtgggcggat420

cttgcgctgcagggcggcaggctcgggtacggcgcgttgcgcgacgcgctgccgcgccgc480

ggcgagatcagtgtgctctcgggtggacgcgcgggcgtcgacatcaccgcggcggcactg540

cacgccgtgatcgacgcgggttgtcgcggcgcgactttggtggtctgcgacgtcccccgg600

cgcagcaccgacgcggccgaggccgcgctcgaggcagccgacctggtggtcgtggtcgcc660

cgcgccgatgtgcgttcgtgtgccgcggcagcggccgccggatcctggatcgccacgtgc720

aatcccaacatcggtgtggtggtgcgcggtccggcaccgggaggtctgcgtgccgccgag780

gtcgccgacatcgtcgacctgccgctgctggc812

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

agaattcatgccgtcgagtcgtaagg26

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

taaaagcttccgccgcctcccgcacag27

<210>5

<211>30

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

cccaagcttatgtagtcacgcatccggtcc30

<210>6

<211>39

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

gagtgcctcgtcgagacccggttcgtcgcatccgatcac39

<210>7

<211>39

<212>dna

<213>人工合成

<400>7

gtgatcggatgcgacgaaccgggtctcgacgaggcactc39

<210>8

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>8

ttaattaacggtgttgagcgcggcg25