一种副球菌及其筛选方法和在合成银纳米颗粒中的应用与流程

本发明涉及微生物技术领域，特别是指一种副球菌及其筛选方法和在合成银纳米颗粒中的应用。

背景技术：

纳米颗粒由于其独特的小尺寸效应、表面(或界面)效应、量子尺寸效应和宏观隧道效应等，在光、电、磁、力学等方面展现出新奇特性，并在工业、农业、医药、诊断和药物输送等领域有着广泛应用。银纳米颗粒具有较大的比表面积，表现出特殊的光学性能和物理特性。由于其独特的抗菌、抗病毒、抗癌、催化、生物传感、药用和光电等特性而备受关注，其中在医疗领域的应用最为成熟。

传统的纳米颗粒合成方法包括物理法和化学法，物理法包括高能球磨法、激光溅射法和激光烧蚀法等，物理法所得产品质量高，但是，其需要复杂的仪器，对设备要求高，同时，其能耗也较高，并且，对银纳米颗粒形貌的调控能力有限，不利于工业化生产；化学法包括液相化学还原法、光化学还原法、微乳液法等，化学法由于其工艺相对简单，操作相对容易，生产成本较低，是较常采用的方法，但是，其所用的封端剂和有机溶剂则不利于纳米颗粒在生物医学领域的应用，并且，会产生严重污染环境的中间产物，对人体和环境有一定的危害。

近年来，纳米材料制备过程绿色化的研究日趋活跃，微生物还原法制备银纳米颗粒具有安全、环保、反应条件温和、所得银纳米颗粒稳定性高等优点，成为具有发展前景的银纳米颗粒制备新方法。利用生物资源可以在相对温和的条件下合成纳米颗粒，其合成过程具有环境友好、绿色低毒等优点；其中在生物合成领域，已经利用细菌和真菌合成了可用作抑菌剂、药物载体和光学受体等的银纳米颗粒。真菌的培养时间相对较长，并且，部分需要将菌丝体进行二次发酵，使得其培养成本增加，时间延长，不利于放大以及工业化生产；细菌合成银纳米颗粒主要采用胞内合成与胞外合成两种方法，由于ag⁺具有较强的杀菌作用，只有少数对ag⁺有较强抗性的菌株才能采用菌液胞内合成的方法，因此，该胞内合成银纳米颗粒的方法具有较大的局限性，同时胞内合成的银纳米颗粒大多吸附在菌体细胞壁表面或内部，后期分离困难；胞外合成法因为选用细菌上层清液，不存在拮抗ag⁺的问题，同时，后期分离方便快捷，利用微生物合成纳米颗粒与微生物分泌到胞外的多聚物的种类和数量密切相关，不同的微生物产生的多聚物不同；这种胞外合成法所用的菌种主要是枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，该菌种在合成银纳米颗粒时活性低，所得银纳米颗粒的粒径较大，使其使用性能受到限制。

技术实现要素：

本发明提出一种副球菌及其筛选方法和在合成银纳米颗粒中的应用，提供一株可以合成银纳米颗粒的新菌株，并对银纳米颗粒的抑菌应用提供一个新的思路，解决了现有技术中用于胞外合成银纳米颗粒的细菌活性低和稳定性差的问题。

本发明的一种副球菌，其技术方案是这样实现的：所述副球菌为paracoccussp.arc7-r13，2018年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15622。

本发明的副球菌是一株可以合成银纳米颗粒的新菌株，其发酵液的上清液可以催化agno3溶液合成银纳米颗粒，活性高，菌种稳定，所得银纳米颗粒的粒径小，分布均匀，应用价值大，并对银纳米颗粒的抑菌应用提供了一个新的思路，为绿色合成银纳米颗粒提供了一株性能优良的菌种资源。

作为一种优选的实施方案，所述副球菌是从北极海洋沉积物中筛选得到的。本发明的副球菌优选是从北极海洋沉积物筛选得到的，这种沉积物的环境条件正好适合该菌种的生长和繁殖，有利于促进该菌种的筛选。

