一种人-15-羟基前列腺素脱氢酶过表达质粒的构建方法及其应用与流程

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种人-15-羟基前列腺素脱氢酶过表达质粒的构建方法及其应用。
背景技术：
：宫颈癌发病率及死亡率在全球女性癌症中分别位居第三及第四位(ca:acancerjournalforclinicians.2015；65(2):87-108)。宫颈癌发生的早期常无任何症状，不易被察觉，而晚期则伴有不规则的阴道流血、骨盆痛、性交痛等症状(vaccine.2012；30suppl5:f55-70；publichealthgenomics.2009；12(5-6):291-307.)。haraldzurhausen及其同事在宫颈癌组织中首次检测到hpv16，从而揭示了子宫颈hpv感染与宫颈癌之间的因果联系，为此，hausen在2008年被授予诺贝尔生理学或医学奖(internationaljournalofcancer.2012；131(10):2349-2359.)。流行病学上，高危型hpv的持续感染已被确定为宫颈癌发生的关键致病因子(natrevcancer.2003；3(3):217-226.)。hpv通过编码两种重要的致瘤蛋白e6和e7维持细胞的转化特性(journalofvirology.2003；77(19):10186-10201.)。e6可以与e6相关蛋白(e6associatedprotein，e6ap)形成复合物，进而与肿瘤抑制基因p53结合使其泛素化并降解，最终促进肿瘤的发生(jinfectdis.2001；183(1):8-15.)。e7可以竞争性结合prb肿瘤抑制基因，使得与prb结合的转录因子e2f释放出来，促进细胞周期(infectagentcancer.2010；5:19.)。约有99.7％的宫颈鳞状细胞癌是由hpv感染引起的(aapsj.2009；11(1):65-77.)，hpv可通过将病毒dna整合到染色体dna上(viruses.2013；5(2):708-731；jvirol.2008；82(24):12565-12568.)，从而使得原癌基因激活至致癌基因或使肿瘤抑制基因失活。其他危险因素基本与性行为有关，包括性交年龄过小、多个性伴侣以及多次分娩等也加速了宫颈癌的发生，这些因素都会增加感染13种高危型hpv的风险(procnatlacadsciusa.2006；103(5):1522-1527.)。然而，持续的高风险hpv感染不足以使宿主的上皮细胞永生化，宫颈癌的发生常伴随着遗传学的改变(virology.2009；384(2):400-409.)。hpgd基因编码短链非金属酶脱氢酶蛋白家族的成员，又称15-羟基前列腺素脱氢酶，是前列腺素失活的关键酶(virology.2003；307(1):1-11)。该酶的主要作用是促进前列腺素代谢，使其失活并转变成生物失活代谢物，例如通过催化前列腺素e2(prostaglandine2，pge2)氧化成15-酮-前列腺素e2(15-keto-prostaglandine2，15-k-pge2)等(plospathog.2009；5(2):e1000318；expertopinbiolther.2007；7(5):677-689.)。事实上，前列腺素参与了多种生物过程，包括炎症反应、细胞分化和细胞信号传导等(viruses.2015；7(5):2450-2469.)。hpgd的缺失可导致罕见遗传病如原发性肥大性骨关节病(primaryhypertrophicosteoarthropathy，pho)和颅骨关节病的发生(brjcancer.2007；96(9):1320-1323.)。在风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)纤维样滑膜细胞中hpgd呈现低表达(jvirol.1991；65(2):606-612.)，抗关节炎药物羟化氯喹可通过上调hpgd的水平影响ra的发病。进一步，抑制hpgd可以增强小鼠多种器官组织的再生(jgenvirol.1995；76(pt10):2589-2593)。另外，hpgd是致癌基因前列腺素内源性过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxidesynthase2，ptgs2)的生理拮抗剂，可通过调控炎症反应影响肿瘤的发生(cancerres.2008；68(20):8249-8259.)。尽管hpgd在肺癌、胃癌、胆管癌和膀胱癌(cancerres.2004；64(11):3878-3884；futurevirol.2011；6(1):45-57；thejournalofbiologicalchemistry.1997；272(32):19633-19636；oncogene.1996；13(2):427-431.)等多种肿瘤中的表达水平呈现下调，且具有肿瘤抑制活性，并与肿瘤生长、细胞增值侵袭等密切相关，然而其在宫颈癌发病过程中是否发挥作用，目前尚不清楚。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人-15-羟基前列腺素脱氢酶过表达质粒的构建方法及其应用。