抗海蛇神经毒素的纳米抗体、制备方法及用途与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗海蛇神经毒素的纳米抗体、其制备方法和用途，尤其是在制备海蛇抗毒制剂以及在治疗或预防海蛇咬伤方面的用途。

背景技术：

作为海洋大国，建设一支强有力的海军是我国军队建设的关键问题。然而在沿海海域存在的有毒有害的海洋生物会对海军战士存在潜在威胁，因此对海洋生物伤的防治研究工作对于渡海登陆作战的卫勤保障和医疗工作有重大意义，所以必须尽快着手开展抗海洋生物伤的科学应用研究。

平颏海蛇是一种典型的有毒海洋生物，属眼镜蛇科，俗名棘海蛇，主要分布于东印度洋印澳海域、澳大利亚及菲律宾沿海以及我国台湾岛以及福建、山东、中国香港、海南、广西等地。平颏海蛇咬伤事件时常发生，对这些地区的海洋作业及军事训练构成一定的威胁。

目前对海蛇咬伤的治疗措施主要为排出毒液、减少毒液吸收和抗毒治疗等。虽然尽早注射特种抗毒血清或抗体药物等抗毒制剂是最有效的急救治疗措施，然而直接使用蛇毒毒素免疫动物的方法来获得抗毒血清或筛选多/单克隆抗体的方法具有以下缺点：首先是海蛇捕捉困难，难以获得大量的天然海蛇毒素进行动物免疫，从毒腺中分离神经毒素远不能满足制备抗毒制剂的需要；二是由于蛇毒毒素对动物具有致死性，因此需要进行减毒处理，而减毒毒素往往会丢失其抗原性及表位，导致利用减毒毒素制备的抗毒素中和活性减弱；三是动物来源的抗毒血清等制品容易引起患者强烈的过敏反应，甚至死亡。因此至目前为止，世界上仅有少数国家常备有海蛇抗毒制剂。

随着分子生物学的发展，采用基因工程制备蛇毒毒素的技术已经成熟，开展蛇毒毒素的生物合成及进行抗蛇毒抗体的制备研究已经成为可能。前期本团队已经重组获得了三种海蛇神经毒素，应尽快筛选针对毒素的特异性抗体药物。由于抗体能够高效、特异地与体内和体外的各种抗原蛋白结合，使得抗体不仅能应用于调节免疫系统功能，还可以应用于各种高灵敏的检测方法。

目前，抗体药物是生物技术药物最重要的组成部分，抗体试剂也是医学诊断和生物学研究中最常用到的试剂之。因此，抗体相关的生物产品具有极高的应用前景和商业价值。抗体可以通过多种途径获得，例如：动物或人的血液、细胞培养、注射杂交瘤细胞的鼠的腹水等，但这均需要有效的方法进行纯化，以获得具有应用价值的抗体产品。目前最常用的抗体纯化方法是利用特殊蛋白质与抗体的fc片段之间的高亲和力进行亲和层析。在进行抗体产品的工业生产的过程中亲和层析是其中最为关键的一步，也是整个生产中耗费最高的部分。

针对上述问题，有人发现了纳米抗体，纳米抗体是来源于骆驼科动物或软骨鱼的特殊抗体。研究表明，骆驼体内存在一种天然缺失轻链只含重链的抗体，称为重链抗体。克隆重链抗体的可变区可得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为vhh抗体。vhh抗体的晶体直径仅有2.5nm，长4nm，因此又被称为纳米抗体。纳米抗体的大小只有传统igg型抗体的十分之一，是天然存在的可与抗原结合的最小片段。纳米抗体能被单基因编码，可以很容易的利用微生物进行生产，并具有很高的产率。但目前尚未见针对海蛇神经毒素的纳米抗体的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于，依托上述研究背景，以海蛇神经毒素sn36为例，研究抗海蛇神经毒素的纳米抗体、制备方法和用途，即提供了一种抗海蛇神经毒素的纳米抗体、其制备方法和用途。

本发明的第一方面，提供了一种抗海蛇神经毒素sn36的纳米抗体，该纳米抗体为vhh抗体，具有seqidno.1所示的氨基酸序列，编码该纳米抗体的核苷酸序列如seqidno.2所示。

纳米抗体氨基酸序列(seqidno.1)如下：

dvqlqesggglvqaggslrlscaasgmckvthcframgwwrqapgkerefvatgkvditqawadsvkgrftisrdnakntvylqmnslkpedtavyycyadimyvnfqdendywgqgtqvtvss。

编码该纳米抗体的核苷酸序列(seqidno.2)如下：

gatgtgcagctgcaggaaagcggcggcggcctggtgcaggcgggcggcagcctgcgcctgagctgcgcggcgagcggcatgtgcaaagtgacccattgctttcgcgcgatgggctggtggcgccaggcgccgggcaaagaacgcgaatttgtggcgaccggcaaagtggatattacccaggcgtgggcggatagcgtgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacaccgtgtatctgcagatgaacagcctgaaaccggaagataccgcggtgtattattgctatgcggatattatgtatgtgaactttcaggatgaaaacgattattggggccagggcacccaggtgaccgtgagcagc。