作为一种优选的实施方案，所述副球菌在双氧水浓度为10-15mmol/l的培养基中生长，所述培养基包括以下组分：蛋白胨3-8g/l，酵母粉0.5-2.0g/l，双氧水10-15mmol/l，所述培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为1-3:1混合而成的。本发明的副球菌活性高，具有很好的稳定性，能够在含过氧化氢(即双氧水，分子式h2o2)的培养基中生长，有利于其筛选和分离。

本发明的一种副球菌的筛选方法，其技术方案是这样实现的：包括以下步骤：1)取沉积物，接种于灭菌的富集培养基中，于5-20℃和120-180r/min的转速下，培养1-2h，得到富集培养液；所述富集培养基包括以下组分：蛋白胨3-8g/l，酵母粉0.5-2.0g/l，双氧水10-15mmol/l，所述富集培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为1-3:1混合而成的；2)取富集培养液，采用平板稀释涂布法涂布到筛选培养基中，于5-20℃和120-180r/min的转速下，培养24-72h，然后，取单菌落转移到新的筛选培养基中，划线培养，得到耐双氧水单菌落；所述筛选培养基为所述步骤1)中的富集培养基；3)取耐双氧水单菌落，接种于2216e培养基中，于5-20℃和120-180r/min的转速下，培养24-72h，得纯菌液，即副球菌；所述2216e培养基包括以下组分：蛋白胨3-8g/l，酵母粉0.5-2.0g/l，所述液体培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为1-3:1混合而成的。

本发明的副球菌是沉积物经过富集培育、筛选培育和耐双氧水培育而筛选得到的，特别适合于从北极海洋沉积物中进行筛选，其筛选方法简单，分离效果高，纯度高，成本低，应用范围广。本发明的副球菌采用海水和去离子水混合物配制的培养基，使副球菌的培育环境与其原始生长和繁衍环境一致，充分保证其活性和生长能力。

作为一种优选的实施方案，所述步骤1)中，沉积物的质量为1-2g，富集培养基的体积为3-6ml。根据沉积物的量，选取培养基的用量，沉积物在培养基中充分分散，使其得到快速培养，提高培养效率。

本发明的一种副球菌在合成银纳米颗粒中的应用，其技术方案是这样实现的：包括以下步骤：a)取副球菌，接种于yp培养基中，于5-20℃和120-180r/min的转速下，使其od600为1.5-2.5，得到培养液；yp培育基是含有蛋白胨8-12g/l和酵母粉4-6g/l的水溶液；b)取培养液，于2-6℃和10000-15000r/min的转速下，离心10-20min，过滤，除菌，得到上清液；c)取上清液，添加到硝酸银溶液中，于15-25℃和120-180r/min的转速下，曝光反应2-4d，光照强度为1000-1500lx，过滤，干燥，得到银纳米颗粒；所述上清液与所述硝酸银溶液的体积比为1-2:1，所述硝酸银的浓度为8-10mmol/l。

本发明的副球菌首先在yp培养基中进行培育，使其od600为1.5-2.5，od600指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值，吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度，相应地与样品的透过率t值成反比，在数值上来说，它们之间是对数关系；然后，在低温下离心分离，分离后的上清液可以催化agno3溶液合成银纳米颗粒，活性高，菌种稳定；所得银纳米颗粒的粒径小，分布均匀，应用价值大，并对银纳米颗粒的抑菌应用提供了一个新的思路，为绿色合成银纳米颗粒提供了一株性能优良的菌种资源，该银纳米颗粒的合成过程操作简单，流程短，条件温和，绿色环保。

作为一种优选的实施方案，所述银纳米颗粒具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌活性。本发明的方法合成的纳米颗粒能够抑制抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，具有很好的抑菌作用。

作为一种优选的实施方案，所述银纳米颗粒的形状为球形、椭球形中的任意一种或两种。本发明的银纳米颗粒的形状为球形或椭球形，或者球形和椭球形共同组成，形状规则，形貌均匀。

