具有分解利用人乳低聚糖能力的动物双歧杆菌及其培养方法和食品或药品与流程

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及具有分解利用人乳低聚糖能力的动物双歧杆菌及其培养方法和食品或药品。更具体地，本发明涉及微生物、培养微生物的方法和食品或药物。
背景技术：
：目前，人们越来越重视健康，对功能性食品的需求也越来越大。其中益生菌类食品及保健品得到了快速的发展。目前市场上应用较多的益生菌种类主要有bifidobacterium(双歧杆菌)、lactobacilluscasei/paracasei(副干酪乳杆菌)和lactobacillusacidphilus(嗜酸乳杆菌)三类。其中bifidobacterium分离自人体肠道，众多实验都验证了其安全性，并且双歧杆菌可使人体肠道更加稳定，这些都使其得到了广泛的认可。双歧杆菌属现有46个种和亚种，与人类密切有关的有青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、蜜蜂双歧杆菌、小链双歧杆菌、齿双歧杆菌等。人乳低聚糖(humanmilkoligosaccharides,hmo)是一类不能被人体消化吸收的水溶性复合物，主要由半乳糖(gal)、葡萄糖(glc)、n-乙酰氨基葡糖(glcnac)、唾液酸(sia)、岩藻糖(fuc)五种基本的单糖以各种糖苷键组合形成。人乳低聚糖是婴幼儿肠道中双歧杆菌生长的主要碳源，在婴幼儿肠道菌群构建过程中发挥了重要作用。双歧杆菌是婴幼儿肠道中的优势微生物，其丰度可达肠道微生物的90％以上，对婴幼儿的生长发育具有重要作用。动物双歧杆菌存活能力强，是婴幼儿常用的益生菌补充剂，筛选可以分解利用人乳低聚糖的动物双歧杆菌菌株，有利于提高菌株在婴幼儿肠道内的存活与定殖，具有重要意义。然而，目前动物双歧杆菌对于人乳低聚糖的利用仍有待研究。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，所述微生物为双歧杆菌(bifidobacteriumanimalissubsp.lactisa6)，于2014年6月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.9273。保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。婴幼儿仅吸食母乳作营养来源时，乳糖被人体吸收，人乳低聚糖由于不能被人体吸收而保留在肠道内，成为了肠道微生物的主要碳源。大部分肠道微生物如球菌、梭菌等因无法利用人乳低聚糖为自身生长供能，于是不能良好生长。而部分双歧杆菌由于含有编码人乳低聚糖水解酶的基因，从而可以分解利用人乳低聚糖为自身生长供能，发挥益生作用。正是由于这一原因，双歧杆菌可作为婴幼儿肠道中的优势微生物，其丰度可达肠道微生物的90％以上。然而，发明人发现，并非所有的双歧杆菌均具有分解利用人乳低聚糖的能力。进而，发明人经过大量实验筛选出一株动物双歧杆菌乳酸亚种bifidobacteriumanimalissubsp.lactisa6(本发明亦成为b.animalisa6)，其具有分解利用人乳低聚糖的能力，可以人乳低聚糖作为碳源，尤其是可以人乳低聚糖作为唯一碳源生长。由此，为人乳低聚糖、动物双歧杆菌以及食品或药品中益生菌和人乳低聚糖的添加等提供了理论依据。根据本发明的实施例，所述微生物还可以具有下列附加技术特征：根据本发明的实施例，所述微生物具有分解利用人乳低聚糖的能力。根据本发明的具体实施例，所述微生物以人乳低聚糖作为碳源。b.animalisa6具有分解利用人乳低聚糖的能力，因此可以人乳低聚糖作为碳源生长，尤其是可以人乳低聚糖作为唯一碳源生长。