人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法与流程

本发明涉及一种新的干细胞，特别是一种从人体子宫内膜组织中提取的间充质干细胞。本发明还涉及该子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法。

背景技术

干细胞是一种具有自我复制、更新和多向分化潜能的细胞，具有修复受损组织细胞的潜能，近年来已成为疾病治疗和组织工程领域理想的种子细胞，是各种疾病尤其是各种难治性疾病可能的新的有效治疗方法。

根据发育阶段不同，干细胞又分为胚胎干细胞和成体干细胞，其中成体干细胞因其来源广泛，致瘤性相对较低等特点，具有广泛的应用前景。

成体干细胞中的间充质干细胞更因其易分离培养，扩增纯化，免疫原性低等特点，成为干细胞移植及组织工程领域理想的种子细胞。不仅为包括心梗、脑梗等在内的缺血性疾病、神经损伤、神经退行性疾病、其他年龄相关的退行性疾病及其他各种不同疾病的治疗提供了新的希望，同时在医学美容领域，亚健康人群自我保健，乃至老年个体年轻化等方面都提供了新的思路。

研究表明，间充质干细胞具有促进损伤修复、改善多种疾病预后的功能。增殖活力旺盛的年轻间充质干细胞进行移植，能够促使受体对修复干细胞的反应性增强，促进受体的年轻化。间充质干细胞发挥其修复治疗功能需要具备两个要素，一是数量充足，一是包括自我更新增殖等能力在内的功能旺盛活跃。

目前已有的间充质干细胞主要包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等，研究结果显示它们具有较好的促进损伤修复及疾病预防、治疗前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的具有强修复再生能力的人子宫内膜组织来源间充质干细胞。

提供所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，是本发明的另一发明目的。

本发明的目的还在于提供所述新的间充质干细胞的应用。

一种有趣的临床现象给发明人提供了新的重要提示：绝经前女性的心血管事件发生率明显低于同年龄段的男性，但女性这种发病率低的优势会在绝经后丧失。

现有研究结果显示，虽然绝经前后女性激素水平发生巨大变化，但单纯补充激素治疗并不能明显遏制绝经后女性心血管事件发生率增加的态势。另一方面，子宫内膜具有超强的再生能力，其功能层会发生周期性增殖、分泌和脱落，即绝经前女性所具有的生理期周期性变化。以上现象均提示，人体子宫中具有再生能力很强的干细胞。

在绝经前女性、绝经后女性以及男性三种人群中均具有骨髓及脂肪等其他来源的间充质干细胞，而导致上述这种发病率差异的原因，很可能是三种人群中是否具有子宫中再生能力很强的干细胞，同时预示子宫中的这种干细胞具有很强的损伤修复功能。

发明人在前期的小鼠研究中已经观察到，小鼠心梗后，有子宫来源的细胞归巢到心脏缺血损伤局部，参与血管新生及缺血损伤修复，并进而改善缺血心脏的心功能。因此，在人体子宫中是否也存在具有强的修复再生能力的干细胞，以及如何分离、培养出人体子宫中这种强的修复再生能力的干细胞，并将其用于预防和临床治疗领域，是一项非常具有临床应用前景及挑战性的工作。

首先，本发明提出了一种新的具有强修复再生能力的人子宫内膜组织来源间充质干细胞，该子宫内膜组织来源的间充质干细胞能够从人的子宫内膜组织中分离得到。

其次，本发明提供了一种所述新的具有强修复再生能力的人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，通过酶解法消化人体子宫内膜组织获得单细胞悬液后，直接接种于间充质干细胞培养基中进行培养及传代纯化，最终获得了上述新的具有强修复再生能力的间充质干细胞。

具体地，本发明所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法是按照下述步骤进行的。

1）以含250～350µg/ml胶原酶ⅲ和30～50µg/mldnasei的pbs缓冲液为消化液，将所述消化液与人子宫内膜组织按照2～4∶1的体积比混合，37℃水浴震荡消化40～60min后，抽取消化产物上清液，以1∶1的体积比加入10vol%fbs-dmem/f12进行中和，终止消化后获得单细胞悬液。