作为一种优选的实施方案，所述银纳米颗粒的粒径大小为2-15nm。本发明的银纳米颗粒的粒径只有2-15nm，其中大部分为5-10nm，粒径小，比表面积大，颗粒均匀一致，活性好，应用范围广。

作为一种优选的实施方案，所述步骤b)中，过滤时所采用的过滤器大小为0.24、0.22或0.20μm。通过过滤得到银纳米颗粒，过滤器采用的精滤过滤器，通过这种大小的过滤器进行过滤之后，可以使银纳米颗粒最大限度的回收，提高生产效率，同时，避免了杂质的掺入，所得银纳米颗粒纯度高。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的副球菌是一株可以合成银纳米颗粒的新菌株，活性高，菌种稳定，其发酵液的上清液可以催化agno3合成银纳米颗粒，所得银纳米颗粒的粒径小，分布均匀，应用价值大，并对银纳米颗粒的抑菌应用提供了一个新的思路，为绿色合成银纳米颗粒提供了一株性能优良的菌种资源；其是采用北极海洋沉积物经过富集培育、筛选培育和耐双氧水培育而筛选得到的，其筛选方法简单，分离效果高，纯度高，成本低，应用范围广；所得银纳米颗粒呈球形或椭球形，形状规则，粒径为2-15nm，具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基于16srrna基因序列构建的菌株arc7-r13的系统发育树；

图2为本发明的菌株arc7-r13发酵液的上清液合成的银纳米颗粒的紫外全波扫描图；

图3为本发明的菌株arc7-r13发酵液的上清液合成的银纳米颗粒的透射电镜图；

图4为本发明的菌株arc7-r13发酵液的上清液合成银纳米颗粒对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的一种副球菌，所述副球菌为paracoccussp.arc7-r13，2018年4月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15622。

优选地，所述副球菌是从北极海洋沉积物中筛选得到的。

进一步地，所述副球菌在双氧水浓度为10-15mmol/l的培养基中生长，所述培养基包括以下组分：蛋白胨3-8g/l，酵母粉0.5-2.0g/l，双氧水10-15mmol/l，所述培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为1-3:1混合而成的。

本发明的一种副球菌的筛选方法，包括以下步骤：

1)取沉积物，接种于灭菌的富集培养基中，于5-20℃和120-180r/min的转速下，培养1-2h，得到富集培养液；

所述富集培养基包括以下组分：蛋白胨3-8g/l，酵母粉0.5-2.0g/l，双氧水10-15mmol/l，所述富集培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为1-3:1混合而成的；

2)取富集培养液，采用平板稀释涂布法涂布到筛选培养基中，于5-20℃和120-180r/min的转速下，培养24-72h，然后，取单菌落转移到新的筛选培养基中，划线培养，得到耐双氧水单菌落；

所述筛选培养基为所述步骤1)中的富集培养基；

3)取耐双氧水单菌落，接种于2216e培养基中，于5-20℃和120-180r/min的转速下，培养24-72h，得纯菌液，即副球菌；

所述2216e培养基包括以下组分：蛋白胨3-8g/l，酵母粉0.5-2.0g/l，所述液体培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为1-3:1混合而成的。

优选地，所述步骤1)中，沉积物的质量为1-2g，富集培养基的体积为3-6ml。

本发明的一种副球菌在合成银纳米颗粒中的应用，包括以下步骤：

a)取副球菌，接种于yp培养基中，于5-20℃和120-180r/min的转速下，使其od600为1.5-2.5，得到培养液；

yp培育基是含有蛋白胨8-12g/l和酵母粉4-6g/l的水溶液；

b)取培养液，于2-6℃和10000-15000r/min的转速下，离心10-20min，过滤，除菌，得到上清液；

c)取上清液，添加到硝酸银溶液中，于15-25℃和120-180r/min的转速下，曝光反应2-4d，光照强度为1000-1500lx，过滤，干燥，得到银纳米颗粒；

