一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法与流程

本发明涉及生物医学领域，具体是一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法。

背景技术

骨组织是由成骨细胞分泌细胞外基质,并通过类顶浆方式向细胞外基质分泌基质小泡,小泡中含有矿物质离子,基质小泡在酶的作用下破裂后将矿物质释放到细胞外基质后,在非胶原蛋白的作用下,以纳米羟基磷灰石的形态沉积在胶原纤维中,形成骨的基本结构,矿化胶原纤维，骨的再生和修复一直是医学研究的重点方向。

近年来,体外模拟骨的形成过程,成为研究者们迫切想解决的问题,因为骨组织是完整的三维形态,体外的所使用的细胞大部分为二维培养,丢失许多细胞信息，并未很好的仿生模拟骨的形成过程。

针对背景技术中所提到的问题，本发明旨在提供一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，其包括如下步骤：矿化液的准备、三维微球的制备、细胞微球的矿化以及材料补充手段，所述矿化液的准备实施方式为将4.2mm的k2hpo4加入完全培养基形成矿化培养基a,将9mm的cacl2和0.2mg/ml的聚天冬氨酸加入完全培养基中形成矿化培养基b；所述三维微球制备实施方式为将大鼠来源骨髓间充质干细胞(p3)接种于三维培养板中；所述细胞微球的矿化实施方式为：将三维培养板中的微球放置于矿化培养基进行培养；所述材料补充手段实施方式为采用扫描电镜(sem)和能谱分析仪(edx)观察不同细胞微球的微观形貌以及元素成分、采用原子力显微镜测量不同微球的力学性能、微球内细胞活性的检测、微球内细胞分布的检测以及通过成骨基因的表达分析微球的成骨能力。

作为本发明进一步的方案：所述完全培养基由如下成分配置：20％牛血清,100u/ml青霉素/链霉素,2mm谷氨酰胺,α-mem培养基,55μm的2-甲氧基雌二醇以及55μm的地塞米松磷酸钠，所述α-mem培养基为本领域技术人员公认常识培养基；所述三维微球的制备具体实施方式为：接种于三维培养板中的大鼠来源骨髓间充质干细胞(p3),于37℃,5％的co2的敷箱中完全培养基培养24h后得到微球形态的细胞团块(cs)；所述细胞微球的矿化具体实施方式为：所述矿化培养基由矿化培养基a与矿化培养基b1:1混合制成,所述混合溶液中ca²⁺浓度为4.5mm,po4^3-浓度为2.1mm，混合后的矿化培养基培养细胞培养板中的微球,24h后得到矿化细胞外基质干细胞微球(mecs)。

作为本发明进一步的方案：所述采用扫描电镜(sem)和能谱分析仪(edx)观察不同细胞微球的微观形貌以及元素成分具体实施方式为：将培养5天后的不同细胞微球经3.7％多聚甲醛固定后,经梯度酒精脱水(50％－100％)，喷金后，在15kv电压下观察；所述采用原子力显微镜测量不同微球的力学性能具体实施方式为：在室内常规环境下的测量中，采用derjaguin–muller–toporov(dmt)模型拟合力对分离图的收缩曲线，来计算杨氏模量。每组选用2个样本，每个样本选择3个图，每个图中选5个点，这样每组共30个数据，并采用anova方差分析。

作为本发明进一步的方案：所述微球内细胞活性的检测具体实施方式为：加入5ul室温平衡后的16mmpi储存液至10mlpbs中，涡旋震荡混匀，得到8um的pi溶液；将5ul4um的钙黄素am储液加入到10ml的pi溶液中，涡旋混匀，确保充分混匀；所得到溶液(2um钙黄素am和8umpi)，直接染色细胞,以观察微球内细胞的活性；所述微球内细胞分布的检测具体实施方式为：收集后的细胞微球,经triton-x破膜,羊血清封闭后,孵育鬼笔环肽,并用含4’，6-二乙酰基-2-苯基吲哚(dapi)的封片剂封片，镜下观察；所述通过成骨基因的表达分析微球的成骨能力具体实施方式为：用pbs洗三遍后,提取经过成骨诱导和未经成骨诱导两种微球的rna,通过pcr计算分析成骨相关基因alp、bmp-2的表达情况。