一种人-15-羟基前列腺素脱氢酶(hpgd)过表达质粒的构建方法，包括如下步骤：以seqidno：4-5为引物，genbank登录号nc_3248的seqidno：1为模板，进行pcr扩增，获得目的基因；用限制性内切酶xbai和bamhi对pcr产物(即目的基因)和pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp载体进行酶切、纯化、连接，转化至大肠杆菌，即得质粒。作为改进的是，所述pcr扩增的参数为：95℃预变性3min，然后95℃15s，60℃15s，72℃30s条件下扩增30个循环，最后72℃延伸5min。作为改进的是，所述pcr产物与pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp载体的体积比为7:1。人-15-羟基前列腺素脱氢酶(hpgd)过表达质粒表达得到的人-15-羟基前列腺素脱氢酶在制备预防或治疗宫颈癌的产品上的应用。有益效果：与现有技术相比，本发明提供的hpgd在宫颈癌组织中呈现低水平表达，人为过表达宫颈癌细胞的hpgd，能够明显抑制细胞的增殖、迁移能力及恶性程度，因此，hpgd在宫颈癌发病过程中发挥重要作用，可以作为诊疗宫颈癌的新的分子标记和药物靶点。附图说明图1为基因芯片结果火山示意图，显示3对宫颈癌及癌旁组织中差异表达达2倍以上的基因的分布；图2为real-timepcr检测hpgd在67对宫颈癌及癌旁组织中的表达示意图；图3为westernblot验证稳定表达hpgd的不同宫颈癌细胞系构建情况图，(a)宫颈癌hela细胞系；(b)宫颈癌siha细胞系；图4为过表达hpgd的宫颈癌细胞接种14天后平板克隆的效果图，(a)hela细胞平板效果图；(b)siha细胞平板效果图；(c)细胞平板克隆形成数结果统计(**p<0.01，***p<0.001)，其中横线条填充的为hela细胞，无填充的为siha细胞；图5为过表达hpgd的宫颈癌细胞接种12h后transwell迁移实验效果图，(a)小室底部的hela细胞；(b)小室底部的siha细胞；(c)迁移至小室底部的细胞结果统计(**p<0.01，***p<0.001)，其中横线条填充的为hela细胞，无填充的为siha细胞。图6为过表达hpgd的宫颈癌细胞软琼脂克隆14d后形成实验结果示意图，(a)pcdh或hpgd感染hela细胞，放大100×倍；(b)pcdh或hpgd感染siha细胞，放大100×倍；(c)软琼脂克隆形成实验的结果统计(***p<0.001)，其中横线条填充的为hela细胞，无填充的为siha细胞。具体实施方式下面结合具体实例对本发明的方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。实施例1人-15-羟基前列腺素脱氢酶hpgd在宫颈癌组织中的表达1、材料1.1组织本发明的临床组织标本均来自2013年11月至2017年6月于南京医科大学附属南京妇幼保健院妇产科治疗的ib1期宫颈癌患者，每对标本包含手术切除的宫颈癌组织和配对的癌旁组织。所有标本的使用均由患者或其委托人签署知情同意书，得到了南京医科大学医学伦理委员会批准。1.2试剂trizol试剂购自美国thermoscientific公司；荧光实时定量pcr(real-timequantitativepolymerasechainreaction，rt-qpcr)所用2×chamqsybrqpcrmastermix试剂为南京诺唯赞生物有限公司产品；rt-qpcr的引物为苏州金唯智科技有限公司合成；抗hpgd的单克隆抗体(monoclonalantibody，mab)购自美国santacruz公司；eliteabc液以及dab显色试剂盒购自vector公司；arraystar公司的基因芯片产品(humanlncrnamicroarrayv3.0service)由上海康成生物工程有限公司代理。2.方法2.1宫颈癌组织及癌旁组织的lncrna芯片技术以3例不同年龄(39岁、54岁、65岁)的宫颈癌患者的手术切除样本为对象，委托上海康成生物工程有限公司进行“arraystarhumanlncrnamicroarrayv3.0service”服务，进行差异基因筛选，其中hpgd的表达水平显著降低，核苷酸序列如seqidno：1所示。2.2hpgd的real-timepcr检测2.2.1提取总rna以67例宫颈癌患者的宫颈癌组织样本及癌旁组织样本(约50-100mg)为对象，加入1mlreagent后置于室温(15-30℃)使核蛋白复合物完全分离。5min后加入0.2ml氯仿，盖好管盖，手持剧烈振荡15s，室温放置2-3min。于2-8℃条件下以12000g离心15min，将上层无色水相转移至另一个1.5mleppendorf管。加入0.5ml异丙醇，室温放置10min。于2-8℃条件下以12000g离心10min，弃去上清。用1ml75％乙醇洗涤rna沉淀，旋涡混合器混合。于2-8℃条件下以7500g离心5min，弃去上清。空气干燥5-10min后用无rna酶的ddh2o溶解rna，微量加样器反复吹吸并置于55-60℃温育10min，促进rna溶解。于260nm测定rna浓度，提取的rna可置于-70℃保存。2.2.2引物设计针对pubmed数据库提供的hpgdcds区的序列采用oligo7软件进行qpcr引物设计。