可监控冷藏食品微生物性腐败的时间温度指示剂及其制造方法与流程

本发明涉及可监控冷藏食品微生物性腐败的时间温度指示剂，尤其有关一种利用可影响微生物生长动力学的微生物生长影响物质，使该时间温度指示剂的反应动力学与冷藏食品微生物性腐败动力学偶合的技术。

背景技术：

冷藏食品储藏质量管控为业者长久以来困扰的问题，主要原因为业者难以监控零售端与消费端的产品温度，导致许多产品尚未到达默认的理想保存期限即已不可食用。业者为避免纠纷与维护商誉，一般会以较严苛的标准建立产品储藏期，以降低上述问题发生的机率，故冷藏食品储藏期普遍不长；然而，冷藏食品上架售期过短，因储藏期届满所报废的食品引发的食物浪费已成为全球关注的议题。

许多研究指出，食品质量预测技术可应用于监控食品储藏质量，改善食物浪费的问题，其原理是以食品质量劣变动力学研究为基础，进一步整合可直接/间接测定质量劣变(qualitydeterioration)指标的生物或化学指示剂(indicator)/传感器(sensor)，或可偶合质量劣变动力学的指示剂(如时间-温度指示剂，time-temperatureindicator,tti)、软件、系统，藉以预测或实时监控食品质量。其中，近期许多文献热烈讨论以tti为概念设计的食品质量指示卷标作为替代食品保存期限标示的可行性，期望藉由食品质量指示卷标延长食品于零售端与消费者端的使用寿命，降低食品报废率与减少食物浪费，以及改善因不当食品储藏方式引起的食品安全问题。现有tti商品根据反应原理可分为物理型、化学型、酵素型、微生物型，由于微生物性腐败为大部分冷藏生鲜食品劣变主因，因此有多项微生物型tti已被开发应用于冷藏食品质量监控，然而其应用于食品质量监控的准确度仍有待商榷。

cn102507576a利用乳酸菌鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)gg生长代谢产生乳酸，降低环境ph值，使ph指示剂颜色变化的原理建立tti。tti反应活化能(ea)为固定的数值(59.920kj/mole)。

cn1894420a利用不同乳酸菌lactobacillusfuchuensis(cip107633)、肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)(atcc10880)，或从栖鱼肉杆菌(carnobacteriumpiscicola)筛分自行建立的菌株(cryo-cb001、cryo-cb002)生长代谢产生乳酸，降低环境ph值，使ph指示剂颜色变化的原理，并依据热敏感食品(heat-sensitivefoodproduct)的储藏期调整配方，建立适用于不同温度、不同储藏期的食品质量指示剂。该指示剂配方的调整包含微生物种类、初始菌数、ph值、水活性、及培养基成分，以建立可于不同温度反应，以及具有不同反应终点的各式tti。

至目前为止仍然没有一种技术可依靠单一物质的加入来调整tti的反应动力学，使其耦合所欲冷藏食品的微生物腐败动力学。

技术实现要素：

本发明的一个主要目的在于提供一种可监控冷藏食品微生物性腐败的时间温度指示剂。

本发明依据所欲冷藏食品的腐败微生物生长动力学信息，进一步添加一种可影响微生物生长动力学的微生物生长影响物质(例如酒精)于时间温度指示剂配方中，而开发出一种反应动力学与冷藏食品微生物性腐败动力学偶合的可监控冷藏食品微生物性腐败的时间温度指示剂。

本发明的具体实施方式包括(但不限于)以下申请专利范围所描述的可监控冷藏食品微生物性腐败的时间温度指示剂。

附图说明

图1a显示不同起始菌浓度的粪肠球菌(e.faecalis)生长曲线。

图1b显示不同起始菌浓度的粪肠球菌(e.faecalis)生长培养基orp变化。

图1c显示不同起始菌浓度的粪肠球菌(e.faecalis)生长培养基ph变化。

图2a显示不同酒精浓度于7℃培养温度下对粪肠球菌(e.faecalis)生长速率的影响。

图2b显示不同酒精浓度于12℃培养温度下对粪肠球菌(e.faecalis)生长速率的影响。

图2c显示不同酒精浓度于20℃培养温度下对粪肠球菌(e.faecalis)生长速率的影响。

图2d显示不同酒精浓度于30℃培养温度下对粪肠球菌(e.faecalis)生长速率的影响。

图2e为根据不同温度培养下的生长曲线，并计算最大生长速率，然后应用阿仑尼乌斯方程式(arrheniusequation)描述温度-生长速率的关系的作图，再计算出粪肠球菌(e.faecalis)生长活化能(ea)，显示出不同酒精浓度对粪肠球菌(e.faecalis)生长活化能的影响。

图3a、3b、及3c显示无添加酒精的指示剂于30℃、20℃及7℃反应温度下的颜色变化曲线。图3d为根据不同温度培养下的生长曲线，并计算最大生长速率，然后应用阿仑尼乌斯方程式(arrheniusequation)描述温度-生长速率的关系的作图。