2）将所述单细胞悬液以200目细胞滤网过滤，1000～1200r/min离心获得细胞团块。

3）在所述细胞团块中加入10vol%fbs-dmem/f12培养基，37℃、5%co2细胞培养箱中培养，经不少于1次的传代培养纯化，分离得到人子宫内膜组织来源间充质干细胞。

进而，本发明还提供了另外一种所述新的具有强修复再生能力的人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法，通过酶解法消化人体子宫内膜组织获得单细胞悬液后，采用密度梯度离心法分离得到包含有间充质干细胞在内的细胞群，接种于间充质干细胞培养基中，经培养及传代纯化，最终获得了上述新的具有强修复再生能力的间充质干细胞。

具体地，本发明所述人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法是按照下述步骤进行的。

1）以含250～350µg/ml胶原酶ⅲ和30～50µg/mldnasei的pbs缓冲液为消化液，将所述消化液与人子宫内膜组织按照2～4∶1的体积比混合，37℃水浴震荡消化40～60min后，抽取消化产物上清液，以1∶1的体积比加入10vol%fbs-dmem/f12进行中和，终止消化后获得单细胞悬液。

2）将所述单细胞悬液以200目细胞滤网过滤，1000～1200r/min离心获得细胞团块。

3）分别配制密度为1.048～1.052g/ml，1.058～1.062g/ml，1.070～1.084g/ml的三种含有percoll和ads的梯度密度缓冲液，分别记为a液、b液和c液，其中b液以0.01g/l酚红标识。

4）在加有a液的离心管中移入等体积的b液，轻轻插入离心管底部缓慢滴加在a液下方，形成两层液体分离的界面。

5）用与a液等体积的c液重悬步骤2）获得的细胞团块，得到细胞悬液，将所述细胞悬液插入离心管底部缓慢加入在b液下方，形成具有无色-红色-无色三层液体清晰分离界面的梯度密度缓冲液。

6）以1300～1700r/min离心，将细胞分散在梯度密度缓冲液的不同密度区域，吸取b液下方和c液上方区域的细胞悬液，放入预先加入15～30ml10vol%fbs-dmem/f12的离心管中，轻柔混匀。

7）1000～1300r/min离心获得细胞团块，加入10～20ml10vol%fbs-dmem/f12，轻柔混匀，1000～1300r/min离心并收集细胞团块。

8）以10vol%fbs-dmem/f12培养基重悬细胞团块，接种于培养瓶或培养皿中，37℃、5%co2细胞培养箱中培养，经不少于1次的传代培养纯化，分离得到人子宫内膜组织来源间充质干细胞。

本发明上述任意一种人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养过程中，除指定温度外，其余操作均在室温下进行。

本发明上述任意一种人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法中，所使用的人子宫内膜组织是以pbs清洗干净，并充分切碎的组织。

其中，任意一种人子宫内膜组织来源间充质干细胞的分离培养方法中，是将所述人子宫内膜组织以所述消化液消化不少于2次，并合并消化得到的细胞悬液。

本发明分离、培养、纯化获取的人子宫内膜间充质干细胞具有很强的增殖能力及迁移分化能力，可以作为制备预防或治疗包括心梗、脑梗、糖尿病肢体远端缺血等在内的缺血性疾病、神经损伤、神经退行性疾病、其他年龄相关的退行性疾病的药物得到应用，也可以用于制备包括医学美容、亚健康人群保健、老年个体年轻化等方面的产品。

体外细胞实验证明，通过上述体外分离培养方法获得的人子宫内膜来源的间充质干细胞可以在体外传代、扩增，具有干细胞自我增殖更新的基本特性。

进而，选择间充质干细胞表面标志物cd90、cd44、cd73、cd105及pe-negative（包括cd34pe、cd11bpe、cd19pe、cd45pe和hla-drpe），对上述体外分离培养的人子宫内膜间充质干细胞进行流式细胞术检测，鉴定结果显示cd90⁺，cd44⁺，cd73⁺，cd105⁺以及cd34^-,cd11b^-,cd19^-,cd45^-，hla-dr^-，相应标志物的阳性率和阴性率均符合间充质干细胞的表面标志物特点。