关于抗海蛇神经毒素的纳米抗体的获得，先构建抗海蛇神经毒素的纳米抗体噬菌体展示文库，然后对纳米抗体进行筛选，并采用噬菌体的酶联免疫方法(elisa)筛选特异性阳性克隆，经序列分析后得到具有上述氨基酸序列的vhh纳米抗体，该纳米抗体由fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4区组成。

本发明的第二方面，提供了抗海蛇神经毒素sn36的纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：

(a)全基因合成抗海蛇神经毒素的纳米抗体vhh片段；

(b)采用pcr技术对步骤(a)中获得的抗海蛇神经毒素的纳米抗体vhh片段进行克隆，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到表达载体中，测序验证后确认获得正确的克隆；

(c)将上述表达载体引入宿主细胞内进行融合蛋白的表达。

优选的，在步骤(b)中，pcr所采用的引物序列如下：

本发明中，任何合适的载体都适用，优选为pgem-t、pet32a，pcdna3.1、pee6.4、pee12.4、pdhfr或pdr1，所述表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合dna序列。

本发明中，哺乳动物或昆虫宿主细胞或原核细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达。可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为dh5a、top10、bl21(de3)、tg1之一。

本发明的融合蛋白可在以下细胞中容易地产生：哺乳动物细胞，诸如cho、nso、hek293、bhk或者cos细胞；细菌细胞，诸如大肠杆菌、枯草芽自杆菌或荧光假单胞菌；昆虫细胞，或真菌或酵母细胞，所述细胞使用本领域中己知的技术培养。

本发明中公开的融合蛋白的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达、分离、纯化所述融合蛋白。利用上述方法，可以将抗体纯化为基本均一的物质，例如在sds-page电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变ph等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。

可采用各种蛋白纯化方法，并且此类方法是本领域中己知的并且描述于例如(wilchekandbayer,1990,methodsinenzymology)(scopes,2013,proteinpurification:principlesandpractice)。

通过biacore分析，本发明的纳米抗体具有良好的亲和力，通过小动物实验证明，预先注射本发明纳米抗体的抗体保护组小鼠在注射海蛇神经毒素sn36后，无任何小鼠出现神经中毒症状，连续观察一个月无毒素致死情况。说明本发明的纳米抗体具有优良的抗海蛇毒素的作用。

因此，本发明的第三方面，提供了一种含有抗海蛇神经毒素的纳米抗体的药物组合物。该药物组合物除了包括抗海蛇神经毒素的纳米抗体，还包括药学上可接受的药物载体。

本发明的抗海蛇神经毒素的纳米抗体和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物，从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的抗海蛇神经毒素的纳米抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团，防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。

通常情况下，液体制剂可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，冻干制剂在30℃至少六个月保持稳定。制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂。

对于本发明公开的上述抗海蛇神经毒素的纳米抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中，表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer188)；triton；十二烷基硫酸钠(sds)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；pluronics；monaquattm等，其加入量应使双功能双特异性抗体蛋白的颗粒化趋势最小；溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态；等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一；缓冲液可以为tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含抗海蛇神经毒素的纳米抗体的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗蛇毒效果明显。具体来讲，对海蛇咬伤的预防和/或治疗有效，可以作为抗蛇毒药物使用。

本发明中抗海蛇神经毒素的纳米抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1～1800mg/天。

本发明的第四方面，提供了一种抗海蛇神经毒素的纳米抗体的用途，具体是在制备海蛇抗毒制剂药物中的用途。

本发明的有益保障及效果：

本发明提供了一种抗海蛇神经毒素的纳米抗体、制备方法及其用途，该抗海蛇神经毒素的纳米抗体为vhh抗体，具有seqidno.1所示的氨基酸序列，大小只有传统igg型抗体的十分之一，是天然存在的可与抗原结合的最小片段，能被单基因编码，容易利用微生物进行生产，构建和表达过程简单，并具有很高的产率，有利于实现工业化生产。

此外，通过亲和力分析本发明的纳米抗体具有良好的亲和力，通过小动物实验证明，预先注射本发明纳米抗体的抗体保护组小鼠在注射海蛇神经毒素sn36后，无任何小鼠出现神经中毒症状，连续观察一个月无毒素致死情况，说明本发明的纳米抗体具有优良的抗海蛇毒素的作用，对海蛇咬伤具有优良的预防或治疗作用，具备广阔的临床应用前景。

附图说明

图1为抗海蛇神经毒素的纳米抗体elisa筛选结果。

具体实施方式

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括sambrook,j.,fritsch,e.f.andmaniais，t.(1989)molecularcloning：alaboratorymanual，2^ndedition，coldspringharborlaboratorypress。

实施例1.针对海蛇神经毒素sn36的纳米抗体文库的构建

(1)将0.5mg海蛇神经毒素sn36(胡适等，抗平颏海蛇短链神经毒素全人源单克隆抗体的筛选、制备及生物活性研究.解放军医学杂志42.7(2017):612-616.)抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共连续免疫6次，免疫过程中剌激b细胞表达特异性的纳米抗体；