根据本发明的实施例，所述人乳低聚糖包括2’-岩藻糖乳糖、3-岩藻糖乳糖、乳酰-n-岩藻五糖i、乳酰-n-岩藻五糖ii、乳酰-n-岩藻五糖iii、乳酰-n-岩藻五糖v、乳糖二岩藻四糖、乳糖-n-四糖、乳糖-n-新四糖、6’-唾液酸乳糖和3’-唾液酸乳糖的至少之一，其中，所述2’-岩藻糖乳糖和3-岩藻糖乳糖的利用率为35～50％，所述乳酰-n-岩藻五糖i、乳酰-n-岩藻五糖ii、乳酰-n-岩藻五糖iii和乳酰-n-岩藻五糖v的利用率为15～30％，所述乳糖-n-四糖和乳糖-n-新四糖的利用率为20～30％；所述6’-唾液酸乳糖和3’-唾液酸乳糖的利用率为10～20％。发明人发现，b.animalisa6对于2’-岩藻糖乳糖(本发明亦称作“2’-fl”)、3-岩藻糖乳糖(本发明亦称作“3-fl”)、乳糖-n-四糖(本发明亦称作“lnt”)、乳糖-n-新四糖(本发明亦称作“lnnt”)、乳酰-n-岩藻五糖(本发明亦称作“lnfp”)i/ii/iii/v、6’-唾液酸乳糖(本发明亦称作“6’-sl”)和3’-唾液酸乳糖(本发明亦称作“3’-sl”)的利用率较高，可利用其维持自身生长代谢。根据本发明的实施例，所述微生物以人乳低聚糖作为唯一碳源。由此，本发明的微生物尤其能够针对仅食用母乳的婴儿起到益生作用。根据本发明的实施例，所述微生物以2’-岩藻糖乳糖作为唯一碳源，所述2’-岩藻糖乳糖的利用率为20～30％。发明人发现，b.animalisa6对于2’-岩藻糖乳糖的利用率较高，可利用其维持自身生长代谢。根据本发明的实施例，所述微生物以3-岩藻糖乳糖作为唯一碳源，所述3-岩藻糖乳糖的利用率为20～30％。发明人发现，b.animalisa6对于3-岩藻糖乳糖的利用率较高，可利用其维持自身生长代谢。根据本发明的实施例，所述微生物可降解3-岩藻糖乳糖，降解产物包括乳酸盐和乙酸，所述乳酸盐与乙酸的质量比为1:1～3。发明人发现，b.animalisa6以3-岩藻糖乳糖作为唯一碳源进行培养，培养后的培养物中含有乳酸盐和乙酸，且两者的比例为1:1～3。根据本发明的实施例，所述微生物具有编码岩藻糖苷酶或其功能类似物、l-岩藻糖脱氢酶或其功能类似物、岩藻糖透过酶或其功能类似物、l-岩藻糖酸脱水酶或其功能类似物、l-乳醛还原酶或其功能类似物和/或丙二醇氧化还原酶或其功能类似物的基因。由此，b.animalisa6具有分解利用人乳低聚糖的能力，可以利用人乳低聚糖作为碳源生长，尤其是可以利用人乳低聚糖作为唯一碳源生长。在本发明的另一方面，本发明提出了一种食品或药品。根据本发明的实施例，所述食品或药品含有前面所述的微生物。如前所述，本发明的b.animalisa6具有分解利用人乳低聚糖的能力，可以人乳低聚糖作为碳源，尤其是可以人乳低聚糖作为唯一碳源生长。由此，为人乳低聚糖、动物双歧杆菌以及食品或药品中益生菌和人乳低聚糖的添加等提供了理论依据。本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物所描述的特征和优点，同样适用于该食品或药品，在此不再赘述。在本发明的又一方面，本发明提出了一种培养权前面所述微生物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使所述微生物在含有人乳低聚糖的培养基中进行发酵培养。如前所述，本发明的b.animalisa6具有分解利用人乳低聚糖的能力，可以人乳低聚糖作为碳源，尤其是可以人乳低聚糖作为唯一碳源生长。由此，为人乳低聚糖、动物双歧杆菌以及食品或药品中益生菌和人乳低聚糖的添加等提供了理论依据。根据本发明的实施例，所述培养基包括10～20g/l的人乳低聚糖。