通过brdu掺入实验、划痕实验及体外诱导分化实验，均证实了本发明获取的人子宫内膜间充质干细胞具有增殖、迁移、诱导分化等功能。

更为重要的是，brdu掺入实验结果显示，与同年龄段、相同代数的骨髓间充质干细胞相比，本发明人子宫内膜间充质干细胞具有更强的增殖能力，即具有更强的活力，具备快速获得更多种子细胞的能力。

附图说明

图1是体外培养人子宫内膜间充质干细胞细胞形态图。

图2是富集的人子宫内膜间充质干细胞的流式鉴定结果柱状图。

图3是人子宫内膜间充质干细胞划痕实验显示迁移能力的结果图。

图4是人子宫内膜间充质干细胞成骨诱导分化的结果图。

图5是人子宫内膜间充质干细胞成脂诱导分化的结果图。

图6是人子宫内膜间充质干细胞brdu掺入实验显示增殖能力的结果图。

具体实施方式

下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1：人子宫内膜间充质干细胞的分离培养。

1）获取人子宫内膜组织，放置于无菌的1×pbs中，尽快移入超净操作台。

2）无菌培养器皿中，将人子宫内膜组织用pbs反复清洗3次，去除掉表面血液等杂物。

3）将清洗干净的人子宫内膜组织充分切碎至小于1mm³。

4）向切碎的人子宫内膜组织中加入3倍体积含300µg/ml胶原酶ⅲ和40µg/mldnasei的pbs消化液，以110rpm的震荡速度在37℃水浴中震荡消化45min，抽取消化产物上清液，以1∶1的体积比加入10%fbs-dmem/f12进行中和以终止消化。

5）在未消化的组织碎片中再次加入消化液，重复步骤4）的消化过程。

6）将上述两步消化及中和后得到的单细胞悬液以200目细胞滤网过滤，1000r/min离心5min，获得细胞团块。

7）以10%fbs-dmem/f12培养基重悬分离获得的细胞团块，计数，37℃、5%co2细胞培养箱中培养。

8）待细胞生长至90%融合时，以含0.25%胰酶和0.02%edta的pbs消化液消化，传代，继续以10%fbs-dmem/f12培养基培养。至第3代，得到纯化的人子宫内膜组织来源间充质干细胞。

实施例2：人子宫内膜间充质干细胞的分离培养。

1）获取人子宫内膜组织，放置于无菌的1×pbs中，尽快移入超净操作台。

2）无菌培养器皿中，将人子宫内膜组织用pbs反复清洗3次，去除掉表面血液等杂物。

3）将清洗干净的人子宫内膜组织充分切碎至小于1mm³。

4）向切碎的人子宫内膜组织中加入3倍体积含300µg/ml胶原酶ⅲ和40µg/mldnasei的pbs消化液，以110rpm的震荡速度在37℃水浴中震荡消化45min，抽取消化产物上清液，以1∶1的体积比加入10%fbs-dmem/f12进行中和以终止消化。

5）在未消化的组织碎片中再次加入消化液，重复步骤4）的消化过程。

6）将上述两步消化及中和后得到的单细胞悬液以200目细胞滤网过滤，1000r/min离心5min，获得细胞团块。

7）配制3种含有percoll和ads的梯度密度缓冲液（a液\b液\c液），各缓冲液密度分别为1.050g/ml，1.060g/ml，1.082g/ml，其中b液以0.01g/l酚红标识为红色。

8）取10mla液，加入新的50ml离心管的底部。

9）将吸有10mlb液的移液管轻轻插入离心管底部，轻柔缓慢滴加，形成两层液体分离的界面。

10）用10mlc液重悬获得的细胞团块得到细胞悬液，吸取细胞悬液，插入离心管底部缓慢加入在b液下方，形成具有无色-红色-无色三层液体清晰分离界面的梯度密度缓冲液。

