影响棉花纤维伸长和种子填充的基因GhSW12及应用的制作方法

本发明涉及编码糖转运蛋白的基因ghsw12及其应用，具体为一个能够在棉花胚珠和纤维中表达，并影响棉花纤维品质和种子填充的基因ghsw12以及该基因在植物遗传改良上的应用。
背景技术：
：棉花纤维是起始于胚珠表皮细胞的单细胞结构，成熟的棉花纤维长度可达3cm，因此是纺织业最重要的天然原料。棉花纤维细胞的发育过程一般分为四个独立而又相互重叠阶段：纤维的起始、纤维的伸长(初生细胞壁形成)、次生细胞壁的合成以及成熟阶段。棉花纤维主要由多糖(纤维素、半纤维素)、木质素、细胞壁蛋白及一些次生物质(果胶)等组成。研究纤维分化和伸长发育的特点，挖掘潜在功能基因，可以为从事遗传改良和育种提供依据。棉花纤维细胞是由胚珠外种皮表皮层的单细胞伸长突出发育而来的种子毛，其在形态结构上类似于拟南芥的表皮毛，研究表明，拟南芥表皮毛的分化是由bmw(myb-bhlh-wd40)复合体调控，该复合体激活了下游腺毛特异基因的表达从而使腺毛起始分化，棉花纤维细胞的启动机制与拟南芥单细胞表皮毛的发育启动机制非常相似，且复合体基因在棉花中已有报导，如棉花wd重复蛋白家族成员ghttgl和ghttg3能完全回复拟南芥无表皮毛突变ttg1；bhlh类转录因子被证明在纤维细胞分化过程中起作用，myb类家族蛋白在纤维起始和伸长过程中都各自发挥重要作用。除了转录因子，激素类物质也被证明在纤维发育过程中发挥重要作用，需要指出的是纤维的迅速伸长是由高的膨压驱动的，并伴随着初生细胞壁的松弛和高度延伸。其中膨压物质主要是蔗糖，钾离子和苹果酸，同时蔗糖是高速率胼胝质和次生细胞壁纤维素合成所必须的底物，因此蔗糖在棉花胚珠中的运输尤为重要，虽然蔗糖在纤维发育过程中的重要性已得到认可，但是关于蔗糖的转运却研究的甚少，本发明得到了一个编码蔗糖转运蛋白的基因，通过对其功能进行分析，我们发现该基因在棉花纤维发育及种子填充过程中发挥重要作用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一个影响棉花纤维伸长和种子填充的基因ghsw12及其应用；该应用包括ghsw12基因在棉花纤维伸长发育及种子填充中的应用。本发明克隆了一个在纤维快速伸长期表达的基因ghsw12，该基因编码一个含有7个跨膜结构域的膜蛋白。该膜蛋白具有转运蔗糖的功能，受ghmyb2的调控，影响糖在胚珠中的运输，在棉花纤维伸长及种子填充过程中起到重要作用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：第一方面，本发明提供一种核苷酸ghsw12，序列如seqidn0.1所示。该序列通过pcr和酶切的方法从棉花的基因组中进行克隆。第二方面，本发明提供一组用于扩增所述核苷酸ghsw12的引物对，所述引物对的序列如seqidn0.2、seqidn0.3所示。第三方面，本发明提供一个糖转运蛋白ghsw12，是由核苷酸ghsw12编码而成的蛋白质；所述蛋白质具有如seqidn0.4所示的氨基酸序列。第四方面，本发明提供一种重组载体，包含所述核苷酸ghsw12。如实施例1中的连接核苷酸ghsw12的pmd19-t载体等。第五方面，本发明提供一种棉花转化体，干扰了核苷酸ghsw12的表达。第六方面，本发明提供一组用于扩增所述棉花转化体中的核苷酸ghsw12特异片段的引物对，用于所述干扰载体的构建。所述引物对的序列如seqidno.5、seqidno.6所示。第七方面，本发明提供一种所述ghsw12蛋白的亚细胞定位方法。第八方面，本发明提供一种所述核苷酸ghsw12基因表达特征及其编码的蛋白ghsw12作为膜蛋白的应用。更优选的，所述核苷酸ghsw12在棉花花器官、营养器官(根茎叶)及不同发育阶段的胚珠/纤维中的表达模式。更优选的，所述应用具体为蛋白ghsw12作为糖转运蛋白在植物育种中的应用。第九方面，本发明提供一种所述核苷酸ghsw12在棉花遗传改良中的应用。优选的，所述棉花遗传改良包括棉花纤维伸长发育和/或种子填充。第十方面，本发明提供一种所述核苷酸ghsw12的制备方法，具体为生物克隆法；所述生物克隆法具体为：具体步骤为：步骤1、提取棉花rna，进行反转录得到cdna；步骤2、以所述cdna为模板，依次用序列如seqidno.2、seqidno.3所示的引物进行扩增；步骤3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行胶回收，即得核苷酸ghsw12。本发明首次采用分子克隆方法，从陆地棉(gossypiumhirsutum)基因组中分离获得了新的ghsw12糖转运蛋白，并且通过时空组织表达分析证实了它在棉花不同组织器官中的表达模式，通过转基因实验证实其在棉花胚珠及纤维发育中的作用，从而达到了本发明目的。本发明的ghsw12基因具有如下特性：a、在棉花胚珠组织以及纤维细胞中的表达情况十分明确，该基因在棉花上没有报道；b、本发明涉及的基因在棉花纤维伸长过程中起到重要作用，影响棉花纤维品质，并影响种子填充。