所述上清液与所述硝酸银溶液的体积比为1-2:1，所述硝酸银的浓度为8-10mmol/l。

具体地，所述银纳米颗粒具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌活性。

进一步地，所述银纳米颗粒的形状为球形、椭球形中的任意一种或两种。

优选地，所述银纳米颗粒的粒径大小为2-15nm。

更具体地，所述步骤b)中，过滤时所采用的过滤器大小为0.24、0.22或0.20μm。

实施例一

本发明的一种副球菌的筛选方法，包括以下步骤：

1)取采集到的北极海洋沉积物，接种于灭菌的富集培养基中，该富集培养基包括以下组分：蛋白胨5g/l，酵母粉1.0g/l，双氧水10mmol/l，该富集培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为2:1混合而成的，在15℃和150r/min的转速下，震荡培养2h，得到富集培养液；

2)取富集培养液，采用平板稀释涂布法涂布到筛选培养基中，该筛选培养基为上述步骤1)中使用的富集培养基，于15℃和150r/min的转速下，震荡培养72h，然后，取单菌落转移到新的筛选培养基中，划线培养，得到耐双氧水单菌落；

3)取耐双氧水单菌落，接种于液体培养基中，该液体培养基包括以下组分：蛋白胨5g/l，酵母粉1.0g/l，该液体培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为2:1混合而成的，于15℃和150r/min的转速下，震荡培养24h，得纯菌液，即副球菌，命名为arc7-r13。

实施例二

本发明的一种副球菌的筛选方法，包括以下步骤：

1)取采集到的北极海洋沉积物，接种于灭菌的富集培养基中，该富集培养基包括以下组分：蛋白胨3g/l，酵母粉0.5g/l，双氧水12mmol/l，该富集培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为1:1混合而成的，在5℃和180r/min的转速下，震荡培养1h，得到富集培养液；

2)取富集培养液，采用平板稀释涂布法涂布到筛选培养基中，该筛选培养基为上述步骤1)中使用的富集培养基，于5℃和180r/min的转速下，震荡培养24h，然后，取单菌落转移到新的筛选培养基中，划线培养，得到耐双氧水单菌落；

3)取耐双氧水单菌落，接种于液体培养基中，该液体培养基包括以下组分：蛋白胨3g/l，酵母粉0.5g/l，该液体培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为1:1混合而成的，于5℃和180r/min的转速下，震荡培养72h，得纯菌液，即副球菌，命名为arc7-r13。

实施例三

本发明的一种副球菌的筛选方法，包括以下步骤：

1)取采集到的北极海洋沉积物，接种于灭菌的富集培养基中，该富集培养基包括以下组分：蛋白胨8g/l，酵母粉2.0g/l，双氧水15mmol/l，该富集培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为3:1混合而成的，在20℃和120r/min的转速下，震荡培养1.5h，得到富集培养液；

2)取富集培养液，采用平板稀释涂布法涂布到筛选培养基中，该筛选培养基为上述步骤1)中使用的富集培养基，于20℃和120r/min的转速下，震荡培养36h，然后，取单菌落转移到新的筛选培养基中，划线培养，得到耐双氧水单菌落；

3)取耐双氧水单菌落，接种于液体培养基中，该液体培养基包括以下组分：蛋白胨8g/l，酵母粉2.0g/l，该液体培养基是采用的溶剂为海水和去离子水按照体积比为3:1混合而成的，于20℃和120r/min的转速下，震荡培养36h，得纯菌液，即副球菌，命名为arc7-r13。

将实施例一至实施例三筛选的菌株arc7-r13进行16srrna的pcr扩增，pcr扩增的dna提取采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组提取试剂盒，用27f(5-agagtttgatcctggctcag-3)和1492r(5-ggctaccttgttacgactt-3)这一对引物对其16srrna进行pcr扩增，获得序列后，通过genbank中的blast工具进行序列比对，之后绘制系统进化树以确定该菌的进化位置及名称；结果表明，与其最相近的菌株为副球菌paracoccusmarcusii，16srrna基因序列相似性为100％，因此，判断本发明的方法筛选的菌株arc7-r13为副球菌，图1为菌株arc7-r13的16srrna基因的系统发育树，菌株arc7-r13的16srrna基因序列见序列表。