11）以转速1500r/min，保证加速度减速度为0，室温离心35min。

12）离心完毕后，吸取位于b液下方和c液上方区域的细胞悬液，放入预先加入20ml10%fbs-dmem-f12的50ml离心管中，轻柔混匀。

13）继续在转速1200r/min下，室温离心10min。

14）弃去上清，再加入10ml10%fbs-dmem/f12，轻柔混匀，1200r/min下，室温离心5min得到细胞团块。

15）以10%fbs-dmem/f12培养基重悬分离获得的细胞团块，计数，37℃、5%co2细胞培养箱中培养。

16）细胞生长至90%融合时，以含0.25%胰酶和0.02%edta的pbs消化液消化，传代，继续以10%fbs-dmem/f12培养基培养。至第3代，得到纯化的人子宫内膜组织来源间充质干细胞。

经过上述分离、培养、纯化后的人子宫内膜间充质干细胞，在正常生长状态下，倒置相差显微镜摄片，活细胞培养形态见图1，人子宫内膜间充质干细胞形态趋于一致，呈长梭形，漩涡状生长，具有间充质干细胞的特征性形态。

实施例3：人子宫内膜间充质干细胞的流式鉴定。

1）人子宫内膜间充质干细胞表面标志物选择cd90，cd44，cd73，cd105以及pe-negative（包括cd34pe，cd11bpe，cd19pe，cd45pe和hla-drpe）。

2）取培养至第3代的人子宫内膜间充质干细胞，常规消化后，用上述表面标志物对应抗体染色。

3）流式细胞术检测人子宫内膜间充质干细胞表面标志物。

图2给出了人子宫内膜间充质干细胞的流式结果鉴定，柱状图显示为每个表面标志物的阳性百分率。

图2显示，分离培养的人子宫内膜间充质干细胞呈现cd90⁺，cd44⁺，cd73⁺，cd105⁺以及cd34^-，cd11b^-，cd19^-，cd45^-，hla-dr^-的表面标记物特征，且相应标志物的阳性率和阴性率均符合间充质干细胞的表面标志物特点，即从子宫内膜组织中分离、培养、纯化获得的干细胞是间充质干细胞。

实施例4：人子宫内膜间充质干细胞的迁移能力鉴定。

1）人子宫内膜间充质干细胞接种于6孔板中，10%fbs-dmem/f12培养基中培养至100%融合。

2）无菌枪尖在孔内中央区划一纵向垂线。

3）pbs洗细胞3次，去除划下的细胞碎片。

4）无血清培养基培养24h，镜下观察，拍照。

5）以imagej软件测量不同时间点的划痕宽度，计算细胞迁移率。

图3显示出分离培养获得的人子宫内膜间充质干细胞具有很好的迁移能力，24h迁移率达到77.52%±7.60%。

实施例5：人子宫内膜间充质干细胞成骨诱导分化能力鉴定。

1）将人子宫内膜间充质干细胞以7×10³个细胞/cm²的密度接种到12孔板中，每孔加入1ml10%fbs-dmem/f12培养基，置于37℃、5%co2培养箱中正常培养。

2）24h后，去除培养基，加入bi快速成骨分化培养基1ml，继续置于37℃、5%co2培养箱内培养。

3）每3天更换一次成骨分化培养基，诱导成骨分化2周。

4）诱导分化结束后，行茜素红染色，倒置显微镜下观察并拍照，分析成骨诱导分化能力。

图4显示人子宫内膜间充质干细胞在体外能够完成成骨诱导分化，具有成骨分化潜能。

实施例6：人子宫内膜间充质干细胞成脂诱导分化能力鉴定。

1）将人子宫内膜间充质干细胞以7×10³个细胞/cm²的密度接种到12孔板中，每孔加入1ml10%fbs-dmem/f12培养基，置于37℃、5%co2培养箱中正常培养。

2）待细胞达到100%融合后，去除培养基，加入1ml成脂诱导分化培养基(10%fbs，1µm地塞米松，10µg/ml胰岛素，0.5mm1-methyl-3-isobutylxanthine(ibmx)和1µm罗格列)。

