石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法与流程

本发明涉及植物内生真菌中提取分离化合物的技术领域，具体涉及一种石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法。

背景技术：

近年来，植物内生真菌的研究备受关注，内生真菌生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同演化，在演化过程中二者形成互惠共生关系，一方面内生真菌可以从宿主中吸收营养供给自己生长需要，另一方面，内生真菌在宿主的生长发育和系统演化过程以及抗植物病虫害中起着重要的作用。据报道，一些内生真菌中还可发现有药用植物所产生的活性物质。

石斛碱是一种吡咯里西啶衍生物类生物碱，是从兰科植物石斛兰(dendrobiumnobilelindl)的茎中提取分离得到，也是石斛兰的主要药用活性成分。石斛碱具有解热、眼部矫正、炎症调节、保护胃肠粘膜损伤和抗衰老剂等多种药用价值。抑制a549细胞的生长，这与肺癌有关，有显著的治疗甲型h1n1流感等病毒感染的效果，因此，对其进行研究开发具有较高的临床价值。

石斛兰在中国传统药用植物中得到了广泛的应用，而目前关于石斛碱的获取，主要集中在植物提取和化学合成技术方面，石斛兰的石斛碱活性成分在医药、化工等领域引起了越来越多的关注，但在植物中，石斛碱的生产量却很少。然而，目前大多数的研究者和研究课题都关注于草本中的石斛碱，由于技术上的局限性，目前还没有对石斛兰中分离出来的内生真菌中的石斛碱提取分离进行研究。

技术实现要素：

本发明意在提供一种石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，以解决目前还未有从石斛兰内生菌中获取石斛碱的技术问题。

本方案中的石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，包括以下步骤：

步骤1)、内生真菌的分离：石斛兰进行表面灭菌处理后，将其接种于培养基上，在23～27℃孵化4～6天，然后分离出内生真菌菌株；

步骤2)、内生真菌菌体和代谢产物的分离：利用水循环多功能真空泵将所述内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥；

步骤3)、胞内石斛碱的提取：冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，使用氯仿浸泡后转移至离心管中进行离心分离；分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；

步骤4)、胞外石斛碱的提取：将步骤2)中的代谢产物和氯仿混合后进行离心分离，分离后的氯仿相在34～36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入氯仿溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；留取过滤后的滤渣，所述滤渣即为目标提取物。

本发明的有益效果是：本发明先对石斛兰植株表面进行灭绝操作，避免从石斛兰内部分离出来的内生真菌含有杂菌而影响内生真均的生长繁殖。对分离出来的内生真菌进行孵化获得内生真菌菌株，孵化过程中产生的代谢产物与内生真菌菌株进行分离，以便于独立的从内生真菌菌株和代谢产物中提取出石斛碱。

分离后的菌体进行冷冻干燥，菌体在冷冻环境下处于冷冻状态，然后在真空减压情况下利用升华现象除去水分，使菌体在非剧烈的，尽量避免细胞直接受损的条件下处于干燥、缺氧状态，使其生理活动受到抑制，进而避免在进行胞内提取石斛碱之前菌体再产生代谢产物，确保了胞内提取石斛碱完全来自菌体细胞而非代谢产物，确保验证石斛碱存在的准确性。

使用氯仿将石斛碱溶解出来，将氯仿相进行蒸发过滤既得目标成分石斛碱。本发明首次从石斛兰的内生真菌内及其代谢产物中提取分离出石斛碱，扩大了石斛碱的来源。

优化方案一，所述内生真菌的分离步骤中石斛兰进行表面灭菌的方法是先用75％的酒精消毒30s后取出，再用0.1％的氯化汞消毒28～32min，取出，最后再紫外照射18～22s。

优化方案二，所述内生真菌的分离步骤中所述培养基为马铃薯葡萄糖培养基，培养基的ph值为6.4。

优化方案三，所述内生真菌的分离步骤中孵化温度为25℃，时间为5天。

优化方案四，所述内生真菌的分离步骤分离出的内生真菌菌株接种到另一培养基中，再于25℃孵化14天后进行离心分离，转速为120rpm/min。

优化方案五，所述胞内石斛碱的提取步骤中100mg冻干内生真菌菌体粉末，采用50ml的氯仿浸泡12h后进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min。

优化方案六，所述胞外石斛碱的提取步骤中代谢产物与氯仿的容积比为1:1；浸泡12h后进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min。