实施例四

利用实施例一至实施例三筛选的菌株arc7-r13合成银纳米颗粒，包括以下步骤：

1)取副球菌，接种于yp培养基中，yp培育基是含有蛋白胨10g/l和酵母粉5g/l的水溶液，于15℃和150r/min的转速下，使其od600为2.0，得到培养液；

2)取培养液，于4℃和12000r/min的转速下，离心15min，通过0.22μm的过滤器过滤除菌，得到上清液，于4℃下保持备用；

3)取上清液40ml，添加到8mmol/l的硝酸银溶液40ml中，于20℃和150r/min的转速下，曝光反应4d，光照强度为1200lx，过滤，真空干燥，得到银纳米颗粒。

将实施例四合成的银纳米颗粒置于日本岛津公司生产的uv-2500紫外-可见分光光度计上进行光谱扫描分析，在300-700nm范围内每隔1nm进行光谱扫描，检测银纳米颗粒特有的表面等离子体共振峰；由图2可以看出，本发明的实施例四所得的银纳米颗粒在420nm处具有明显的特征吸收峰，这是银纳米颗粒特有等离子体共振峰，这说明本发明的副球菌arc7-r13培育液的上清液催化agno3溶液合成了银纳米颗粒。

将实施例四中得到的银纳米颗粒置于日立高新技术公司生产的ht7700型号的透射电子显微镜上进行透射电镜表征，结果如图3所示，由附图3可知，arc7-r13培养液的上清液合成的银纳米颗粒直径大小分布在2-15nm，大部分银纳米颗粒的粒径大小为5-10nm，呈球形和椭球形，形状规则。

将实施例四中得到的银纳米颗粒进行对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的琼脂扩散抑制实验，分别将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在lb培养基(蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l)平板上划线备用，在划线后的lb培养基平板中用直径为8mm的打孔器打孔，向每孔中加入上述银纳米颗粒，置于37℃培养箱中过夜培养，观察抑菌圈的大小。由附图4可以看出，在合成的银纳米颗粒浓度达到4mg/ml时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌已经出现明显的抑菌圈，此时，抑菌圈直径达到1.2cm左右；随着银纳米颗粒浓度的增大，对病原菌的抑菌效果也随之增大；在合成的银纳米颗粒浓度达到8mg/ml时，抑菌圈直径达到1.6cm左右，在合成的银纳米颗粒浓度达到10mg/ml时，抑菌圈直径达到1.8cm左右；本发明合成的银纳米颗粒对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌活性基本一致。该结果能够明显说明本发明合成的银纳米颗粒对这两株病原菌具有抑菌作用。因此，本发明的银纳米颗粒具有抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的副球菌是一株可以合成银纳米颗粒的新菌株，活性高，菌种稳定，其发酵液的上清液可以催化agno3溶液合成银纳米颗粒，所得银纳米颗粒的粒径小，分布均匀，应用价值大，并对银纳米颗粒的抑菌应用提供了一个新的思路，为绿色合成银纳米颗粒提供了一株性能优良的菌种资源；其是采用北极海洋沉积物经过富集培育、筛选培育和耐双氧水培育而筛选得到的，其筛选方法简单，分离效果高，纯度高，成本低，应用范围广；所得银纳米颗粒呈球形或椭球形，形状规则，粒径为2-15nm，具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>国家海洋局第一海洋研究所

<120>一种副球菌及其筛选方法和在合成银纳米颗粒中的应用

<130>2018

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1466

<212>dna

<213>副球菌(paracoccussp.)

<400>1

tcaacttgagagtttgatcctggctcagaacgaacgctggcggcaggcttaacacatgca60

agtcgagcgagaccttcgggtctagcggcggacgggtgagtaacgcgtgggaacgtgccc120

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