发明人发现，b.animalisa6在含有10～20g/l人乳低聚糖的培养基中生长状况良好，对人乳低聚糖的利用率较高。根据本发明的具体实施例，所述人乳低聚糖中含有：1.52～2.48g/l的2’-岩藻糖乳糖和3-岩藻糖乳糖的至少之一；0.66～1.32g/l的乳糖二岩藻四糖；1.75～4.80g/l的乳酰-n-岩藻五糖i、乳酰-n-岩藻五糖ii、乳酰-n-岩藻五糖iii和乳酰-n-岩藻五糖v的至少之一；1.44～1.92g/l的6’-唾液酸乳糖和3’-唾液酸乳糖的至少之一；以及2.26～4.52g/l的乳酰-n-新四糖和乳酰-n-四糖的至少之一。由此，b.animalisa6在上述较优培养基中可以维持自身生长代谢。根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括：黄嘌呤0.01～0.05g/l、天冬氨酸0.1～0.5g/l、脯氨酸0.1～0.5g/l、对氨基苯甲酸0.0001～0.001g/l、乙酸钠1～5g/l、谷氨酸0.1～0.5g/l、丝氨酸0.1～0.5g/l、尼克酸0.001～0.005g/l、柠檬酸三铵0.5～1.5g/l、丙氨酸0.1～0.5g/l、苏氨酸0.1～0.5g/l、叶酸0.0003～0.008g/l、磷酸二氢钾1～5g/l、精氨酸0.1～0.5g/l、色氨酸0.1～0.5g/l、泛酸钙0.001～0.005g/l、磷酸氢二钾1～5g/l、甘氨酸0.1～0.5g/l、酪氨酸0.1～0.5g/l、生物素0.0005～0.002g/l、硫酸镁0.1～1g/l、组氨酸0.1～0.5g/l、缬氨酸0.1～0.5g/l、vb60.001～0.005g/l、硫酸锰0.01～0.1g/l、异亮氨酸0.1～0.5g/l、半胱氨酸盐酸盐0.2～0.8g/l、vb120.0005～0.0015g/l、硫酸亚铁0.01～0.05g/l、亮氨酸0.1～0.5g/l、甲硫氨酸0.1～0.5g/l、核黄素0.001～0.005g/l、吐温800.5～1.5ml、赖氨酸0.1～0.5g/l、苯丙氨酸0.1～0.5g/l以及腺嘌呤0.01～0.05g/l。由此，b.animalisa6可以正常生长代谢，并充分利用人乳低聚糖维持自身生长代谢。根据本发明的实施例，所述发酵培养是在37℃下厌氧培养48～72小时，优选72小时。当培养72小时后，2’-岩藻糖乳糖和3-岩藻糖乳糖的利用率为35～50％，乳酰-n-岩藻五糖i、乳酰-n-岩藻五糖ii、乳酰-n-岩藻五糖iii和乳酰-n-岩藻五糖v的利用率为15～30％，6’-唾液酸乳糖和3’-唾液酸乳糖的利用率为10～20％，乳糖-n-四糖和乳糖-n-新四糖的利用率为20～30％。本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物所描述的特征和优点，同样适用于该培养微生物的方法，在此不再赘述。在本发明的又一方面，本发明提出了一种培养前面所述微生物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使所述微生物在培养基中进行发酵培养，其中，所述培养基包括12～20g/l的2’-岩藻糖乳糖和/或3-岩藻糖乳糖。发明人发现，本发明的b.animalisa6能够以2’-岩藻糖乳糖和/或3-岩藻糖乳糖作为碳源，尤其是可以2’-岩藻糖乳糖或3-岩藻糖乳糖作为唯一碳源生长。由此，为人乳低聚糖、动物双歧杆菌以及婴幼儿食品或药品中益生菌和人乳低聚糖的添加等提供了理论依据。