附图说明

图1为本发明石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法及石斛碱检测的流程图；

图2本发明中石斛碱检测结果的示意图；

图3为本发明石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取流程图；

图4为本发明采用gc-ms检测80ng/ml标准样品中石斛碱的分子量的色谱图；

图5为本发明采用gc-ms检测20μg/ml标准样品中石斛碱的分子量的色谱图；

图6为本发明采用gc-ms检测空白组(培养基+氯仿)中石斛碱的分子量的色谱图；

图7为本发明采用gc-ms检测石斛兰内生真菌——长柄木霉细胞内石斛碱的分子量的色谱图；

图8为本发明采用gc-ms检测石斛兰内生真菌——尖孢镰刀菌细胞内石斛碱的分子量的色谱图；

图9为本发明采用gc-ms检测石斛兰内生真菌——热带炭疽菌细胞内石斛碱的分子量的色谱图；

图10为本发明采用lc-ms检测20ng/ml标准样品中石斛碱的分子量的色谱图；

图11为本发明采用lc-ms检测80ng/ml标准样品中石斛碱的分子量的色谱图；

图12为本发明采用lc-ms检测空白组(培养基+氯仿)中石斛碱的分子量的色谱图；

图13为本发明采用lc-ms检测石斛兰内生真菌——长柄木霉细胞内石斛碱的分子量的色谱图；

图14为本发明采用lc-ms检测石斛兰内生真菌——尖孢镰刀菌细胞内石斛碱的分子量的色谱图；

图15为本发明采用lc-ms检测石斛兰内生真菌——热带炭疽菌细胞内石斛碱的分子量的色谱图；

图16为本发明采用lc-ms检测石斛兰内生真菌——尖孢镰刀菌细胞外(代谢产物)石斛碱的分子量的色谱图。

图17为本发明采用gc-ms检测石斛兰内生真菌——尖孢镰刀菌细胞外(代谢产物)石斛碱的分子量的色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细的说明：

实施例1：石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，包括以下步骤：

步骤1)、内生真菌的分离：

石斛兰进行表面灭菌处理，处理方式是先用75％的酒精消毒30s后取出，再用0.1％的氯化汞消毒30min，取出，最后再紫外照射20s；

灭菌处理的石斛兰接种到ph值为6.4的马铃薯葡萄糖培养基上，在25℃孵化5天，然后根据形态学和dna测序确定分离出内生真菌菌株；内生真菌菌株再接种到另一ph值为6.4的马铃薯葡萄糖培养基上，于25℃孵化14天后进行离心分离，转速为120rpm/min；

步骤2)、内生真菌菌体和代谢产物的分离：利用水循环多功能真空泵将所述内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥，冷冻干燥使用modulyod-230冷冻干燥机(热电子公司,米尔福米,ma)，669mbar干燥10小时；

步骤3)、胞内石斛碱的提取：秤取100mg冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，并加入50ml的氯仿试剂浸泡12h，然后再转移至离心管中进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min，分离后的氯仿相，使用旋转蒸发器(旋转蒸发器n-1300v-w，eyela，美国)在35℃下蒸发得到残留物，将残留物加入5ml的氯仿试剂溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；

步骤4)、胞外石斛碱的提取：将步骤2)的代谢产物和氯仿按1:1的容积比混合浸泡12h后进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min；分离后的氯仿相在35℃下蒸发得到残留物，将残留物加入5ml的氯仿试剂溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；

步骤5)、步骤3)和步骤4)中过滤后所得的滤渣即为所述石斛碱。

实施例2：石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，包括以下步骤：

步骤1)、内生真菌的分离：

石斛兰进行表面灭菌处理，处理方式是先用75％的酒精消毒30s后取出，再用0.1％的氯化汞消毒28min，取出，最后再紫外照射22s；

灭菌处理的石斛兰接种到ph值为6.4的马铃薯葡萄糖培养基上，在23℃孵化6天，然后根据形态学和dna测序确定分离出内生真菌菌株；内生真菌菌株再接种到另一ph值为6.4的马铃薯葡萄糖培养基上，于25℃孵化14天后进行离心分离，转速为120rpm/min；

步骤2)、内生真菌菌体和代谢产物的分离：利用水循环多功能真空泵将所述内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥，冷冻干燥使用modulyod-230冷冻干燥机(热电子公司,米尔福米,ma)，669mbar干燥10小时；

