本发明属于动物育种学和细胞生物学领域，涉及一种新的研究stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法。
背景技术：
：stra8(stimulatedbyretinoicacidgene8)是生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂前特异表达的基因，在调控哺乳类和鸟类减数分裂的起始过程中起到关键作用。stra8作为一个受ra诱导表达的基因，首先是在胚胎癌细胞、胚胎干细胞的培养中认识到的。bouillet等用ra处理小鼠全能的p19胚胎癌细胞，筛选出50个受ra诱导表达的基因，其中stra8是一个新发现的基因。后来发现在小鼠胚胎卵巢和出生后至成体的精巢中也有表达。在小鼠胚胎卵巢，stra8表达一段时间后，dmcl(减数分裂过程中所需的重组酶)的表达从前向后波形增加，而维持多能干细胞所需的oct4的表达也在stra8表达后从前向后波形丧失。这表明stra8是生殖细胞由有丝分裂转变为减数分裂前特异表达的基因。mirna调节生殖细胞的发育分化过程有很多种方式。mir17-92对维持生殖细胞增殖有重要作用，胚胎阶段雌性生殖细胞在减数分裂开始时mir17–92会下调也印证了这一点。novotny等观察到mir17-92在睾丸精子发生过程中其表达也不断上调，从而通过抑制e2f1mrna的翻译保护生精细胞免受凋亡的威胁，有利于正常的精子发生。takada等研究证实，mir-29b在e13.5的4小鼠pgcs中表达，在e13.5-e17.5的雌性胚胎生殖细胞中表达上调，而在雄性胚胎生殖细胞则发生甲基化，这表明，mir-29b通过与dnmt3a、dnmt3b作用可调控pgc向雌性生殖细胞发生分化。mir-122a可能在小鼠精子发生过程中有一定作用，因其在小鼠睾丸内有不同程度表达，它还可能参与调控靶基因-转运蛋白间的互作，并对出生后生殖细胞的维持有一定的作用。人上的研究表明，mir-124a可与sp3作用，通过与粗线期精母细胞或精子细胞的h1t/gc-box结合，进而激活h1t组蛋白启动子。bjork等发现，mir-18可通过作用于热休克蛋白2(hsp2)使其表达量下调，进而在小鼠精子发生过程中发挥着一定的调控作用。mir-469通过在精母细胞及球型精子期下调tp2和prm2的表达而对精子的成熟起作用。目前，构建stra8过表达载体转染鸡esc以研究stra8在鸡雄性生殖细胞分化中的作用，该方法仅仅是对过表达stra8在鸡雄性生殖细胞分化的研究，并未对stra基因进行敲除或者抑制，即并不能系统的对stra8基因的功能进行验证。技术实现要素：为了克服上述缺陷，本发明提供一种周期短，效率及安全性高的研究stra8基因在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能的方法，将靶向stra8的mirna转染鸡ssc，对stra8基因进行抑制；慢病毒包裹mirna转染ssc，可以让mirna更好的整合，以便更好的进行ra诱导培养。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种研究stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)stra8基因3’utr序列的获得；(2)stra8基因靶向mirna预测；(3)最佳mirna筛选；(4)验证mirna通过stra8对精原干细胞减数分裂的作用；(5)体内验证mirna对公鸡生精的影响。步骤(1)具体为：通过ncbi提供的鸡stra8cds序列，设计3’race引物；以如皋黄鸡睾丸提取rna反转录形成的cdna为模板，利用3’race技术获得stra8基因的3’utr序列，纯化回收后测序。步骤(2)具体为：利用mirbasehttp://www.mirbase.org/获得4个鸡的mirna的序列，分别为>gga-mir-1a-1mi0001247，>gga-mir-1bmi0001254，>gga-mir-31mi0001276，>gga-mir-218-1mi0001212，这四个mirna都能靶向stra8基因。步骤(3)具体为：分别构建四个mirna的模拟物，并构建stra8-3’utr过表达载体，取2支ep管，先加50μl的无血清dmem培养基，一支ep管加0.211μg质粒：包括10ngstra8-3'utr+1ngprl-tk+200ngmirna质粒，混匀；另外一支ep管加0.633μllipofectaminetm2000转染试剂混匀，约5min后将两管液体合到一管，混匀后，室温放置15min-20min后，均匀滴加到提前换过液的293t细胞中，后置于co2培养箱中培养；转染24h后收样；根据promega双报告基因检测试剂盒说明书操作进行检测，并突变抑制活性最佳的mirna靶向stra8的靶位点，进行进一步双报告基因检测，同时构建最佳mirna的抑制物。