图4a、4b、及4c显示冷藏水饺鲜食于30℃、20℃及7℃反应温度下的腐败微生物生长曲线。图4d为根据不同温度培养下的生长曲线，并计算最大生长速率，然后应用阿仑尼乌斯方程式(arrheniusequation)描述温度-生长速率的关系的作图。

图5a、5b、及5c显示添加5%酒精的指示剂于30℃、20℃及7℃反应温度下的颜色变化曲线。图5d为根据不同温度培养下的生长曲线，并计算最大生长速率，然后应用阿仑尼乌斯方程式(arrheniusequation)描述温度-生长速率的关系的作图。

具体实施方式

本发明是依据冷藏食品的腐败微生物生长动力学信息，开发一种可监控冷藏食品微生物性腐败的指示剂。制造方法包含了指示剂配方设计，以及指示剂反应动力学与冷藏食品微生物性腐败动力学偶合。

首先，需建立冷藏食品腐败指标微生物分析平台，包含样品制备、稀释与平板培养的标准程序，并观察生成菌落(形状、边缘与隆起特征)与相关菌株(形状、大小与结构特征)特征，确立优势菌群(比例占总生菌的30%以上)。进一步以定温培养方式，建立此优势腐败菌于不同温度培养下的生长曲线，并计算最大生长速率，然后应用阿仑尼乌斯方程式(arrheniusequation)描述温度-生长速率的关系，计算此优势腐败菌的生长活化能(ea)，并参考冷藏食品微生物性腐败动力学数据库，做为冷藏食品微生物性腐败的时间温度指示剂的配方调整依据。

本发明的可监控冷藏食品微生物性腐败的时间温度指示剂，包含微生物生长指示物、耐低温微生物、微生物生长支持物质，及微生物生长影响物质。配制时须先将操作器具与使用的液体物质进行灭菌(例如121℃、30分钟)，灭菌结束且相关溶液冷却后，参照配方所示比例加入微生物与生长指示物等，并混合均匀。其中，微生物初始浓度与微生物生长影响物质浓度须参照冷藏食品微生物性腐败动力学数据进行调整，使指示剂微生物生长活化能与优势腐败菌生长活化能差异≦20kj/mol，以及指示剂达反应终点的时间与冷藏食品达微生物性腐败阈值的时间一致(或时间较短，差异幅度≦20%)。

实施例1：冷藏食品微生物性腐败指示剂配方测试与配制方式

首先评估哪一种可食用的耐低温微生物适合用于本发明的时间温度指示剂。被评估的耐低温微生物包含乳杆菌属种(lactobacillusspp.)、链球菌属种(streptococcusspp.)与肠球菌属种(enterococcusspp.)，结果发现粪肠球菌(enterococcusfaecalis)(bcrc10066)为于低温具良好生长活性的菌株，被选择做为本发明时间温度指示剂的耐低温微生物。

将0.5ml不同起始浓度(10²、10³、10⁴、及10⁵cfu/ml)的粪肠球菌(e.faecalis)添加于49.5ml的培养基于37℃下进行培养，该培养基使用经121℃、30分钟灭菌的bacto^tmbrainheartinfusionbroth(bd237500)，培养期间定时观测菌数、培养基ph与氧化还原电位(oxidation-reductionpotential,orp)变化。结果分别被示于图1a、图1b及图1c。图1a、图1b及图1c的结果显示出，粪肠球菌(e.faecalis)培养期间，培养基ph与orp变化的起始点近乎一致，而随着起始菌数浓度提升，ph与orp变化的起始时间有缩短的趋势(从9.5h缩短为5.5h)。由此可知，可选择合适的起始菌数来改变时间温度指示剂反应的终点。另外，粪肠球菌(e.faecalis)培养期间ph值变化范围约介于5.8~6.9之间，orp变化范围则约介于52~-400mv，故以此为依据筛选粪肠球菌(e.faecalis)的生长指示物，并进行后续测试。

以起始浓度10⁵cfu/ml的粪肠球菌(e.faecalis)于37℃下进行培养14小时，其中分别使用不同的ph指示剂及氧化还原指示剂的组合作为微生物生长指示物，以评估颜色变化(颜色的差异度)与食品质量优劣的联结性，其中为了增加整体颜色饱和度，时间温度指示剂中加入脱脂乳(浓度1体积%)。

时间温度指示剂的制备方式如下：

1.按照产品指南配制bd237500培养基，另以脱脂奶粉(7352a，neogen)配制10%脱脂乳。

2.将1配制的培养基与脱脂乳以121℃、30分钟的条件于杀菌釜进行灭菌，灭菌结束后，放凉至室温备用。

3.配制浓度为10mg/ml的ph指示剂或氧化还原指示剂溶液a。

4.配制浓度为10mg/ml的ph指示剂或氧化还原指示剂溶液b。

5.配制浓度为10mg/ml的ph指示剂或氧化还原指示剂溶液c(如果有)。

6.依照表1所列的添加量，将各成分依下列顺序混合：

培养基→10%脱脂乳→指示剂溶液a(10mg/ml)→指示剂溶液b(10mg/ml)→指示剂溶液c(10mg/ml)(如果有)→粪肠球菌(e.faecalis)菌液。