步骤3)、胞内石斛碱的提取：秤取100mg冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，并加入50ml的氯仿试剂浸泡12h，然后再转移至离心管中进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min，分离后的氯仿相，使用旋转蒸发器(旋转蒸发器n-1300v-w，eyela，美国)在34℃下蒸发得到残留物，将残留物加入5ml的氯仿试剂溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；

步骤4)、胞外石斛碱的提取：将步骤2)的代谢产物和氯仿按1:1的容积比混合浸泡12h后进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min；分离后的氯仿相在34℃下蒸发得到残留物，将残留物加入5ml的氯仿试剂溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；

步骤5)、步骤3)和步骤4)中过滤后所得的滤渣即为所述石斛碱。

实施例3：石斛兰内生真菌胞内和胞外石斛碱的提取方法，包括以下步骤：

步骤1)、内生真菌的分离：

石斛兰进行表面灭菌处理，处理方式是先用75％的酒精消毒30s后取出，再用0.1％的氯化汞消毒32min，取出，最后再紫外照射18s；

灭菌处理的石斛兰接种到ph值为6.4的马铃薯葡萄糖培养基上，在27℃孵化4天，然后根据形态学和dna测序确定分离出内生真菌菌株；内生真菌菌株再接种到另一ph值为6.4的马铃薯葡萄糖培养基上，于25℃孵化14天后进行离心分离，转速为120rpm/min；

步骤2)、内生真菌菌体和代谢产物的分离：利用水循环多功能真空泵将所述内生真菌菌株的菌体和代谢产物进行分离，并将分离后的内生真菌菌体进行冷冻干燥，冷冻干燥使用modulyod-230冷冻干燥机(热电子公司,米尔福米,ma)，669mbar干燥10小时；

步骤3)、胞内石斛碱的提取：秤取100mg冻干后的内生真菌菌体研磨成粉末状，并加入50ml的氯仿试剂浸泡12h，然后再转移至离心管中进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min，分离后的氯仿相，使用旋转蒸发器(旋转蒸发器n-1300v-w，eyela，美国)在36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入5ml的氯仿试剂溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；

步骤4)、胞外石斛碱的提取：将步骤2)的代谢产物和氯仿按1:1的容积比混合浸泡12h后进行离心分离，离心分离的转速为180rpm/min；分离后的氯仿相在36℃下蒸发得到残留物，将残留物加入5ml的氯仿试剂溶解后通过孔径为0.22mm的过滤器进行过滤；

步骤5)、步骤3)和步骤4)中过滤后所得的滤渣即为所述石斛碱。

石斛碱的检测：

实验组：以实施例1获得的胞内石斛碱作为实验组一、胞外石斛碱作为实验组二。

标准石斛碱溶液制备：使用20.0μg/ml的石斛碱存储溶液，加入氯仿试剂稀释成20ng/ml、80ng/ml和20.0μg/ml的标准溶液。(石斛碱标准是购买成都德斯特生物科技有限公司，纯度大于99％)

lc-ms检测石斛碱：通过uhplc系统(thermoscientificdionexultimate3000,usa)进行检测。

色谱柱：c18柱(150×2.1mm)；

流动相为体积比95:5的0.1％甲酸：乙腈，流动相的流速为0.3ml/min；

鞘气流量为0.24mpa，辅助气体流速为15arb，喷雾电压为3.5kv，毛细管温度350℃，辅助气体加热器温度400℃。

通过比较保留时间识别石斛碱，检测出其分子量为264.195。

gc-ms检测石斛碱：

仪器：安捷伦技术6890n网络gc系统；5973网络质量选择检测器；7683b系列喷油器；

色谱柱:毛细管柱安捷伦190915-433hp-5ms(30.0mx250μmx0.25μm)；

初始温度为150℃，保持5min后，升温至250℃，保持5min；入口温度为250℃，探测器温度为250℃；载体：n2，流速：1ml·min-1，样本量为1μl。

比较了石斛兰内生真菌的胞内石斛碱和胞外石斛碱的分子量，并与石斛碱标准品进行了对比，化学参考标准如图4～17所示，结果表明：石斛兰的内生真菌中存在石斛碱，其中胞内石斛碱和胞外石斛碱的分子量均为：gc-ms检测结果为263，lc-ms检测结果为264.195，液体代谢物中的是石斛碱的分子量为:gc-ms检测结果为263，lc-ms检测结果为264.195。