(2)6次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞200ml并提取总rna；

(3)合成cdna并利用套式pcr扩增vhh，该步骤中所采用的引物序列如表1所示：

表1pcr引物序列

(4)利用限制性内切酶pstl及noti酶切20μgpmecs噬菌体展示载体及10μgvhh并连接两种片段；

(5)将连接产物转化至电转感受态细胞tgl中，构建海蛇神经毒素sn36纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小约为2.5×10⁸。与此同时，通过菌落pcr检测所建文库的插入率达到95％以上。

实施例2.针对海蛇神经毒素sn36的纳米抗体筛选过程

(1)取200ul重组tgl细胞至2ty培养基中培养，期间加入50μl辅助噬菌体vcsm13侵染tgl细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用peg/nacl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；

(2)将溶解在150mmol/lph8.2nahco3中的海蛇神经毒素sn36150ug偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照；

(3)第二天加入100μl的5％bsa，室温封闭2h；

(4)2h后，加入100μl扩增噬菌体(1×10¹¹tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库)，室温作用1小时；

(5)用pbs+0.05％tween20洗5遍，以洗掉结合的噬菌体；

(6)用终浓度为25mg/ml的膜蛋白酶将于海蛇神经毒素sn36特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌tgl细胞，37℃培养lh，产生并收集噬菌体用于下轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，逐步得到富集。

实施例3.用噬菌体的酶联免疫方法(elisa)筛选特异性阳性克隆

(1)从上述3轮筛选后细胞培养板中，挑选200个单菌落分别接种于含100μg/ml氨苄青霉素tb培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mmol/l的iptg，28℃培养过夜；

(2)利用渗透胀破法获得粗提抗体，并将抗体转移至经抗原包被的elisa板上，室温放置lh；

(3)用pbst洗去未结合的抗体，加入100μl经1:2000稀释后的mouseanti-hatagantibody(鼠抗ha抗体，购自科文斯)，在室温放置lh；

(4)用pbst洗去未结合的抗体，加入100μl经1:2000稀释后的anti-mousealkalinephosphataseconjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自于西格玛)，在室温放置1h；

(5)用pbst洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，反应10min后于酶标仪上405波长处，读取吸收值；

(6)当样品孔od值大于对照孔6倍以上时，判定为阳性克隆孔，结果如图1所示，sn36孔的od值明显大于对照孔组；

(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/μl氨苄青霉素的lb培养基中以便提取质粒并进行测序。根据序列比对软件vectornti分析各个克隆株的基因序列，把frl、fr2、fr3、fr4、cdr1、cdr2、cdr3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得1株抗海蛇神经毒素sn36特异性纳米抗体，其抗体的氨基酸序列为seqidno.1，编码抗体的核苷酸序列如seqidno.2所示。

实施例4.海蛇神经毒素sn36特异性纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中的表达及纯化

(1)将上述测序分析所获得的克隆转化到大肠杆菌wk6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；

(2)挑选单个菌落接种在5ml含有氨韦青霉素的lb培养液中，37℃摇床培养过夜；

(3)接种1ml的过夜培养菌种至330mltb培养液中，37℃摇床培养，培养到od600nm值达到0.6-0.9时，加入1miptg，28℃摇床培养过夜；

(4)离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；

(5)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，获得高纯度的纳米抗体，并浓缩富集。

实施例5.biacore分析

将抗多聚组氨酸抗体(abcam)包被在cm5m5芯片(ge公司)上，捕获被检测抗体后，用biacoret100(gehealthcare)检测各融合蛋白的亲和力，具体检测亲和力数值见表2。

表2.biacore分析结果

实施例6.小动物实验

取体重(20±2)g的昆明小鼠30只，实验前禁食12h(不禁水)。将小鼠随机分组，每组10只，雌雄各半，将小鼠分为应用半数致死剂量sn36组，及预先注射纳米抗体10mg/kg药物保护组。另外1组为空白对照组(生理盐水)，小鼠腹腔注射给药，小鼠给药后1h内，出现典型的神经中毒症状，抗体保护组无任何小鼠出现神经中毒症状，连续观察1个月无毒素致死情况，具体结果见表3。

表3抗体抗毒素作用检测结果

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110>中国人民解放军第二军医大学

<120>抗海蛇神经毒素的纳米抗体、制备方法及用途

<130>权利要求书说明书

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>124

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aspvalglnleuglngluserglyglyglyleuvalglnalaglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglymetcyslysvalthrhis

202530

cyspheargalametglytrptrpargglnalaproglylysgluarg

354045

gluphevalalathrglylysvalaspilethrglnalatrpalaasp

505560

servallysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthr

65707580

valtyrleuglnmetasnserleulysprogluaspthralavaltyr

859095

tyrcystyralaaspilemettyrvalasnpheglnaspgluasnasp

100105110

tyrtrpglyglnglythrglnvalthrvalserser

115120

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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cgccaggcgccgggcaaagaacgcgaatttgtggcgaccggcaaagtggatattacccag180

gcgtgggcggatagcgtgaaaggccgctttaccattagccgcgataacgcgaaaaacacc240

gtgtatctgcagatgaacagcctgaaaccggaagataccgcggtgtattattgctatgcg300

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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