设计引物的原则包括pcr扩增产物长度为80-150bp最为合适，gc含量保持在40-60％为佳。根据以上原则设计并获得hpgd的qpcr引物，其中上游引物序列(seqidno：2)为：5'-ctctgttcatccagtgcgat-3'，下游引物序列(seqidno：3)为：5'-ttcactccagcattattgacca-3'，将设计好的引物进行blast比对，确定引物的特异性。2.2.3rt-qpcr验证宫颈癌病人中hpgd的mrna表达水平收集宫颈癌病人癌和癌旁组织标本，置于trizol试剂中，用研磨棒将组织研磨充分，提取组织rna。使用nanodrop2000对提取的组织总rna进行浓度测定，并以其为模板进行逆转录，逆转录操作步骤严格遵守诺唯赞逆转录试剂盒说明。反应体系按如下用量配制：试剂用量5×rtsupermix2μlrnase-freewater至10μl模板rnaxμl(1pg～500ng)总体积10μl将配制好的逆转录体系置于水浴锅中，依次按照25℃10min，50℃30min，85℃5min条件进行反应。获得cdna后，对其进行rt-qpcr检测。按照诺唯赞2×chamqsybrqpcrmastermix的说明配制反应体系：试剂使用量2×chamqsybrqpcrmastermix10μlpcrforwardprimer(10μm)0.4μlpcrreverseprimer(10μm)0.4μl模板dna/cdna1μlddh2o(灭菌蒸馏水)8.2μl总体积20μl按下列条件进行qpcr反应：95℃预变性30s，95℃10s、60℃30s循环40个反应，95℃15s、60℃60s、95℃15s采集溶解曲线。得到ct值，统计分析样本中hpgdmrna的表达。3、结果3.1基因芯片结果通过arraystarhumanlncrnaexpressionmicroarrayv3.0技术，获得3例不同年龄的宫颈癌患者的肿瘤组织和癌旁组织中差异表达的基因(图1)，其中hpgd在宫颈癌组织中的表达明显降低。3.2利用hpgd的差异表达对宫颈癌组织进行筛查为了验证基因芯片结果，本发明对临床样本进行hpgd的real-timepcr检测，证实67例宫颈癌组织中，其中60例宫颈癌组织中，hpgd的表达明显低于癌旁组织(图2)，提示hpgd可能参与调控宫颈癌的发生过程，具有应用于宫颈癌治疗的潜能。实施例2构建过表达hpgd的宫颈癌细胞系1、材料1.1质粒与细胞1.1质粒与细胞慢病毒三质粒包装系统包括慢病毒表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp、包膜质粒pmd2.g和包装质粒，均为本实验室保存。实验所需的293t细胞以及人宫颈癌c33a、hela和siha细胞均购自中国科学院细胞库，培养于含有10％灭活胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)、庆大霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)和青霉素(100u/ml)的dmem培养基中。人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，huvecs)为本实验室保存，培养于含20％灭活胎牛血清中。细胞培养条件均为37℃、5％co2。1.2试剂pcr所用的高保真酶(phanta酶)购自南京诺唯赞科技有限公司；凝胶纯化试剂盒购自美国omega公司；限制性内切酶为日本takara公司产品；t4dna连接酶、核酸标准分子量marker、质粒转染试剂lipofectaminetm2000、trizol及蛋白标准分子量marker为美国thermoscientific公司产品；感受态大肠杆菌dh5α购自天根生化科技有限公司；ripa细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂以及苯甲基磺酰氟化物(phenylmethylsulfonylfluoride，pmsf)为上海康成生物公司产品；抗hpgdmab以及抗内参基因α-tubulinmab购自美国santacruz公司；抗flag的dykddddkmab为美国thermoscientific公司产品；辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗兔igg与羊抗鼠igg为中国碧云天公司产品。2、方法2.1hpgd过表达质粒的构建与鉴定2.1.1引物合成在pubmed数据库中查询hpgdcds区序列，根据此序列采用oligo7软件设计hpgd的扩增引物，正向引物序列为5'-tgctctagagccaccatgcacgtgaacggcaaag-3'(seqidno：4，实线部分可被xbai识别，波浪线部分为kozak增强序列)；反向引物序列为5'-cgcggatcctcatttgtcatcgtcgtccttataatccttatcgtcatcatccttgtaatctttgtcgtcgtcatccttgtagtcttgggtttttgcttgaaat-3'(seqidno：5，实线部分可被bamhi识别，虚线部分为flag标签序列)。引物送苏州金唯智科技有限公司合成。