步骤(4)具体为：mirna慢病毒载体侵染ssc，设计6组进行试验：(1)自分化空白对照(blank)；(2)ra组(ra)；(3)mir-nc+ra组；(4)mir-31+ra组(mir-31)；(5)mir-31+mir-31i+ra组(mir-31+mir-31i)；(6)mir-31i+ra组(mir-31i)，利用碧云天细胞周期检测试剂盒对单倍体进行检测，同时利用qrt-pcr对减数分裂相关基因进行检测，以及westernblot对stra8蛋白表达量进行检测。步骤(5)具体为：对性成熟的公鸡进行睾丸注射，从公鸡右侧最后一根肋骨后方0.5cm处切开，找到睾丸，进行打点注射，注射总量为100μl，病毒量为107tu，注射20天后，进行采精，每3天采精一次，连续采集5次，进行精子计数；睾丸注射50天后，对睾丸进行取样，睾丸横切10mm×10mm大小，进行he染色，并对睾丸组织中的减数分裂相关基因进行qrt-pcr定量检测，以及westernblot对stra8蛋白表达量进行检测。本方法的发明，主要为了提供一种新的研究stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法。采用本方法，能够实现在体内体外水平完成stra8基因功能的验证，这是目前在其他物种中尚未完成的一种新方法。相对于现有技术，本发明本方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。运用该方法可以快速、高效在短时间内验证stra8基因在鸡减数分裂过程中的调控作用。并且能够很好的对stra8基因进行抑制，以便更好在ssc中进行基因功能验证。本发明制备周期短，制备效率及安全性高；方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行；该方法的体外实验适用于其他物种。附图说明图13’race扩增stra83’utr；图2stra8基因靶向mirna预测；图3最佳抑制活性mirna筛选；图4mir-31直接靶向stra8，a：esc、pgc和ssc中stra8和mir-31的表达量检测；b：stra8和mirna对sscs进行不同组合的转染后的定量检测结果；c：ssc经mir-31转染后的stra8表达量检测；图5mir-31直接靶向stra8而抑制减数分裂，a：ssc分离鉴定图；b：基于ra诱导的细胞变化示意图；c：单倍体检测百分比；d：qrt-pcr检测减数分裂和细胞自我更新与维持相关基因的表达；图6mir-31可靶向stra8而抑制精子生成，a：精子数量统计；b:睾丸的he染色；c，d：不同处理组stra8mrna水平和蛋白水平表达情况。具体实施方式为了阐述本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图说明及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。本方法首先通过ncbi提供的鸡stra8cds序列以性成熟如皋黄鸡睾丸提取rna反转录形成的cdna为模板，利用3’race技术获得stra8基因的3’utr序列。利用mirbasehttp://www.mirbase.org/获得4个鸡上的能靶向stra8基因的mirna的序列，分别为gga-mir-1a，gga-mir-1b，gga-mir-31，gga-mir-218，分别构建四个mirna的慢病毒载体，并构建stra8-3’utr过表达载体，共转染df-1细胞系，利用双荧光素酶报告进行活性检测，初步在细胞水平上检测4个mirna活性。突变抑制活性最佳的mirna靶向stra8的靶位点，进行进一步双荧光报告基因检测，同时构建最佳mirna的抑制物。利用mirna慢病毒载体侵染ssc，设计6组进行试验：(1)自分化空白对照(blank)；(2)ra组(ra)；(3)mir-nc+ra组；(4)mir-31+ra组(mir-31)；(5)mir-31+mir-31i+ra组(mir-31+mir-31i)；(6)mir-31i+ra组(mir-31i)，利用碧云天细胞周期检测试剂盒对单倍体进行检测，同时利用qrt-pcr对减数分裂相关基因进行检测，以及westernblot对stra8蛋白表达量进行检测。