表1

表1的10种微生物生长指示物组合对粪肠球菌(e.faecalis)生长无显著影响(14小时共培养下，微生物可从10⁵cfu/ml增加至10⁹cfu/ml)。评估它们的颜色变化(颜色的差异度)后，决定选用甲基红(methylred)与甲烯蓝(methyleneblue)的微生物生长指示物1，进行后续的实施例。

实施例2：酒精对粪肠球菌(e.faecalis)生长是否有显著影响的评估

依照表2所列的添加量，将各成分依下列顺序混合来评估酒精对粪肠球菌(e.faecalis)生长是否有显著影响。

1.按照产品指南配制bd237500培养基，另以脱脂奶粉(7352a，neogen)配制10%脱脂乳。

2.将1配制的培养基与脱脂乳以121℃、30分钟的条件于杀菌釜进行灭菌，灭菌结束后，放凉至室温备用。

3.甲烯蓝(a18174，alfaaesar)混合无菌水配制浓度为10mg/ml的甲烯蓝溶液。

4.甲基红(36682，alfaaesar)混合95%酒精配制浓度为10mg/ml的甲基红溶液。

5.依照表2所述的添加量，将各成分依下列顺序混合：

bd237500培养基→10%脱脂乳→甲烯蓝溶液(10mg/ml)→甲基红溶液(10mg/ml)→酒精(如需添加)→10²~10⁷cfu/ml粪肠球菌(e.faecalis)菌液(依所需菌数需求添加)。

表2

图2a至图2d分别显示于7℃(a)、12℃(b)、20℃(c)、30℃(d)培养温度下，不同酒精浓度对粪肠球菌(e.faecalis)生长速率的影响。根据不同温度培养下的生长曲线，并计算最大生长速率，然后应用阿仑尼乌斯方程式(arrheniusequation)描述温度-生长速率的关系，计算出不同酒精浓度处理下的粪肠球菌(e.faecalis)生长活化能(ea)。结果被示于图2e。从图2e中可以看出，0%酒精浓度的粪肠球菌(e.faecalis)生长活化能(ea)为111.52kj/mol，当酒精浓度增加至3%时，粪肠球菌(e.faecalis)生长活化能(ea)降至107.72kj/mol，当酒精浓度增加至5%时，粪肠球菌(e.faecalis)生长活化能(ea)降至104.44kj/mol，显示出少量酒精的添加可有效的降低粪肠球菌(e.faecalis)生长活化能(ea)。

实施例3：冷藏食品微生物性腐败指示剂效能测试

利用表2所列的无添加酒精和5%酒精(10⁷cfu/ml粪肠球菌(e.faecalis)菌液)的配方配制指示剂，接着进行指示剂反应动力学与冷藏食品微生物性腐败动力学的偶合。图3a、3b、及3c显示无添加酒精的指示剂于30℃、20℃及7℃反应温度下的颜色变化曲线。根据不同温度培养下的生长曲线，并计算最大生长速率，然后应用阿仑尼乌斯方程式(arrheniusequation)描述温度-生长速率的关系，计算出无添加酒精的指示剂的粪肠球菌(e.faecalis)生长活化能(ea)，结果被示于图3d。

图4a、4b、及4c显示冷藏水饺鲜食于30℃、20℃及7℃反应温度下的腐败微生物生长曲线。根据不同温度培养下的生长曲线，并计算最大生长速率，然后应用阿仑尼乌斯方程式(arrheniusequation)描述温度-生长速率的关系，计算出冷藏水饺鲜食的腐败微生物的生长活化能(ea)，结果被示于图4d。

图5a、5b、及5c显示添加5%酒精的指示剂于30℃、20℃及7℃反应温度下的颜色变化曲线。根据不同温度培养下的生长曲线，并计算最大生长速率，然后应用阿仑尼乌斯方程式(arrheniusequation)描述温度-生长速率的关系，计算出添加5%酒精的指示剂的e.faecalis生长活化能(ea)，结果被示于图5d。

比较所配制的指示剂的反应活化能与测试的冷藏食品(冷藏水饺鲜食)腐败微生物的生长活化能。结果显示，无添加酒精和5%酒精指示剂反应活化能分别为123.46(图3d)和99.29kj/mol(图5d)，冷藏水饺腐败微生物生长活化能为109.32kj/mol(图4d)，显示利用酒精调整指示剂活化能与冷藏水饺的活化能更相近，能更准确监控目标食品的微生物性腐败作用。为确认此影响程度差异于可接受范围内，进一步比较指示剂达反应终点与优势腐败菌生长达腐败阈值所需时间。结果显示，于冷藏温度下，添加5%酒精的指示剂变色起始时间(约280h)(图5c)与冷藏水饺腐败微生物超过阈值(10⁶cfu/ml)时间(约280h)(图4c)十分相近，显示环境温度对两者生长速率的影响程度差异于可接受范围内，同时确认了添加5%酒精的指示剂作为冷藏食品微生物性腐败指示剂的效能。