本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及金钗石斛中一种联苄基成分，及其分离制备和手性拆分的方法和应用。
背景技术
金钗石斛(dendrobiumnobilelindl.)又名吊兰花、扁金钗、小黄草，为兰科石斛属植物，是我国传统名贵中药，贵州道地药材。金钗石斛以茎入药，甘，性微寒，益胃生津，滋阴清热。用于阴伤津亏、口干烦渴、食少干呕，病后虚热、目暗不明。研究表明石斛属植物具有抗肿瘤、增强机体免疫能力、抗氧化、抗血小板凝集及降血糖等作用，有较大的开发和应用前景，符合国家倡导的大健康研究主题。
金钗石斛因其药理作用明显被誉为“民间仙草、植物黄金”，但是其含有的化学成分复杂多样，主要有生物碱、芳香类和倍半萜类化合物，对金钗石斛生物碱部分研究较多，对金钗石斛非生物碱部分研究较少，为了彻底了解金钗石斛的活性成分，对金钗石斛中非生物碱部分的分离和开发显得尤为重要。
技术实现要素：
本发明提供了一种金钗石斛联苄基成分的提取分离和手性拆分方法以及该联苄基成分在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种金钗石斛联苄基成分，其化学名称命为：二聚体石斛素a，
其化学结构式如下：
本发明还提供了其提取分离和手性拆分方法，包括以下步骤。
1)取金钗石斛干燥茎、粉碎后，用体积分数70％～100％乙醇回流提取1～4次，每次提取2～5小时，合并提取液减压浓缩得到乙醇浸膏；
2)将步骤1)中所得乙醇浸膏分散于0.5％～5.0％的盐酸水溶液中，减压过滤得酸水不溶物。该酸水不溶物用乙醇溶解后拌入100～200目硅胶，挥干溶剂后先用石油醚提取脱脂后以石油醚-乙酸乙酯1∶1和乙酸乙酯分别提取1～4次，减压浓缩得各个部分浸膏；
3)将步骤2)中石油醚-乙酸乙酯1∶1部位浸膏合并后通过硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以体积比100:0、9:1、8:2、6:4、0:100进行梯度洗脱，结合tlc检测方法，分为1～9个组分；
4)将步骤3)中组分1～3经mci柱色谱，80％～95％甲醇水等度洗脱，除去色素后经ods柱色谱，30％～90％甲醇-水梯度洗脱，分为2～7个亚组分；
5)将步骤4)中得到的亚组分2～3通过制备hplc分离，检测波长210nm～300nm，流速1.5ml/min～5.5ml/min，用乙腈-水60％～100％等度洗脱，得到化合物：二聚体石斛素a。
6)将步骤5)中得到的二聚体石斛素a通过手性柱色谱分离，检测波长210nm～300nm，流速1.5ml/min～5.5ml/min，20％～90％正己烷-异丙醇等度洗脱，得到一对对映体化合物(+)二聚体石斛素a和(-)二聚体石斛素a。
上述步骤5)用甲醇-水代替乙腈-水等度洗脱，也可以得到基本类似结果。
优选的，所述步骤1)中体积分数85％～95％乙醇回流提取2～3次，每次提取2～3小时。
优选的，所述步骤2)中盐酸水溶液为1.0％～3.0％，提取2～3次。
优选的，所述步骤3)中用石油醚-乙酸乙酯以体积比100:0、9:1、8:2、6:4、0:100进行梯度洗脱，根据极性不同分为1～8个组分。
优选的，所述步骤4)中用50％～80％甲醇梯度度洗脱，分为2～3个亚组分。
优选的，所述步骤5)中所用乙腈-水70％～90％等度洗脱。
优选的，所述步骤6)中所用正己烷-异丙醇30％～80％等度洗脱。
本发明提供的分离提取方法成功从金钗石斛中提取分离了一种新联苄基成分，体外抗肿瘤活性显示该成分可用于制备抗肿癌药物。
附图说明
图1为本发明二聚体石斛素a的结构图；
图2为本发明二聚体石斛素a的1h-nmr光谱图；
图3为本发明二聚体石斛素a的13c-nmr光谱图；
图4为本发明二聚体石斛素a的1h-1hcosy光谱图；
图5为本发明二聚体石斛素a的核磁共振hsqc光谱图；
图6为本发明二聚体石斛素a的核磁共振hmbc光谱图。
具体实施方式
现结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种金钗石斛联苄基成分，其化学名称命为：二聚体石斛素a，