对性成熟的公鸡进行睾丸打点注射，注射总量为100μl，病毒量为107tu，注射20天后，进行采精，每3天采精一次，连续采集5次，进行精子计数。睾丸注射50天后，对睾丸进行取样，睾丸横切10mm×10mm大小，进行he染色，并对睾丸组织中的减数分裂相关基因进行qrt-pcr定量检测，以及westernblot对stra8蛋白表达量进行检测。1.试验材料如皋黄鸡来自中国农业科学院家禽研究所；df-1细胞为本试验室保存；pgl3-cmv-luc-mcs载体及pgmlv-ma2载体购自吉满生物科技有限公司(上海)；trizol、大肠杆菌dh5α感受态、胶回收试剂盒、小提质粒试剂盒、反转录试剂盒及荧光定量试剂盒均购自北京天根公司(北京)；双荧光素酶检测试剂盒reporterassaysystem购自promega公司(美国)；lipofectaminetm2000购自invitrogen公司(美国)；taqpolymerase购自neb(美国)；琼脂糖购自bio-rad(美国)；t4dnaligase、t4dnaligasebuffer、dnaladder、bamhi、ecori、xbai、xhoi、3’fullracecoresetwithprimescripttmrtase购自takara(大连)；opti、胎牛血清、dmem、胰酶购自gibico(美国)；鸡血清、丙酮酸钠、非必需氨基酸、l-谷氨酰胺、碱性成纤维生长因子(fibroblastgrowthfactor-basic，bfgf)、胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor，gdnf)、鼠白血病抑制因子(mouseleukemiainhibitoryfactor，mlif)、人干细胞因子(humanstemcellfactor，hscf)、β-巯基乙醇均购自sigma公司(美国)；anti-integrinα6(fitc标记)购自biovbyt、anti-integrinβ1(alexafluor647)购自santacruzbiotechnology；mir-31-inhibitor合成及慢病毒包裹由吉满生物科技有限公司(上海)完成，引物合成及测序由生工生物工程(上海)有限公司完成。2.试验方法2.1stra8基因3’utr克隆通过ncbi提供的cds序列，设计3’race引物f1：5'ctgggtcctacggatgcttg3'(seqidno.1)，f2：5'cgtttgatgttgctgctggtt3'(seqidno.2)。利用trizol法提取精原干细胞总rna，接着使用takara3’fullracecoresetwithprimescripttmrtase进行3’race试验克隆stra8基因的3’utr，具体的使用步骤和剂量见表1。反应程序：步骤1：反转录，反应程序：42℃60min，70℃15min。步骤2：outerpcr，反应程序为：step1:94℃预变性3min；step2:94℃变性30sec，57.2℃退火30sec，72℃延伸3min,step2循环20次；step3:72℃延伸10min；step4:4℃保存。步骤3：innerpcr，反应程序为：step1:94℃预变性3min；step2:94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸3min,step2循环30次；step3:72℃延伸10min；step4:4℃保存。步骤3的产物进行切胶回收纯化，之后进行ta克隆。连接产物t-stra8进行转化，挑单克隆摇菌送上海生工进行测序。表1takara3’fullracecoresetwithprimescripttmrtase试剂添加表table1takara3’fullracecoresetwithprimescripttmrtase2.2生物信息学预测与载体构建靶向stra8的mirnas预测：利用targetscan(http://www.targetscan.org/vert_71)在线生物软件预测在stra8基因3’utr处存在潜在标靶关系的鸡源mirnas，选出可能性最大的4条mirnas作为候选mirna进行后续试验。依据筛选的mirna序列合成相应的引物(见表2，由上至下序列编号为seqidno.5-12)，以2.1stra8基因3’utr克隆得到的产物为模板，进行pcr扩增，克隆至pgmlv-ma2载体中命名为mir-1a、mir-1b、mir-31、mir-218。stra8基因的3’utr双荧光素酶报告基因载体构建：利用3’race得到的stra8基因的3’utr序列，加上xhoi和xbai酶切位点(表2，由上至下序列编号为seqidno.3-4)，克隆至pgl3-cmv-luc-mcs载体中，命名为pgl3-stra8-3’utr(野生型，简写为wt)。