ghsw12作为ghmyb2的下游糖转运蛋白，在棉花纤维和胚珠发育过程影响糖的运输，为研究调控棉花纤维发育的分子机制提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。附图说明通过阅读参照以下附图对该发明实施例所作的直观注释，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：图1是ghsw12基因干扰载体的构建示意图；图2是转ghsw12蛋白瞬时转化烟草的亚细胞定位分析图；其中，a：ghsw12-yfp；b：fm4-64细胞膜染料；c：明场；d：ghsw12-yfp，fm4-64共定位；标尺＝25μm；图3是qrt-pcr分析ghsw12基因的表达模式；具体为ghsw12在徐州142(xu142)及其突变体(xufl)间不同组织及胚珠不同时期的定量检测差异结果；图4是ghsw12基因干扰植株的表型数据分析和纤维品质数据分析；图5是ghsw12基因启动子区受ghmyb2调控的实验数据；其中，a为ghsw12启动子orf示意图，b为以ghmyb2为特异性抗体的chip-qpcr结果(p1p7为a图表示的特异性片段)，c为酵母单杂结果，d为dual-luc载体示意图，e为dual-luc所用启动子截断示意图及结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、ghsw12基因的克隆(一)陆地棉(gossypiumhirsutum)rna提取及反转(1)陆地棉rna提取实验利用天根多糖多酚rna提取试剂盒抽提棉花rna。以下为具体实验步骤：1.匀浆处理：50-100mg棉花胚珠在液氮中迅速研磨成粉末，加入500μlsl(使用前加入5％的β-巯基乙醇)，立即涡旋剧烈震荡混匀。2.12，000rpm，离心2min。3.将上清液转移至过滤柱cs上(过滤柱cs放在收集管中)，12，000rpm离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的rnase-free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。4.缓慢加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3中，12,000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。5.向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12，000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。6.dnasei工作液的配制：取10μldnasei储存液放入新的rnase-free离心管中，加入70μlrdd溶液，轻柔混匀。7.向吸附柱cr3中央加入80μl的dnasei工作液，室温放置15min。8.向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12，000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。9.向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，12，000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中。10.重复步骤9。11.12,000rpm离心2min，将吸附柱cr3放入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-50μlrnase-freeddh20，室温放置2min，12,000rpm离心1min，得到rna溶液。12.使用nanodrop2000检测rna浓度(浓度：260/280，260/230)和质量。13.totalrna电泳检测，-80℃储存，备用。(2)陆地棉cnda反转实验选用的是产自takara公司的primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒。实验步骤如下：1.去除基因组dna反应：在200μlep管中配制反应体系如下表1所示：表1试剂使用量(μl)5×gdnaeraserbuffer2.0gdnaeraser1.0totalrna1μg的totalrnarnasefreeh20upto10μl冰上混匀后42℃水浴2min，冰上保存备用。2.