2.1.2pcr扩增hpgd基因以huvecs的cdna为模板，利用上述引物进行扩增。扩增体系为：2×phantamaxmastermix25μl，模板1μl，正向引物(10μm)2μl，反向引物(10μm)2μl，ddh2o20μl，总体系为50μl。扩增条件为：95℃预变性3min，然后95℃15s变性、60℃15s退火、72℃30s延伸，扩增30个循环，72℃5min加强延伸。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，确认条带位置后切胶回收扩增出的目的片段。2.1.3hpgd过表达质粒的构建分别用xbai和bamhi限制性核酸内切酶双酶切慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp以及2.1.2中切胶回收的产物。酶切反应体系包括2.5μlxbai，2.5μlbamhi，2.5μl10×kbuffer，5μl载体质粒或10μlpcr切胶回收产物，补足ddh2o至总体系为50μl，置于37℃恒温水浴锅中酶切过夜。1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收酶切产物，将酶切回收后的pcr产物、pcdh载体以及t4dna连接酶和t4连接酶buffer按7：1：1：1的比例混匀后，于22℃水浴锅中连接1h。将连接产物转化入感受态大肠杆菌dh5α，挑取单克隆摇菌扩增并提取质粒。2.1.4hpgd过表达质粒的鉴定对提取的质粒dna进行pcr扩增鉴定以及xbai和bamhi双酶切鉴定，并将质粒送至南京擎科生物有限公司测序，将测序结果与pubmed中查询的hpgd基因序列进行比对。比对正确后命名为pcdh-hpgd。2.2稳定表达hpgd的宫颈癌细胞系的构建与鉴定2.2.1hpgd重组慢病毒包装及滴度测定将293t细胞消化后计数，按106个细胞/皿接种在10cm细胞培养皿中，加入10ml培养基，过夜培养。当细胞生长至汇合度达到60-70％时进行转染。在lipofectaminetm2000的作用下，将慢病毒包装的三质粒(pcdh-hpgd质粒、包装质粒pspax2和包膜质粒pmd2.g)共同转染入293t细胞，并同时转染pcdh空载体作为对照。培养8-10h后更换完全培养基终止转染，48h后观察293t细胞中绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)的表达，并收集48h和72h的细胞培养上清，经0.45μm滤器过滤后保存在-70℃。采用梯度稀释法对收集的病毒液进行滴度测定。慢病毒滴度(tu/ml)计算公式为：荧光细胞数×病毒液稀释倍数/病毒液体积。2.2.2稳定表达hpgd的宫颈癌细胞系的构建及验证用相同感染复数(multiplicityofinfection，moi)的对照pcdh和hpgd慢病毒分别感染宫颈癌细胞hela和siha。感染时细胞汇合度应保持在50-60％，于感染4-6h后更换10％dmem培养基终止。48h后观察荧光显微镜下细胞状态以及gfp的表达。收集感染了对照pcdh及hpgd病毒液的宫颈癌hela和siha细胞总蛋白，westernblot验证感染后hpgd在宫颈癌hela和siha细胞中的表达。3.结果westernblot结果如图3所示，从图中可以看出pcdh-hpgd宫颈癌细胞细胞构建成功。实施例3hpgd在抗宫颈癌中的应用1、材料1.1细胞实验所用到的hela和siha细胞培养方法同实施例2。1.2试剂慢病毒pcdh和hpgd包装同实施例2。transwell小室(8μm)购于millipore公司；基质胶(bdmatrigeltmbasementmembranematrix)以及软琼脂集落形成实验用琼脂粉为bdbiosciences公司产品。2、方法2.1平板克隆形成实验取对数生长期细胞，消化计数后按每孔100个细胞接种至12孔板中，每孔加1ml10％dmem培养基。在37℃、5％co2的条件下培养2-3周，期间适时更换完全培养基。待12孔板中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。用水润洗后，每孔加入500μl的0.1％的甲醇结晶紫染色液，固定染色30min，流水漂洗，晾干后直接计数。2.2transwell迁移实验向24孔板每孔中加入500μl含10％灭活胎牛血清的dmem培养基，将transwell小室置于孔内，放入细胞培养箱平衡30min。将pcdhhela、hpgdhela、pcdhsiha、hpgdsiha四组细胞分别消化计数，并用纯dmem培养基将细胞密度调整为5×104个/ml。每个小室加入200μl细胞悬液，即每孔为1×104个细胞，每组设置3个复孔。置于培养箱中继续培养，并于培养12h后取出小室，甲醛固定15min，结晶紫染色15min。晾干后在显微镜下拍照，对穿过小室的细胞数量进行计数分析。2.3软琼脂集落形成实验分别配制质量体积比为0.6％、1.2％的琼脂溶液，高压灭菌后置于60℃水浴锅中保存。取1.2％的琼脂溶液冷却至约37℃时与2×20％的dmem溶液按1：1混合后以每孔2ml加入6孔板中。待下层琼脂凝固后消化细胞计数，用2×20％的dmem调整细胞浓度为1×104/ml。