表2mirna合成及其stra8基因的3’utr双荧光素酶报告基因载体构建的引物序列table2sequenceofprimers注：下划线表示酶切位点2.3细胞转染df-1细胞培养于含10％胎牛血清的dmem高糖培养液，放置于37℃、含5％co2的培养箱。转染前一天将df-1接种于24孔板，每孔细胞量约为1×105个，当细胞生长汇合度达60％左右进行转染试验；实验分组如下：(1)mir-nc、wt+prl-tk；(2)mir-1a+wt和prl-tk；(3)mir-1b+wt和prl-tk；(4)mir-31、wt和prl-tk；(5)mir-218、wt和prl-tk。按照lipofectaminetm2000转染操作说明书进行细胞瞬时转染。取2支ep管，先加50μl的opti，一支ep管加0.211μg质粒(报告基因质粒10ng+内参质粒1ng+mirna质粒200ng)混匀，另外一支ep管加0.633μllipofectaminetm2000转染试剂混匀，约5min后将两管液体合到一管，混匀后，室温放置15min后，均匀滴加到提前换过液的培养板中。2.4双荧光素酶活性检测转染48h后收集细胞用70μl的rapi重悬后，加入到96孔酶标板中，参照reporterassaysystem试剂盒(omega)说明书步骤，检测双荧光素酶活性。mirna抑制活性是荧光素酶相对活性值(relativeluciferaseactivity)即萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。2.5cssc体外传代培养及体外转染cssc体外传代培养：鸡胚孵化至18日龄后，无菌收集睾丸，采用三酶两步消法分离sscs，细胞经差速贴壁法纯化后，培养于sscs因子培养基(sscs因子培养基成分：高糖dmem+10％胎牛血清+2％鸡血清+1mmol·l-1丙酮酸钠+1％非必需氨基酸+2mmol·l-1l-谷氨酰胺+10ng·ml-1bfgf+20ng/mlgdnf+0.1ng·ml-1的hlif+5ng·ml-1scf+5.5×10-5mol·l-1的β-巯基乙醇)中进行体外培养。当细胞的汇合度达到85％左右时，用pbs洗涤3遍，胰酶消化1min，加入有血清的培养基终止消化，消化后的细胞收集到15ml离心管中，1200r·min-1离心6min，离心后弃上清，用新鲜培养基重悬吹打200次，接种至60mm皿中经差速贴壁法纯化后，接种至24孔板，接种细胞数为1×105个。cssc体外转染：当第2代生长良好的cssc细胞生长汇合度达60％左右时，进行体外转染，同时采用1×10-5mol·l-1ra进行体外定向诱导培养。试验分组:(1)自分化空白对照(blank)；(2)ra组(ra)；(3)mir-nc+ra组；(4)mir-31+ra组(mir-31)；(5)mir-31+mir-31i+ra组(mir-31+mir-31i)；(6)mir-31i+ra组(mir-31i)。2.6rt-pcr分析采用trizol法提取收集细胞的总rna，使用天根反转录试剂盒(天根，北京)反转录合成cdna；采用qrt-pcr分别检测stra8，sycp3，dazl，nanos2等基因的表达量，荧光定量所需引物信息表3(从上至下序列编号为seqidno.13-22)。使用abiprism7500荧光定量pcr仪器进行(appliedbiosystems,carlsbad,california)实时定量分析。荧光定量pcr反应体系：cdna2μl、2×superrealcolorpremix10μl、上下游引物(10μmol·l-1)各0.6μl、50×roxreferencedye0.4μl、添加ddh2o至总体积20μl。反应程序：95℃预变性15min，95℃变性10s，64℃退火30s，72℃延伸10s，共40个循环数。内参基因：β-actin，重复次数：n＝3。采用2-δδct法计算各基因的相对表达量。table3thesequenceofprimersandrt-pcrreactionconditions2.7免疫细胞化学检测将cssc接种到多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，待细胞爬片后用4％多聚甲醛固定30min。pbs漂洗3次后，用10％bsa-pbs封闭液37℃孵育1h。分别滴加1:200倍稀释的anti-integrinα6、anti-integrinβ1，37℃孵育2h后，4℃过夜。