反转录反应：在200μlep管中配制反应体系如下表2所示：表2试剂使用量(μl)步骤1的反应液10.0primescriptrtenzymemixi1.0rtprimermix1.05×primescriptbuffer24.0rnasefreedh2o4.0冰上混匀后37℃水浴30min，85℃水浴5s终止反应，-20℃保存备用。(二)ghsw12基因序列克隆以棉花基因组cdna为模板，用引物进行扩增，所述引物如seqidn0.2和seqidn0.3所示：seqidn0.2：atggccttaatggcagatcacca，seqidn0.3：tcaaacaggacattcactggaatc；对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条约860bp的dna序列。回收后连接pmd19-7载体，送交生物公司测序检测。该序列即为ghsw12基因，序列见seqno：1。该ghsw12基因编码的蛋白ghsw12，氨基酸序列如seqidno.4所示。实施例2、ghsw12基因植物干扰载体构建用gateway系统进行植物干扰载体的构建，选实施例1中测序正确的菌株提取质粒，作为模板，用带有接头的引物seqidno.5ggggacaagtttgtaaaaaaaagcaggcttcttctgggttggatttgcg和seqidn0.6ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcacaggatacacttctgaggggc进行扩增，用bp重组的方法将pcr产物重组入中间载体pdonrtm，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆送交生物公司测序检测，正确的质粒用于lr反应将ghsw12连接到表达载体phellsgate12。重组体系如下表3：表3试剂用量ghsw12基因回收片段1μlpdonrtm/phellsgate12质粒1μlbp/lrclonse1total5μl16℃连接过夜，转化大肠杆菌dh5a，并挑取阳性克隆进行检测；构建完成的ghsw12基因干扰表达载体见图1。实施例3、干扰ghsw12基因棉花植株的获得(一)phellsgate12-ghsw12载体的遗传转化1)phellsgate12-ghsw12载体转化农杆菌挑选实施例2中测序正确的菌株，提取质粒用于后续农杆菌转化。与转化大肠杆菌类似。取2μl重组质粒加入100μl农杆菌lba4404感受态细胞中，轻轻混匀后冰上静置30分钟。液氮处理3分钟后立即37℃热激10分钟，随后冰浴1～3分钟。加入800μllb无抗性液体培养基，28℃摇床180转/分钟培养3～5小时。4000rpm离心3分钟后弃掉大部分上清液，将菌体悬浮后均匀涂布于固体lb抗性平板上，28℃培养箱，培养2～3天。挑单克隆菌以抗性lb液体培养基28℃摇床培养过夜，取2μl菌液进行pcr扩增检测。2)转化棉花胚轴具体由山西棉花研究所执行。(二)转基因棉花的阳性筛选及纤维品质检测将得到的转基因幼苗于大田种植，pcr检测卡纳抗性基因。图4为干扰ghsw12基因的转基因棉花纤维品质检测图，由图4可知，转基因棉花与对照相比，纤维长度变短，衣指和籽指(100粒种子的重量)下降，说明干扰了ghsw12的表达确实影响了纤维的伸长及种子的填充。实施例4、ghsw12基因的表达特征与亚细胞定位分析4.1ghsw12基因的表达特征选取陆地棉徐州142(xu142)及其突变体(xufl)的营养器官(根、茎、叶)，生殖器官花瓣，柱头，花药及开花后不同天数(dpa，表示开花后，)的棉花胚珠(0，3和6dpa)材料抽提总rna。不同组织的总rna利用试剂盒进行反转录成一链的cdna作为qrt-pcr模板。利用qrt-pcr定量检测ghsw12在棉花中的表达。结果表明ghsw12在根、茎、叶中表达量很低，在花器官中表达量很高，在胚珠的伸长发育阶段有优势表达(图3)。4.2ghsw12蛋白的亚细胞定位分析通过瞬时注射烟草和细胞膜定位染料fm4-64染色，在激光共聚焦显微镜下观察发现，黄色荧光信号和fm4-64染料具有相同的定位，如图2为转ghsw12蛋白瞬时转化烟草的亚细胞定位分析图，由图2可知，ghsw12蛋白在细胞膜上表达。具体实施方法如下：(一)getaway方法构建ghsw12蛋白的亚细胞定位载体(1)含attb接头的基因片断获取首先，设计加入attb接头的基因引物。通过pcr扩增获得含attb接头的基因片断。pcr产物经过凝胶电泳，切胶回收。(2)bp反应构建入门载体利用invitrogrn公司的bpclonase构建入门载体。反应体系如下表4：表416℃反应2个小时。(3)lr反应亚细胞定位载体载体选用pearlygate101vector。酶切体系如下表5：表516℃反应2个小时。(二)转化农杆菌及验证(1)转化农杆菌gv3101，具体转化步骤如下：1)将制备好的农杆菌感受态细胞从-80度冰箱拿出，放在冰上解冻，解冻后每100μl感受态细胞中加入2μl质粒，混匀。冰浴30分钟。2)置液氮中快速冷却约4分钟，后迅速转入37℃金属水浴锅中热激6分钟。