根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括：黄嘌呤0.01～0.05g/l、天冬氨酸0.1～0.5g/l、脯氨酸0.1～0.5g/l、对氨基苯甲酸0.0001～0.001g/l、乙酸钠1～5g/l、谷氨酸0.1～0.5g/l、丝氨酸0.1～0.5g/l、尼克酸0.001～0.005g/l、柠檬酸三铵0.5～1.5g/l、丙氨酸0.1～0.5g/l、苏氨酸0.1～0.5g/l、叶酸0.0003～0.008g/l、磷酸二氢钾1～5g/l、精氨酸0.1～0.5g/l、色氨酸0.1～0.5g/l、泛酸钙0.001～0.005g/l、磷酸氢二钾1～5g/l、甘氨酸0.1～0.5g/l、酪氨酸0.1～0.5g/l、生物素0.0005～0.002g/l、硫酸镁0.1～1g/l、组氨酸0.1～0.5g/l、缬氨酸0.1～0.5g/l、vb60.001～0.005g/l、硫酸锰0.01～0.1g/l、异亮氨酸0.1～0.5g/l、半胱氨酸盐酸盐0.2～0.8g/l、vb120.0005～0.0015g/l、硫酸亚铁0.01～0.05g/l、亮氨酸0.1～0.5g/l、甲硫氨酸0.1～0.5g/l、核黄素0.001～0.005g/l、吐温800.5～1.5ml、赖氨酸0.1～0.5g/l、苯丙氨酸0.1～0.5g/l以及腺嘌呤0.01～0.05g/l。由此，以保证b.animalisa6可以正常生长代谢，并充分利用2’-岩藻糖乳糖、3-岩藻糖乳糖、乳糖二岩藻四糖、6’-唾液酸乳糖、3’-唾液酸乳糖和/或乳酰-n-新四糖。根据本发明的实施例，所述发酵培养是在37℃下厌氧培养48～72小时，优选72小时。当培养72小时后，以2’-岩藻糖乳糖作为唯一碳源的利用率为20～30％，以3-岩藻糖乳糖作为唯一碳源的利用率为20～30％。本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物所描述的特征和优点，同样适用于该培养微生物的方法，在此不再赘述。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本发明一个实施例的微生物在含有16g/lhmo的化学限定培养基中生长曲线图；以及图2显示了根据本发明一个实施例的l-岩藻糖代谢图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1在该实施例中，发明人以本发明的微生物b.animalisa6作阳性对照菌株和另外9株双歧杆菌(表1)作为研究对象，以人乳低聚糖作为唯一碳源，在化学限定培养基中微孔培养，并采用lc-qtof-ms分析了培养液上清中低聚糖的组成及含量，以此评估各菌株对人乳低聚糖的利用程度。表112株双歧杆菌菌株的基本信息菌株编号bifidobacteriumanimaliscicc6250bifidobacteriumanimaliscicc6167bifidobacteriumanimaliscicc21715bifidobacteriumanimaliscicc6174bifidobacteriumanimaliscgmcc1.3003bifidobacteriumanimaliscgmcc1.2226bifidobacteriumanimaliscicc6165bifidobacteriumanimalisa6(本发明)bifidobacteriumlongumcicc6069bifidobacteriumbifidumcicc60711、培养基mrs液体培养基配制：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖20.0g、无水乙酸钠5.0g、无水磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、七水硫酸镁0.58g、四水硫酸锰0.25g、吐温-800.1ml，加蒸馏水至1000ml，调整ph值至6.2-6.4，分装10ml培养液于厌氧管中，充入足量氮气后盖塞隔绝空气，121℃灭菌15分钟。