3）每3天更换1次成脂诱导分化培养基，如此反复更换8次。

4）诱导分化结束后，行油红o染色，倒置显微镜下观察并拍照，分析成脂诱导分化能力。

图5显示出人子宫内膜间充质干细胞在体外能够完成成脂诱导分化，具有成脂分化潜能。图4与图5结合提示人子宫内膜间充质干细胞具有多向分化潜能。

实施例7：人子宫内膜间充质干细胞增殖能力鉴定。

1）将人子宫内膜间充质干细胞以7000个/孔的密度接种于加有无菌小圆玻片的24孔板中，细胞贴壁后，用含有10µmbrdu的10%fbs-dmem/f12培养基正常培养24h。

2）吸弃培养基，室温下，pbs洗3次×5min。

3）4%多聚甲醛室温固定30min。

4）弃多聚甲醛，室温下，pbs洗3次×5min。

5）加入2nhcl，37℃水浴中作用10min。

6）加入0.1%tritonx-100-pbs500μl，室温孵育5min。

7）室温下，pbs洗3次×5min。

8）10%山羊血清湿盒中室温封闭1h。

9）brdu一抗用pbs1∶100稀释，湿盒中4℃孵育过夜。

10）室温下，pbs洗3次×5min。

11）tritc标记山羊抗大鼠荧光二抗1∶100稀释，湿盒中37℃避光孵育1h。此步骤之后所有步骤均避光操作，尽量减少荧光淬灭。

12）室温下，pbs洗3次×5min。

13）加入dapi工作液(1μg/ml)，湿盒中室温孵育10min。

14）室温下，pbs洗3次×5min。

15）干燥后，用抗荧光衰减封片剂封片。

16）荧光显微镜观察、摄片。

图6中a和b显示了人子宫内膜间充质干细胞的增殖效果。

以人骨髓间充质干细胞代替人子宫内膜间充质干细胞，重复上述试验过程，得到图6中c和d显示的人骨髓间充质干细胞增殖效果。

图6中，a和c是547nm波长激光激发tritc染料得到的荧光图片，图中显示出的是brdu阳性细胞，即处于增殖状态的细胞。b和d分别是在与a、c相同视野下，358nm波长激光激发下的荧光图片，显示所有细胞核。

图中e的统计结果表示a与b的细胞数百分比、c与d的细胞数百分比，为brdu阳性细胞率，反映细胞的增殖能力。

统计结果显示，人子宫内膜间充质干细胞具有增殖能力，在体外能够快速扩增，24hbrdu阳性细胞率84.67%±2.84%。而同批实验的相同年龄段供体来源、相同代数的人骨髓间充质干细胞的24hbrdu阳性率为70.67%±4.14%，二者比较，差异具有统计学意义(p＜0.05)。

上述试验结果说明，本发明成功分离培养获得的人子宫内膜间充质干细胞的增殖潜能明显高于人骨髓来源的间充质干细胞，即从人子宫内膜组织中分离得到的新型间充质干细胞具有较目前广泛应用的骨髓间充质干细胞更强的增殖能力。

综上所述，本发明两种分离培养方法均可以分离提取到人子宫内膜间充质干细胞。通过活细胞形态观察、细胞表面标志物检测，以及细胞迁移能力、体外诱导分化能力、增殖能力的检测，均证实本发明分离培养获得的人子宫内膜间充质干细胞不仅是一种新的来源的、具有功能的间充质干细胞，而且这种新的间充质干细胞具有更强的增殖能力，能够进行更快的体外扩增而获得足够数量的、活力旺盛的优质间充质干细胞，可以作为组织工程领域优质的种子细胞，靶向包括缺血性疾病、神经损伤、神经退行性疾病、年龄相关的退行性病变等在内的各种疾病进行细胞移植治疗。进而，本发明分离提取的人子宫内膜间充质干细胞还可以用于开发医学美容、亚健康人群保健、老年个体年轻化等方面的产品。