3)在超净工作台中加入600μllb无抗性液体培养基。4)恒温培养箱28℃，200转/分钟培养4小时。5)室温下，4000转/分钟，离心10分钟。弃上清，加入200μllb0液体培养基，重悬菌体。6)吸取全部菌液于固体lb抗性平板上用灭过菌的涂布棒均匀涂布。7)倒置平板，28℃恒温培养48小时。8)挑取单菌落，利用抗性液体lb培养基培养并进行pcr验证。(2)菌液pcr验证菌液pcr反应体系如下表6所示：表6试剂体积菌液2.0μl10×pcrbuffer3.0μldntp(2.5mmol/leach)2.0μl上游引物(10μmol/l)1.0μl下游引物(10μmol/l)1.0μlrtaq0.3μlddh20补足30μl体系pcr产物经过琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪检测扩增片断大小是否一致。4.3烟草瞬时转化本实验选用农杆菌注射法进行烟草蛋白亚细胞定位。1)首先，在含有相应抗生素的lb培养基上培养菌株。2)2-3天后挑取单个菌落到含有适量抗生素的lb液体培养基中，28℃培养过夜。3)将培养液以1∶100的体积比例稀释到新的含有适量抗生素的lb液体培养基中28℃培养过夜。4)将菌液慢速离心4000转每分钟*10分钟。将沉淀用mgcl2溶液稀释至od600＝0.6。5)菌液中加入乙酰丁香酮和mes(ph5.6)至终浓度分别为200μm、10mm。室温下静置至少3小时。6)用注射器吸取菌液，缓慢注射到完全展开的平整烟草叶片背面，2-4天后注射的烟草叶片可用于激光共聚焦扫描显微镜观察烟草蛋白亚细胞定位。4.4fm4-64细胞膜染色1)配制工作液：用dmso稀释fm4-64母液，配制成所需要的工作的浓度(5μg/m1)。2)用注射器吸取fm4-64工作液，缓慢注射到已经注射农杆菌的烟草叶片背面，1-2h后注射的烟草叶片可用于激光共聚焦扫描显微镜观察烟草蛋白亚细胞定位。4.5激光共聚焦观察1)制片：用干净的剪刀剪下烟草注射创口附近区域叶片，大小约为0.5*0.5cm2，置于载玻片上加无菌水盖上盖玻片。2)观察：将制作好的切片，倒置于激光共聚焦扫描显微镜的载物台上观察yfp信号。实施例5、ghmyb2转录因子对ghsw12基因调控作用5.1chip-qpcr实验1)首先制备ghmyb2的特异性抗体，由南京金斯瑞公司完成。2)采取棉花开花后9dpa的棉桃，剥离内部胚珠后新鲜固定，放于-80℃待用。3)胚珠细胞裂解后提取核dna，与ghmyb2抗体孵育。4)ghmyb2结合的dna被用于qpcr验证特异性结合的片段。更详细的，具体实验方案参考epiquiktmplantchipkit试剂盒。ghsw12启动子-orf示意图如图5a所示；以ghmyb2为特异性抗体的chip-qpcr结果如图5b所示。5.2y1h实验1)测试片段连接到pabai载体上构成报告载体，bsti酶线性化后转入酵母y1h中。2)ghmyb2构建到pgadt7载体上，转入含有报告基因的酵母体内。3)转化的阳性酵母在抗性培养基上检测互作情况。更详细的，具体酵母单杂交实验参考goldyeastone-hybridlibraryscreeningsystem(clontech，japan)。酵母单杂结果如图5c所示。5.3dual-luc实验1)启动子片段构建到pgreen0800-luc上，称为报告子。2)ghmyb2构建到phb-flag上，称为效应子。3)载体分别转入到农杆菌gv3101中，具体方法见4.2(二)。4)含有报告子和效应子的农杆菌注射烟草，具体方法见4.3；dual-luc载体示意图如图5d，dual-luc所用启动子截断示意图及结果如图5e。5)注射后三天取样测定双荧光素酶活性，具体测定方法参见dual-luciferasereporterassaysystemkit(promega，usa)。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。sequencelisting<110>上海交通大学<120>影响棉花纤维伸长和种子填充的基因ghsw12及应用<130>dag37591<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>861<212>dna<213>gossypiumhirsutum<400>1atggccttaatggcagatcaccattccttggcagttgcatttggtgtcttaggtaacatc60atctcagtccttgtatatctggctccactaccaacattctacagaatatacaaaaagaaa120tcaacggaaagtttccaatcactgccttaccaggtggcattgttcagctcaatgctatgg180ctttattacgcgttaatgaaaaagggtgccttccttctcatcaccatcaactcctttggg240tgtgttgtagagactatatacatagctatgtacatagcttatgcaaccaagaacagcagg300gtgtctgctataaaactttttgtagctatgaacgttgcgctcttctcattcatcattatt360ctcacacacttcctggtgaaaggttcaattcgtgtccaggttctgggttggatttgcgtt420gctatctctgtatctgtgtttgcagcccccttaaacattgtggcacgagtaattcgaaca480aagagcgttgagttcatgcctttcaacttatcatttttcctaacattgagtgcagtaatg540tggtttgcctatggactatttatgaaggacctctgtgtagctcttccaaatgtgataggc600ttcgtcctggggatgctccagatgctgctttacgcaatttacagaaacagcgaaaaggtt660atagaggagaagaagataccagaacaaatgaaaggtgttgtagtgtttagcacattaggc720ccctcagaagtgtatcctgtaggtgtagatattgaaccagatgttaagccaaaagaagat780acgacagagaatgaacagacaggggagcctgacaaaaatgatgtcaaatgcttggaagat840tccagtgaatgtcctgtttga861<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2atggccttaatggcagatcacca23<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3tcaaacaggacattcactggaatc24<210>4<211>286<212>prt<213>gossypiumhirsutum<400>4metalaleumetalaasphishisserleualavalalapheglyval151015leuglyasnileileservalleuvaltyrleualaproleuprothr202530phetyrargiletyrlyslyslysserthrgluserpheglnserleu354045protyrglnvalalaleuphesersermetleutrpleutyrtyrala505560leumetlyslysglyalapheleuleuilethrileasnserphegly65707580cysvalvalgluthriletyrilealamettyrilealatyralathr859095lysasnserargvalseralailelysleuphevalalametasnval100105110alaleupheserpheileileileleuthrhispheleuvallysgly115120125serileargvalglnvalleuglytrpilecysvalalaileserval130135140servalphealaalaproleuasnilevalalaargvalileargthr145150155160lysservalgluphemetpropheasnleuserphepheleuthrleu165170175seralavalmettrpphealatyrglyleuphemetlysaspleucys180185190valalaleuproasnvalileglyphevalleuglymetleuglnmet195200205leuleutyralailetyrargasnserglulysvalilegluglulys210215220lysileprogluglnmetlysglyvalvalvalpheserthrleugly225230235240prosergluvaltyrprovalglyvalaspilegluproaspvallys245250255prolysgluaspthrthrgluasngluglnthrglygluproasplys260265270asnaspvallyscysleugluaspserserglucysproval275280285<210>5<211>49<212>dna<213>人工序列<400>5ggggacaagtttgtaaaaaaaagcaggcttcttctgggttggatttgcg49<210>6<211>52<212>dna<213>人工序列<400>6ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcacaggatacacttctgaggggc52当前第1页12