mrs固体培养基在液体培养基的基础上再加琼脂粉15g。化学限定培养基配方如表1所示，其中人乳低聚糖为通过采用醇沉法将母乳去蛋白及绝大部分乳糖后的混合低聚糖。为了避免营养元素损失，培养基中的矿物盐和氨基酸采用121℃，15min灭菌，碳源、维生素和核酸碱基使用0.22μm的微孔滤膜过滤灭菌，使用前混合。表2化学限定培养基配方人乳低聚糖为通过醇沉法去蛋白后，并去除绝大部分乳糖后的混合低聚糖，组成如下表所示，其中2’-fl和3-fl含量为1.52～2.48g/l、ldft含量为0.66～1.32g/l、乳酰-n-岩藻五糖i/ii/iii/v含量为1.75～4.80g/l、6’-sl和3’-sl含量为1.44～1.92g/l、lnt和lnnt含量为2.26～4.52g/l。表2人乳低聚糖的组成注：h：六碳糖(葡萄糖或半乳糖)n：乙酰葡糖胺f：岩藻糖a：唾液酸2、培养方式将保藏在-80℃环境中的双歧杆菌菌株菌粉接入mrs液体培养基厌氧管中活化，然后以1％接种量依次转接到mrs液体培养基厌氧管中，利用第三次传代的活化菌株，在超净台中取9毫升菌液于10ml无菌离心管，4500rpm、4℃条件下离心15min，倒掉上清，加入9ml无菌生理盐水混匀后作为接种液。将接种液按1％接种量分别转接到化学限定培养基中，在无菌环境下，将已接菌培养液移入康宁3599的96孔细胞培养板中，每孔成100微升体系，每个时间点一块板子，每个时间点做3个孔平行，厌氧环境下37℃恒温培养。3、菌株生长情况采用多功能酶标仪完成双歧杆菌生长曲线的测定。如图1所示，大部分双歧杆菌在以16.0g/lhmo作为唯一碳源的化学限定培养基中生长均较缓慢，在54h后达到最大的od600值。其中，b.bifidumcicc6071、b.animalisa6、b.infantiscicc6069相较于其它菌株生长较好，其中b.animalisa6菌株生长相对更好。由此表明，并非所有的微生物，尤其是并非所有的动物双歧杆菌均具有分解利用人乳低聚糖的能力，可以其作为碳源，甚至于是唯一碳源。本发明的b.animalisa6具有较好的分解利用人乳低聚糖能力，在仅以人乳低聚糖作为碳源的培养基中能够进行较好的生长代谢。4、岩藻糖基化中性寡糖的利用b.animalisa6在培养72h后，相较于0h，培养基中2’-fl、3-fl显著减少(p<0.05)，其中b.animalisa6在培养72h后，2’-fl、3-fl的相对含量减少至58.32％，表明其在生长繁殖过程中，对2’-fl、3-fl的利用程度较高。经推测，可能是b.animalisa6基因中有编码岩澡糖苷酶的基因片段，使得该菌株能分解2’-fl、3-fl。然而，b.animaliscicc6250与b.animaliscgmcc1.3003在培养0、24、48、72h后，培养基中2’-fl、3-fl并未显著减少，表明b.animaliscicc6250与b.animaliscgmcc1.3003对2’-fl、3-fl的利用程度不高，这可能是这两株菌株的基因序列中没有编码岩藻糖苷酶或其独特abc转运蛋白的基因片段。b.animalisa6在培养72h后，培养基中乳糖二岩藻四糖(本发明亦称作“ldft”)的绝对峰强度基本没有较大变化，表明这四株双歧杆菌基本不利用ldft。b.animaliscicc6250和b.bifidumcicc6071在培养72h后的培养基中，相较于0h，lnfpi/ii/iii/v的绝对峰强度没有显著变化(p>0.05)，表明其基本不利用lnfpi/ii/iii/v。