作为本发明进一步的方案：为了验证所制备的矿化细胞外基质细胞微球的生物学功能性，设计了颅骨缺损修复实施方案：

一种颅骨缺损修复实施方案，其包括以下步骤：

1)按照缺损区域准备材料β-tcp和两种微球；

2)将收集的cs、mecs与β-tcp和空白对照分别植入缺损区，明胶海绵覆盖，缝合；

3)8周后处死，micro-ct与组织学检查缺损区成骨情况；

4)用he、masson染色、免疫荧光染色观察。

作为本发明进一步的方案：所述的将收集的cs、mecs与β-tcp和空白对照分别植入缺损区，明胶海绵覆盖，缝合的具体实施方式为：6-8周龄sd大鼠，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剪毛，固定，消毒铺巾；于颅顶部行t形切口，分离筋膜，暴露颅骨骨面；使用种植机(w&h)1200转/min配合环形骨钻(外径4.8mm)于颅顶骨缝两侧分别磨除全层骨组织，无菌生理盐水冷却，压迫止血；取cs、mecs、β-tcp和空白对照，植入缺损部位，缝合皮肤。

作为本发明进一步的方案：所述的micro-ct与组织学检查缺损区成骨情况具体实施方式为：8w后，将样本处死，固定，并用skyscan1174,(bruker)扫描缺损区域(电压53kv,电流810a)，使用nrecon、ctanandctvox(bruker)软件进行重建与数据分析，计算缺损区骨体积，每个样品重复测三次，使用spss对数据进行方差分析；所述的用he、masson染色、免疫荧光染色观察具体实施方式为：取缺损区组织，于含蔗糖的edta脱钙液中脱钙3-4周；梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，硬组织切片机切片，厚度5um，二甲苯-酒精脱蜡至水，苏木精-伊红(he)染色或masson染色，封片，显微镜下观察。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：所述的一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法设计流程合理，其通过生物学培养的方法，进行三维矿化基质培养细胞微球，与传统的体外二维培养的细胞相比，本发明所培养的细胞包含了更多的细胞生物学信息，有很好的仿生模拟骨组织的形成过程，所述的一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法值得在生物医学领域推广与使用。

附图说明

图1为经24小时培养后的细胞团块(cs)和矿化细胞外基质干细胞微球(mecs)的形态结构示意图。

图2为不同细胞微球在扫描电镜(sem)下的微观形貌结构示意图。

图3为不同细胞微球在能谱分析仪(edx)分析下的元素成分组成结果示意图。

图4为cs的杨氏模量和mecs的杨氏模量的条形统计图。

图5为微球内细胞活性的检测的染色分布结果示意图。

图6为微球内细胞分布的染色分布结果示意图。

图7为成骨基因的表达分析的条形统计图。

图8为动物模型示意图。

图9为micro-ct检查缺损区成骨情况的结果示意图。

图10为组织学检查缺损区成骨情况的结果示意图。

图11为用he、masson染色缺损组织的结果示意图。

图12为用免疫荧光染色缺损组织的结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

请参阅图1-12，一种制备矿化细胞外基质细胞微球的方法，其包括如下步骤：矿化液的准备、三维微球的制备、细胞微球的矿化以及材料补充手段，所述矿化液的准备实施方式为将4.2mm的k2hpo4加入完全培养基形成矿化培养基a,将9mm的cacl2和0.2mg/ml的聚天冬氨酸加入完全培养基中形成矿化培养基b；所述三维微球制备实施方式为将大鼠来源骨髓间充质干细胞(p3)接种于三维培养板中；所述细胞微球的矿化实施方式为：将三维培养板中的微球放置于矿化培养基进行培养；所述材料补充手段实施方式为采用扫描电镜(sem)和能谱分析仪(edx)观察不同细胞微球的微观形貌以及元素成分、采用原子力显微镜测量不同微球的力学性能、微球内细胞活性的检测、微球内细胞分布的检测以及通过成骨基因的表达分析微球的成骨能力。