dapi染色5min，pbst漂洗3次后，甘油封片，倒置显微镜下观察、拍照。2.8细胞周期检测经过处理的cssc，用pbs洗涤3遍，胰酶消化1min，加入有血清的培养基终止消化，消化后的细胞收集到15ml离心管中，1200r·min-1离心6min，离心后弃上清，加入约1ml冰浴预冷的pbs，重悬细胞，并转移到1.5ml离心管内。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，加入1ml冰浴预冷70％乙醇，轻轻吹打混匀，4℃固定12h。1200r·min-1离心6min，沉淀细胞。小心吸除上清，加入约1ml冰浴预冷的pbs，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶染色液(染色缓冲液0.5ml，碘化丙啶染色液(20x)25μl，rnasea(50x)10μl)，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min。利用cyanadp7流式细胞仪进行单倍体检测。2.9睾丸注射性成熟公鸡进行睾丸进行注射，设立control，mir-31组，每组设立3个重复。从公鸡右侧最后一根肋骨后方0.5cm处切开，找到睾丸，进行打点注射，注射总量为100μl，病毒量为107tu，注射20天后，进行采精，每3天采精一次，连续采集5次，进行精子计数。2.10睾丸苏木素－伊红(he)染色睾丸注射50天后，对睾丸进行取样，睾丸横切10mm×10mm大小，利用bouin氏固定液对睾丸组织进行固定24h，依次用70％、80％、90％、95％和100％乙醇作用30min，进行脱水，乙醇与二甲苯等体积混合，作用20min，二甲苯(ⅰ)与二甲苯(ⅱ)各自作用20min。65℃浸蜡1h，之后包埋，切片4～8μm。蜡片先放入30％乙醇溶液，使其展开，再置于42℃温水中展片，65℃烤片8h。将石蜡切片放入染缸内，先后倒入二甲苯(ⅰ)与二甲苯(ⅱ)，各作用5min，进行脱蜡。用无水乙醇(ⅰ)和无水乙醇(ⅱ)分别浸泡2min；再先后用95％、80％和70％乙醇作用1min；自来水洗2min，最后用蒸馏水浸泡2min进行复水。先用苏木素染色液染色10min，自来水中冲洗去多余的染色液10min，蒸馏水再洗涤一遍，95％乙醇脱水5s，伊红染色液染色30s，95％乙醇脱水2min，换用新鲜的95％乙醇再脱水2min，二甲苯透明5min，换用新鲜的二甲苯再透明5min，用中性树胶封片。2.11统计分析所有数据以均数±标准误(x±sem)表示，应用graphpadprism6.0统计学软件，采用两样本均数间t检验的方法，p＜0.05表示差异显著；p＜0.01表示差异极显著。3结果3.1调控stra8的mirnas生物信息学预测将如皋黄鸡sscs的总rna反转录成cdna，利用3'race技术克隆获得stra8基因的3'utr(图1)序列，该序列为seqidno.23，大约1kb；经blast比对后发现其与其他物种的同源性达到80％以上；经targetscan在线预测发现4个鸡源的靶向stra8-3’utr的候选mirna：gga-mirna-1a(mir-1a)，gga-mirna-1b(mir-1b)，gga-mirna-31(mir-31)，gga-mirna-218(mir-218)(图2)，分别合成其模拟物和抑制剂。stra-3'utr序列：gggtcatgcggcagtgtattagactcggtacgcgcggatcttccagagattcgtttgatgttgctgctggtttccttgaaacaaacgagactcagggattgtctagccagagttcttcatttacaagcggcatttctgacaatccagaggatgaccacagactctatctgcagatcactgacttcctaaaaagccttttctttgctaatacacagttctgccaggaagaagatcttcagtttgattatgagactgtaatgctgcggtgcacggagacctttgatgatgaagatttataagtagtttccctgtttgtcaatgttttgccaagcatcactggatacagcaggcatgtgaagagattatgcctcttccagaggaacacctctccaatcagaatggggagacactgtgttgtggtttgttactgttcacttccctttcctcataagtgcttcataacttatcagttgagcaatttatacttttaaacgttccaggttaaaaatatttataaaacctaaaggaagaattatttttctctctgactttttaatgcttaacctcatttcacaaatacactgaagcacgtgcagtttggtgaccttgcctaaggtgagctgtggaagagatgcagagaggacatggcaacctacgcgctccagactgctacctgcaaaactcacagcgtgcctcccagcatcctggcagtgaatgctttcctctacagttctttagcctgggctggaagcaacagaggaatttcttcacagagagcgacatgaggctcttccgtatctatgaggacaactgtagtggccacccactcccaaatcacttggagagatgcaagtacaatcacaaactgtggattatttttgtaaagcgtgtaaagctgaaagagaacaaagccccctgtgctgtctgctgcatcttgttctttgatgagtagtactgctcagatggtgtcttgaaattaaaatgctgtgaagttaaaaaagaaaaaaaaaaaacctatagtgaaatcactagtggaggatccgcgaatcgtcgaacgcaggcgtgcaaacttgccgtatcatggtcatagctgttttcttgtggtgaaattgttattcccctcaaaatttccaacaacaaaaatacgg3.2mirna过表达载体和stra8-3’utr双荧光素酶报告载体及突变载体的构建通过pcr克隆获得携带xhoi和xbai酶切位点的stra8-3’utr及stra8-3’utr-mt突变片段，其片段长度为672bp，双荧光报告载体的大小为5401bp，测序结果显示成功构建stra8-3’utr和stra8-3’utr-mt突变载体。将gga-mir-1a、gga-mir-1b、gga-mir-31、gga-mir-218分别克隆至pgmlv-ma2载体中，分别构建mir-1a、mir-1b、mir-31、mir-218的模拟物，测序结果显示，显示克隆成功。3.3靶向stra8的mirnas进一步筛选为了检测mir-1a、mir-1b、mir-31和mir-218对stra8的影响，我们将这4个mirna及mir-nc与pgl3-stra8-3’utr(wt)载体共转染df-1细胞。结果显示，与mir-nc处理组相比，mir-1a，mir-31，mir-218组相对荧光素酶活性均有一定程度的下调，其中转染mir-31和stra8-3’utr组荧光强度显著下降，表明mir-31是靶向stra8的最佳候选mirna(图3)。3.4mir-31与stra8在体内外相互作用用qrt-pcr对esc、pgc和ssc中stra8和mir-31的表达量进行检测，发现mir-31在三种细胞的表达趋势和stra8呈此消彼长的规律(图4a)。这种规律在体外实验中也得到了验证，我们用stra8和mirna对sscs进行不同组合的转染，发现stra8和mir-31同样存在此消彼长的变化规律，初步证明其在体内具有互作作用(图4b)。同时我们检测mir-31对stra8蛋白表达的影响，发现相对于nc处理组mir-31能明显降低stra8的蛋白表达，mir-31i比nc表达略高但差异不显著(图4c)。因此，双荧光素酶活性检测及westernbloting检测结果表明，外源mir-31能直接靶向stra8-3’utr来降低stra8蛋白表达。3.5mir-31直接靶向stra8而抑制减数分裂无菌分离培养cssc，间接免疫荧光检测结果显示，新分离的细胞表达integrinα6和integrinβ1标记，表明获得纯的cssc(图5a)。将mir-31、mir-31i和mir-nc分别传染cssc24h后，采用ra诱导，72h后进行单倍体检测(图5b)。结果表明，与其他几组相比，mir-31组的单倍体所占百分比显著下降(图5c)。qrt-pcr检测结果显示mir-31处理组特异性下调stra8基因表达，而其它减数分裂相关基因dazl和sycp3也存在不同程度的下调，而与cssc的自我更新与维持的基因nanos2则被上调。westernblot结果显示，采用mir-31、mir-31i和mir-nc分别传染cssc48h后，stra8、dazl和sycp3的表达量明显下调，而nanos2的表达量则上调；进一步表明mir-31可直接靶向stra8而抑制减数分裂(图5d)。3.6mir-31可靶向stra8而抑制精子生成为了验证mir-31是否对雄性个体的精子生成产生影响，本研究对公鸡进行体内睾丸注射mir-31，饲养20天后采集精液，弃去第一次采集的精液，之后每3天采集一次精液，并进行计数。