b.animalisa6菌株培养72h后，培养基中lnfpi/ii/iii/v的绝对峰强度有微弱的下降，lnfpi/ii/iii/v的相对含量减少至79.73％，表明该菌株能够利用lnfpi/ii/iii/v，但利用程度不高。由以上数据表明，对于岩澡糖基化的中性寡糖，b.animalisa6偏向于利用2’-fl、3-fl等糖链较短的hmo。对于ldft、lnfpi/ii/iii/v等这类岩澡糖基化的中性寡糖，b.animalisa6利用程度偏低。5、非岩藻糖基化中性寡糖的利用非岩澡糖基化中性寡糖占hmo的25％左右，其中绝大部分是乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraosr，lnt)、乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraosr，lnnt)。b.animalisa6随培养时间的增加，培养基中非岩澡糖基化中性寡糖的相对含量减少，在培养72h后，lnt、lnnt的相对含量减少至71.86％，表明该菌能够利用lnt和lnnt。6、唾液酸化寡糖的利用b.animaliscicc6250与b.animaliscgmcc1.3003在培养72h后培养基中3’-sl、6’-sl的相对含量并未发生显著变化(p>0.05)，表明其基本不能利用3’-sl、6’-sl。然而，b.animalisa6在培养72h后培养基中3’-sl、6’-sl的相对含量发生显著降低(p<0.05)，相对含量分别减少至85.82％，表明其可以利用3’-sl和6’-sl。实施例2在该实施例中，研究乳糖、葡萄糖、2’-fl、3-fl、lnnt、3’-sl或6’-sl作为唯一碳源对不同微生物生长代谢的影响：菌种、培养基和培养方式与实施例1相同，区别在于，培养基中将人乳低聚糖替换为乳糖、葡萄糖、2’-fl、3-fl、lnnt、3’-sl或6’-sl。1、菌株生长情况b.animalisa6、b.animaliscgmcc1.3003、b.animaliscicc6250三株菌株在葡萄糖作唯一碳源的化学培养基中生长的最好，在乳糖作碳源时则相对较好。不过在以3-fl、2’-fl、lnnt、3’-sl、6’-sl分别作唯一碳源时，b.animaliscgmcc1.3003与b.animaliscicc6250两株菌株不生长。相比之下，b.animalisa6在以3-fl、2’-fl分别作唯一碳源的化学限定培养基中可以生长，而在以lnnt、3’-sl、6’-sl作唯一碳源的化学限定培养基中基本不生长。2、2'-fl与3-fl的利用b.animalisa6在培养0、24、54、72h等不同时间后，培养基中剩余2’-fl、3-fl百分比含量发生显著性变化(p<0.05)，其中剩余2'-fl、3-fl在m/z＝487.35-488.85范围内全扫面液质出峰峰面积随着培养时间的增加而逐渐减小。在以16.0g/l2’-fl为唯一碳源化学限定培养基中培养72h后，b.animalisa6的培养基中2’-fl的剩余百分比含量为72.69％；在以16.0g/l3-fl为唯一碳源化学限定培养基中培养72h后，b.animalisa6的培养基中3-fl的剩余百分比含量为77.43％。并且，在培养后0、24、54、72h等不同时间点中，b.animalisa6都随着时间的增长一直在利用2’-fl、3-fl为菌株生长繁殖提供能量。由此，可以推断出b.animalisa6菌株的基因组中存在代谢2’-fl、3-fl的相关酶。3、lnnt的利用b.animalisa6在含lnnt为唯一碳源化学限定培养基中培养0、24、54、72h等不同时间后，培养基中剩余lnnt的百分比含量未发生显著性变化(p>0.05)，其并不能吸收并分解lnnt。