所述完全培养基由如下成分配置：20％牛血清,100u/ml青霉素/链霉素,2mm谷氨酰胺,α-mem培养基,55μm的2-甲氧基雌二醇以及55μm的地塞米松磷酸钠，所述α-mem培养基为本领域技术人员公认常识培养基。

所述三维微球的制备具体实施方式为：接种于三维培养板中的大鼠来源骨髓间充质干细胞(p3),于37℃,5％的co2的敷箱中完全培养基培养24h后得到微球形态的细胞团块(cs)。

所述细胞微球的矿化具体实施方式为：所述矿化培养基由矿化培养基a与矿化培养基b1:1混合制成,所述混合溶液中ca²⁺浓度为4.5mm,po4^3-浓度为2.1mm，混合后的矿化培养基培养细胞培养板中的微球,24h后得到矿化细胞外基质干细胞微球(mecs)。

经过24小时培养后得到的细胞团块(cs)和矿化细胞外基质干细胞微球(mecs)在电子显微镜结构观察下，它们的形态结构如图1所示，观察结果为：琼脂糖培养板中形成大小均一，形态相似的细胞微球，cs与mecs在外观上有较大区别，cs直径小于mecs，cs直径为113.3±20.8um，而mecs直径为246.7±15.3um，几乎填满整个微孔。

所述采用扫描电镜(sem)和能谱分析仪(edx)观察不同细胞微球的微观形貌以及元素成分具体实施方式为：将培养5天后的不同细胞微球经3.7％多聚甲醛固定后,经梯度酒精脱水(50％－100％)，喷金后，在15kv电压下观察，观察结果如图2和3所示，得出结论为：cs呈现出表面光滑的形貌，为细胞形态，而mecs放大后显示细胞(红箭头)周围存在许多纳米(nm)级别的小颗粒(黑箭头)，类似羟基磷灰石，放大后显示，小颗粒直径376.9±59.2nm，散在分布环绕于细胞周围的细胞外基质(ecm)中；cs区域成分基本由c、o元素组成，无其他多余元素存在，证明cs中为细胞成分，而mecs中除了c、o之外，还存在ca、p元素,根据所测区域的元素成分,判断其为羟基磷灰石。

所述采用原子力显微镜测量不同微球的力学性能具体实施方式为：在室内常规环境下的测量中，采用derjaguin–muller–toporov(dmt)模型拟合力对分离图的收缩曲线，来计算杨氏模量。每组选用2个样本，每个样本选择3个图，每个图中选5个点，这样每组共30个数据，并采用anova方差分析；实验数据结果如图4所示，根据图4实验结果得出结论为：cs的杨氏模量为265±33mpa，mecs的杨氏模量为1428±78mpa，mecs的杨氏模量显著高于cs，说明纳米羟基磷灰石大大改善了mecs的硬度以及支持能力，从而提高了mecs的机械力学性能。

所述微球内细胞活性的检测具体实施方式为：加入5ul室温平衡后的16mmpi储存液至10mlpbs中，涡旋震荡混匀，得到8um的pi溶液；将5ul4um的钙黄素am储液加入到10ml的pi溶液中，涡旋混匀，确保充分混匀；所得到溶液(2um钙黄素am和8umpi)，直接染色细胞,以观察微球内细胞的活性；实验结果如图5所示，胞绿染指示活细胞，细胞红染指示死细胞。cs中间部位有大量红染出现，显示为死细胞，而在mecs中未发现大量红染细胞，死细胞占总数的百分比统计如图5，p<0.01。