其化学结构式如图1。
本发明所述的新成分的制备方法包括以下步骤：
1)取金钗石斛茎5kg，经干燥、粉碎后，用体积分数90％乙醇回流提取3次，减压浓缩得到乙醇浸膏480g；
2)将步骤1)中乙醇浸膏分散2.0％的盐酸水溶液充分搅拌后，减压过滤得酸水不溶物。该酸水不溶物用乙醇溶解后拌入100～200目硅胶，挥干溶剂后先用石油醚脱脂后以石油醚-乙酸乙酯1∶1和乙酸乙酯分别提取3次，减压浓缩得各个部位浸膏；
3)将步骤2)中石油醚-乙酸乙酯1∶1部位浸膏合并后通过硅胶柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯体积比100:0、9:1、8:2、6:4、0:100进行梯度洗脱，结合tlc检测方法，分为8个组分fr.1～fr.8，以下每个组分都结合tlc分析；
4)将步骤3)中第2个组分经mci柱色谱分离，90％甲醇-水等度洗脱，除去色素后经ods柱色谱分离，30％～90％甲醇-水梯度洗脱，分为4个部分fr.1.1～fr.1.4；
5)将步骤4)中fr.1.3通过制备hplc分离，用体积分数70％乙腈-水，色谱柱用c18，10mm×250mm，流速3.5ml/min洗脱，收集7～8min之间色谱峰，检测波长230nm，得到新化合物：二聚体石斛素a。
实施例2
上述步骤1)中回流提取用的含水乙醇体积分数90％，回流提取3次；步骤2)中提取3次；步骤4)中用体积分数90％的甲醇-水；步骤5)中用体积分数70％的乙腈-水。步骤同实施例1，也可以取得本发明所述的有益效果。
本发明进行tlc检识的条件：展开剂为石油醚-乙酸乙酯系统及二氯甲烷-甲醇系统，显色剂a：紫外灯(254nm)下观察荧光；显色剂b：碘缸显色。
结构鉴定：利用的光谱技术，主要包括核磁共振谱(1h-nmr、13c-nmr、hsqc、hmbc)和质谱分析(hr-esi-ms)鉴定化合物的结构。
该化合物为白色胶状物。hr-esi-ms[m+h]+m/z545.2169(计算值545.2172)，结合nmr谱确定化合物的分子式为c32h32o8,通过光谱技术确定该化合物结构，命名为二聚体石斛素a。其核磁数据见表1。
表1二聚体石斛素a的核磁数据(400/100mhz，cdcl3)
如图1为本发明二聚体石斛素a的结构图；图2为本发明二聚体石斛素a的1h-nmr光谱图；图3为本发明二聚体石斛素a的13c-nmr光谱图；图4为本发明二聚体石斛素a的1h-1hcosy光谱图；图5为本发明二聚体石斛素a的核磁共振hsqc光谱图；图6为本发明二聚体石斛素a的核磁共振hmbc光谱图。
实施例4
测定二聚体石斛素a对人肝癌细胞hepg2的抑制作用。
采用常规mtt法，选取对数生长期的上述细胞，用含10％胎牛血清培养液调节细胞浓度为10×105个/ml，以每孔100μl，接种到96孔平底细胞培养板，置于37℃、5％co2培养箱中培养24h后加入样品样品的浓度分别为0、10、20、40、80、160μg/ml，设3个复孔。在37℃、5％co2培养箱中继续培养48h后弃去带样品的培养液，再补充100μl培养液。然后每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)继续培养4h，离心后弃去上清液，用pbs冲洗2～3次后，再加入含mtt的培养液。终止培养，吸去孔内的培养液。最后，每孔加入100μldmso，低速振荡15min使结晶物充分溶解，将细胞培养板置于酶标仪上，测定490nm波长处的吸光值(a)，即od值，计算生长抑制率。记录实验结果，处理数据。顺铂为阳性对照。生长抑制率＝(1-实验组平均a/对照组平均a值)×100％以样品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制抑制率曲线图，求出抑制率为50％时样品的浓度。二聚体石斛素a对人肝癌细胞hepg2的ic50为3.76±0.32μm。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。