4、3'-sl与6'-sl的利用b.animalisa6在含16.0g/l(w/v)3’-sl、6’-sl为唯一碳源化学限定培养基中培养0、24、54、72h等不同时间后，培养基中剩余3’-sl、6’-sl百分比含量均未发生显著性变化(p>0.05)，这在一定程度上表明b.animalisa6并不能分解利用3’-sl、6’-sl。实施例3在该实施例中，研究双歧杆菌对岩藻糖基化低聚糖的代谢：将菌株于mrs培养基中活化培养后于对数末期收获菌株。在8000×g、4℃条件下离心10min获得菌泥，采用常规方法测定岩藻糖苷酶和乳糖-n-二糖苷酶。1、岩藻糖苷酶活性岩藻糖苷酶是微生物利用唾液酸化人乳低聚糖所需的代谢酶，其可将以α1-2、α1-3、α1-4糖苷键形式连接在葡萄糖或者半乳糖上的岩藻糖切割下来，对菌株利用此类低聚糖提供最开始的酶切，是微生物利用岩藻糖基化人乳低聚糖较关键的一种酶。b.animalisa6中检测到岩藻糖苷酶活性，为6.86±0.57mu/mg蛋白，而b.animaliscgmcc1.3003与b.animaliscicc6250未检测出岩藻糖苷酶活性，表明b.animalisa6菌株有酶切修饰端的岩藻糖苷酶的能力，这在一定程度上表明这该菌株可以利用岩藻糖基化的人乳寡糖。因此初步判定岩藻糖苷酶对动物双歧杆菌菌株利用岩藻糖基化人乳低聚糖具有重要作用。2、乳糖-n-二糖苷酶活性乳糖-n-二糖苷酶最早是由junwada等人从bifidobacteriumbifidumjcm1254菌株中发现，其由lnbb基因编码，属于gh20家族，编码含有信号的1,112个氨基酸残基的蛋白质，是能从人乳低聚糖的主要成分lacto-n-tetraose(galβ1,3glcnacβ1,3galβ1,4glc)中切割下lacto-n-biose(galβ1,3glcnac)的一类分解酶。b.animalisa6中并未检测出乳糖-n-二糖苷酶酶活，由此，无法较好地利用lnnt、lnt等非岩藻糖基化人乳低聚糖。3、动物双歧杆菌对3-fl的代谢终产物本实验以16.0g/l(w/v)3-fl作唯一碳源，在化学限定培养中培养48小时后，取上清液测定代谢终产物。结果表明，b.animalisa6降解3-fl的代谢产物主要是乳酸盐及乙酸，且比例为1:2。其中b.animalisa6培养液中乳酸盐含量为221.8±29.60μg/ml，乙酸含量为516.43±42.03μg/ml。4、双歧杆菌l-岩藻糖代谢途径分析已有研究表明b.longumsubsp.infantis可以将l-岩藻糖代谢为1,2-丙二醇，而双歧杆菌代谢l-岩藻糖的途径尚不明确，目前e.coli与xanthomonascampestrispv.campestrisstr.atcc33913代谢l-岩藻糖的途径比较清楚。发明人参考这两种代谢途径中所必需的代谢酶，并通过ncbi上查找出类似的同源蛋白，获取b.animalisa6的全蛋白序列组，对菌株蛋白序列与代谢酶同源蛋白进行本地blastp鉴定出双歧杆菌代谢l-岩藻糖相关基因。其结果如表3所示。表3双歧杆菌菌株对l-岩藻糖代谢的相关基因注：如上表所示基因id和括号中得到的命中的比特分数和e值。由上表可知，b.animalisa6拥有假定的l-岩藻糖脱氢酶、岩藻糖透过酶、l-岩藻糖酸脱水酶、l-乳醛还原酶、丙二醇氧化还原酶，但l-2-酮基-3-脱氧岩藻糖酸-4-脱氢酶、l-2,4-二酮-3-脱氧岩藻糖酸水解酶、l-岩藻糖酸内酯水解酶等代谢酶的同源蛋白未检测到。因此b.animalisa6对l-岩藻糖的可能代谢途径如图2所示。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。当前第1页1 2 3