结果显示，与对照组相比较，睾丸注射mir-31后精液量显著下降(图6a)。qrt-pcr和westernblot检测结果显示，mir-31处理组特异性下调stra8基因表达(图6cd)；睾丸注射50天后，睾丸取样、横切，进行苏木精-伊红染色(he)进行。结果显示，与空白对照组相比，mir-31注射组曲精细管中的精子量显著下降(图6b)，进一步说明mir-31可在体内靶向stra8而影响cssc减数分裂。本发明首先通过ncbi提供的鸡stra8cds序列以18.5胚龄如皋黄鸡睾丸提取rna反转录形成的cdna为模板，利用3’race技术获得stra8基因的3’utr序列。利用mirbasehttp://www.mirbase.org/获得4个鸡上的能靶向stra8基因的mirna的序列，分别为>gga-mir-1a-1mi0001247,>gga-mir-1bmi0001254,>gga-mir-31mi0001276,>gga-mir-218-1mi0001212，分别构建四个mirna的慢病毒载体，并构建stra8-3’utr过表达载体，共转染df-1细胞系，利用双荧光素酶报告进行活性检测，初步在细胞水平上检测4个mirna活性。并突变抑制活性最佳的mirna靶向stra8的靶位点，进行进一步双荧光报告基因检测，同时构建最佳mirna的抑制物。利用mirna慢病毒载体侵染ssc，设计6组进行试验：(1)自分化空白对照(blank)；(2)ra组(ra)；(3)mir-nc+ra组；(4)mir-31+ra组(mir-31)；(5)mir-31+mir-31i+ra组(mir-31+mir-31i)；(6)mir-31i+ra组(mir-31i)，利用碧云天细胞周期检测试剂盒对单倍体进行检测，同时利用qrt-pcr对减数分裂相关基因进行检测，以及westernblot对stra8蛋白表达量进行检测。对性成熟的公鸡进行睾丸注射，从公鸡右侧最后一根肋骨后方0.5cm处切开，找到睾丸，进行打点注射，注射总量为100μl，病毒量为107tu，注射20天后，进行采精，每3天采精一次，连续采集5次，进行精子计数。睾丸注射50天后，对睾丸进行取样，睾丸横切10mm×10mm大小，进行he染色，并对睾丸组织中的减数分裂相关基因进行qrt-pcr定量检测，以及westernblot对stra8蛋白表达量进行检测。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表<110>扬州大学<120>一种研究stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法<130>xhx2018081301<141>2018-08-13<160>23<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>chicken<400>1ctgggtcctacggatgcttg20<210>2<211>21<212>dna<213>chicken<400>2cgtttgatgttgctgctggtt21<210>3<211>37<212>dna<213>chicken<400>3ccgctcgaggtagtttccctgtttgtcaatgttttgc37<210>4<211>41<212>dna<213>chicken<400>4ggctctagaaatttcaagacaccatctgagcagtactactc41<210>5<211>30<212>dna<213>chicken<400>5ccgctcgagactgcctcttcccagccctaa30<210>6<211>31<212>dna<213>chicken<400>6ccgggatccatgccgcagtcagcatattgaa31<210>7<211>29<212>dna<213>chicken<400>7ccgctcgagattggctgcagctgagtgcc29<210>8<211>32<212>dna<213>chicken<400>8ccgggatcctcctgtcatctcgtgtcacctcg32<210>9<211>34<212>dna<213>chicken<400>9ccgctcgagagcacagaagtcaaaacagcccttt34<210>10<211>31<212>dna<213>chicken<400>10ccgggatccaagggctggaaacagctcagtg31<210>11<211>34<212>dna<213>chicken<400>11ccgctcgagggtggaggaaactttcaatgtggtt34<210>12<211>38<212>dna<213>chicken<400>12ccgggatccgcagcaagaataaatagatcctgaatgcc38<210>13<211>22<212>dna<213>chicken<400>13ccacggctatttcacacctctg22<210>14<211>20<212>dna<213>chicken<400>14gctcttggcaagcatccgta20<210>15<211>20<212>dna<213>chicken<400>15tgtcttgaaggcctcgtttg20<210>16<211>22<212>dna<213>chicken<400>16catatccttggcaggttgttga22<210>17<211>21<212>dna<213>chicken<400>17ctgtatttcagcagtgggatg21<210>18<211>19<212>dna<213>chicken<400>18tgcgaagttcattttgtgc19<210>19<211>20<212>dna<213>chicken<400>19tttgaatacccgccagagat20<210>20<211>20<212>dna<213>chicken<400>20caacagcaggcagagcatac20<210>21<211>23<212>dna<213>chicken<400>21accaactgggatgatatggagaa23<210>22<211>18<212>dna<213>chicken<400>22ttggctttggggttcagg18<210>23<211>1148<212>dna<213>chicken<400>23gggtcatgcggcagtgtattagactcggtacgcgcggatcttccagagattcgtttgatg60ttgctgctggtttccttgaaacaaacgagactcagggattgtctagccagagttcttcat120ttacaagcggcatttctgacaatccagaggatgaccacagactctatctgcagatcactg180acttcctaaaaagccttttctttgctaatacacagttctgccaggaagaagatcttcagt240ttgattatgagactgtaatgctgcggtgcacggagacctttgatgatgaagatttataag300tagtttccctgtttgtcaatgttttgccaagcatcactggatacagcaggcatgtgaaga360gattatgcctcttccagaggaacacctctccaatcagaatggggagacactgtgttgtgg420tttgttactgttcacttccctttcctcataagtgcttcataacttatcagttgagcaatt480tatacttttaaacgttccaggttaaaaatatttataaaacctaaaggaagaattattttt540ctctctgactttttaatgcttaacctcatttcacaaatacactgaagcacgtgcagtttg600gtgaccttgcctaaggtgagctgtggaagagatgcagagaggacatggcaacctacgcgc660tccagactgctacctgcaaaactcacagcgtgcctcccagcatcctggcagtgaatgctt720tcctctacagttctttagcctgggctggaagcaacagaggaatttcttcacagagagcga780catgaggctcttccgtatctatgaggacaactgtagtggccacccactcccaaatcactt840ggagagatgcaagtacaatcacaaactgtggattatttttgtaaagcgtgtaaagctgaa900agagaacaaagccccctgtgctgtctgctgcatcttgttctttgatgagtagtactgctc960agatggtgtcttgaaattaaaatgctgtgaagttaaaaaagaaaaaaaaaaaacctatag1020tgaaatcactagtggaggatccgcgaatcgtcgaacgcaggcgtgcaaacttgccgtatc1080atggtcatagctgttttcttgtggtgaaattgttattcccctcaaaatttccaacaacaa1140aaatacgg1148当前第1页12当前第1页12