所述微球内细胞分布的检测具体实施方式为：收集后的细胞微球,经triton-x破膜,羊血清封闭后,孵育鬼笔环肽,并用含4’，6-二乙酰基-2-苯基吲哚(dapi)的封片剂封片，镜下观察；观察结果如图6所示，根据图6得出结论为：singlespheroid中cs与mecs中的细胞核均匀分布，形成具有三维空间结构的球，mecs的f-actin较cs微丝结构清楚，排列致密，表达强度高，说明纳米羟基磷灰石的存在有利于mecs细胞外基质中的细胞骨架的形成及保持良好的状态，由dapi可见，mecs中细胞核的密度要大于cs细胞核的密度，两种微球中的细胞核都均匀分布，不存在部分区域拥挤或分布不均的情况。

所述通过成骨基因的表达分析微球的成骨能力具体实施方式为：用pbs洗三遍后,提取经过成骨诱导和未经成骨诱导两种微球的rna,通过pcr计算分析成骨相关基因alp、bmp-2的表达情况，实验结果如图7所示，根据图7，得出结论：mecs的成骨相关基因alp和bmp-2的表达量在5d和10d在成骨诱导和非诱导组都比cs组高，这一结果说明纳米羟基磷灰石的存在促进了mecs中细胞rna中成骨相关基因的表达量升高，从而提高了mecs的成骨能力。

为了验证所制备的矿化细胞外基质细胞微球的生物学功能性，设计了颅骨缺损修复实施方案：

请参阅图8-11，一种颅骨缺损修复实施方案，其包括以下步骤：

1)按照缺损区域准备材料β-tcp和两种微球；

2)将收集的cs、mecs与β-tcp和空白对照分别植入缺损区，明胶海绵覆盖，缝合；

3)8周后处死，micro-ct与组织学检查缺损区成骨情况；

4)用he、masson染色、免疫荧光染色观察；

所述的将收集的cs、mecs与β-tcp和空白对照分别植入缺损区，明胶海绵覆盖，缝合的具体实施方式为：6-8周龄sd大鼠，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剪毛，固定，消毒铺巾；于颅顶部行t形切口，分离筋膜，暴露颅骨骨面；使用种植机(w&h)1200转/min配合环形骨钻(外径4.8mm)于颅顶骨缝两侧分别磨除全层骨组织，无菌生理盐水冷却，压迫止血；取cs、mecs、β-tcp和空白对照，植入缺损部位，缝合皮肤；实验现象如图8所示。

所述的micro-ct与组织学检查缺损区成骨情况具体实施方式为：8w后，将样本处死，固定，并用skyscan1174,(bruker)扫描缺损区域(电压53kv,电流810a)，使用nrecon、ctanandctvox(bruker)软件进行重建与数据分析，计算缺损区骨体积，每个样品重复测三次，使用spss对数据进行方差分析，所得实验数据结果如图9所示，得出结论为：8w后micro-ct新生骨量的比较:control＝1.71±0.04mm3，β-tcp＝6.33±0.55mm3，cs＝8.05±0.08mm3，mecs＝12.01±0.21mm3组间存在明显的差异，8w后，mecs组缺损区域已大部分修复，明显优于其他组。

所述的用he、masson染色、免疫荧光染色观察具体实施方式为：取缺损区组织，于含蔗糖的edta脱钙液中脱钙3-4周；梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，硬组织切片机切片，厚度5um，二甲苯-酒精脱蜡至水，苏木精-伊红(he)染色或masson染色，封片，显微镜下观察；所得结果如图10和图11所示，得出结论：mecs组可见材料基本降解完全，新生骨填充于整个缺损区域，中心区也有大量成熟新骨生成；免疫荧光染色可见在mecs组中成骨相关基因bmp-2,成血管相关基因cd31的表达量均高于其他组。

上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。