将细胞悬液与0.6％的琼脂溶液按1：1比例混合后以每孔2ml加入6孔板中，置于37℃培养箱中培养2-3周，期间补加完全培养基防止干燥，显微镜下观察每孔形成的集落情况。并对形成的集落进行拍照、扫描统计，计算各组细胞的克隆形成率。3、结果3.1hpgd抑制宫颈癌细胞的增殖在获得稳定过表达hpgd的hela和siha细胞后，通过平板克隆形成实验检测hpgd对宫颈癌细胞增殖的影响。结果显示，与对照pcdh组相比，无论是感染了hpgd病毒的hela还是siha细胞，其克隆形成数都明显减少，且差异有统计学意义。提示过表达hpgd可抑制宫颈癌细胞hela(图4a和图4c)和siha(图4b和图4c)的增殖。3.2hpgd抑制宫颈癌细胞的迁移通过transwell小室迁移实验验证hpgd在宫颈癌细胞迁移中的作用，统计结果表明，在细胞铺板12h后，hpgd组穿入小室底部的细胞数量均少于pcdh组，siha细胞中的迁移趋势也与hela细胞一致，且差异具有统计学意义。以上结果提示，过表达hpgd可抑制宫颈癌细胞hela(图5a和图5c)和siha(图5b和图5c)的迁移。3.3hpgd抑制宫颈癌的恶化程度软琼脂集落形成实验用于观察hpgd对体外宫颈癌恶化程度的影响。统计结果显示，hpgdhela和hpgdsiha组的集落形成率均显著低于对应的pcdh组，且差异有统计学意义，提示过表达hpgd可抑制宫颈癌细胞hela(图6a和图6c)和siha(图6b和图6c)的恶化程度。上述结果表明，hpgd的过表达能够明显抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移能力及恶性程度，说明宫颈癌中低水平表达的hpgd参与调控肿瘤发生的多个过程，而且具有抗宫颈癌变的潜能，为宫颈癌的诊断和治疗提供了新的分子标记和药物靶标。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。序列表<110>南京医科大学<120>一种人-15-羟基前列腺素脱氢酶过表达质粒的构建方法及其应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>801<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>1atgcacgtgaacggcaaagtggcgctggtgaccggcgcggctcagggcataggcagagcc60tttgcagaggcgctgctgcttaagggcgccaaggtagcgctggtggattggaatcttgaa120gcaggtgtacagtgtaaagctgccctggatgagcagtttgaacctcagaagactctgttc180atccagtgcgatgtggctgaccagcaacaactgagagacacttttagaaaagttgtagac240cactttggaagactggacattttggtcaataatgctggagtgaataatgagaaaaactgg300gaaaaaactctgcaaattaatttggtttctgttatcagtggaacctatcttggtttggat360tacatgagtaagcaaaatggaggtgaaggcggcatcattatcaatatgtcatctttagca420ggactcatgcccgttgcacagcagccggtttattgtgcttcaaagcatggcatagttgga480ttcacacgctcagcagcgttggctgctaatcttatgaacagtggtgtgagactgaatgcc540atttgtccaggctttgttaacacagccatccttgaatcaattgaaaaagaagaaaacatg600ggacaatatatagaatataaggatcatatcaaggatatgattaaatactatggaattttg660gacccaccattgattgccaatggattgataacactcattgaagatgatgctttaaatggt720gctattatgaagatcacaacttctaagggaattcattttcaagactatgatacaactcca780tttcaagcaaaaacccaatga801<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>2ctctgttcatccagtgcgat20<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>3ttcactccagcattattgacca22<210>4<211>34<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>4tgctctagagccaccatgcacgtgaacggcaaag34<210>5<211>103<212>dna<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>5cgcggatcctcatttgtcatcgtagtccttataatccttatcgtcatcatccttgtaatc60tttgtcgtcgtcatccttgtagtcttgggtttttgcttgaaat103当前第1页12