一种多肽及用作流感疫苗免疫佐剂的用途的制作方法

本发明涉及疫苗领域，尤其涉及流感疫苗免疫佐剂。
背景技术：
流感是常见的呼吸道传染病，可引起较高的死亡率，尤其是新型毒株的出现，可引起世界范围内的流感大流行。接种流感疫苗是预防流感感染和阻止大流行的主要手段。临床中主要的流感疫苗有亚单位疫苗、灭活疫苗以及重组疫苗。这些流感疫苗对于同一亚型的流感病毒能够起到很好的保护作用。使用免疫佐剂增强高纯化疫苗的免疫原性，是增强疫苗免疫效果的有效方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种多肽及用作流感疫苗免疫佐剂的用途。为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：20～30kda酶解多肽：一种酶解多肽，通过如下方法制备得到：步骤s1，将牛骨髓粉末用超纯水溶解；步骤s2，加入碱性蛋白酶酶解，酶解条件为：ph值，8.5；酶解温度，52℃；酶解时间，10小时；酶解完成后于沸水中水浴15min，12000r/min、4℃条件下离心15min，仔细收集上清即为bbm酶解液；步骤s3，选取孔径为30kda和20kda的超滤膜对bbm酶解液超滤，收集20～30kda分子量段的超滤液命名为bbm-2；步骤s4，再将bbm-2组分经孔径为150da的纳滤膜进行脱盐处理，冷冻干燥即得；优选地，牛骨髓粉末的制备方法为：取新鲜的牛骨髓用冷水和温水冲洗3～5次，剔除骨头碎片和肉后存于-20℃使其硬化，加1:5比例液氮粉碎成粉末，-40℃备用。优选地，碱性蛋白酶活力单位为2.4au/g。优选地，步骤s1配成质量浓度为100g/l。优选地，步骤s2中每100g牛骨髓粉末对应添加碱性蛋白酶4.5g。上述酶解多肽用于制备流感疫苗佐剂的用途。10～20kda酶解多肽：一种酶解多肽，通过如下方法制备得到：步骤s1，将牛骨髓粉末用超纯水溶解；步骤s2，加入碱性蛋白酶酶解，酶解条件为：ph值，8.5；酶解温度，52℃；酶解时间，10小时；酶解完成后于沸水中水浴15min，12000r/min、4℃条件下离心15min，仔细收集上清即为bbm酶解液；步骤s3，选取孔径为20kda和10kda的超滤膜对bbm酶解液超滤，收集10～20kda分子量段的超滤液命名为bbm-3；步骤s4，再将bbm-3组分经孔径为150da的纳滤膜进行脱盐处理，冷冻干燥即得；优选地，牛骨髓粉末的制备方法为：取新鲜的牛骨髓用冷水和温水冲洗3～5次，剔除骨头碎片和肉后存于-20℃使其硬化，加1:5比例液氮粉碎成粉末，-40℃备用。优选地，碱性蛋白酶活力单位为2.4au/g。优选地，步骤s1配成质量浓度为100g/l。优选地，步骤s2中每100g牛骨髓粉末对应添加碱性蛋白酶4.5g。上述酶解多肽用于制备流感疫苗佐剂的用途。3～5kda酶解多肽：一种酶解多肽，通过如下方法制备得到：步骤s1，将牛骨髓粉末用超纯水溶解；步骤s2，加入碱性蛋白酶酶解，酶解条件为：ph值，8.5；酶解温度，52℃；酶解时间，10小时；酶解完成后于沸水中水浴15min，12000r/min、4℃条件下离心15min，仔细收集上清即为bbm酶解液；步骤s3，选取孔径为5kda和3kda的超滤膜对bbm酶解液超滤，收集3～5kda分子量段的超滤液命名为bbm-5；步骤s4，再将bbm-5组分经孔径为150da的纳滤膜进行脱盐处理，冷冻干燥即得；优选地，牛骨髓粉末的制备方法为：取新鲜的牛骨髓用冷水和温水冲洗3～5次，剔除骨头碎片和肉后存于-20℃使其硬化，加1:5比例液氮粉碎成粉末，-40℃备用。优选地，碱性蛋白酶活力单位为2.4au/g。优选地，步骤s1配成质量浓度为100g/l。优选地，步骤s2中每100g牛骨髓粉末对应添加碱性蛋白酶4.5g。上述酶解多肽用于制备流感疫苗佐剂的用途。疫苗佐剂在诱导免疫反应中的主要作用是提高机体免疫系统，提高抗原或者是免疫原的免疫应答反应。疫苗佐剂可以激活固有免疫反应以及提高抗原对免疫系统的递承和刺激作用，进而激活适应性免疫应答。本发明提供的牛骨髓酶解多肽a、b、d虽然本身对流感病毒感染鼠无保护作用，但是却可以有效增强ha对流感病毒感染鼠的保护作用，因而可以用作流感疫苗免疫佐剂。现有技术没有报道过本发明技术方案。附图说明图1是各组小鼠肺指数。具体实施方式一、实验材料牛骨髓购于牛羊屠宰场，为西门塔尔牛的骨髓。骨髓样品用冷水和温水冲洗3～5次，剔除骨头碎片和肉后存于-20℃使其硬化，加1:5比例液氮粉碎成粉末，-40℃备用。碱性蛋白酶(alcalase2.4l)：活力单位2.4au/g，丹麦诺维信公司。实验动物为balb/c小鼠，spf级，雌性，13～15g。流感病毒鼠肺适应株a/fm/1/47(h1n1)(下文简称流感病毒fm1)由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，经广州中医药大学热带医学研究所病毒实验室鸡胚扩种后-80℃冷冻保存，ld50为106。influenzaahh1n1(a/california/07/2009)hemagglutinin/haprotein(下文简称ha)购自北京义翘神州生物。二、实验方法1、牛骨髓酶解多肽的制备包括如下步骤：步骤s1，将牛骨髓粉末用超纯水溶解，质量浓度为100g/l；步骤s2，加入碱性蛋白酶酶解，100g牛骨髓粉末对应添加碱性蛋白酶4.5g，酶解条件为：ph值，8.5；酶解温度，52℃；酶解时间，10小时；酶解完成后于沸水中水浴15min，12000r/min、4℃条件下离心15min，仔细收集上清即为bbm酶解液；步骤s3，选取孔径为30kda、20kda、10kda、5kda和3kda的超滤膜对bbm酶解液超滤，收集>30kda、20～30kda、10～20kda、5～10kda、3～5kda、<3kda六个分子量段的超滤液分别命名为bbm-1、bbm-2、bbm-3、bbm-4、bbm-5、bbm-6；步骤s4，再分别将bbm-2、bbm-3、bbm-4、bbm-5组分经孔径为150da的纳滤膜进行脱盐处理，冷冻干燥，分别得到酶解多肽a、b、c、d。2、动物分组以及给药balb/c小鼠随机分成10组，每组20只，分别为：空白对照组：正常饲养；ha组：滴鼻接种0.2μgha；酶解多肽a组：滴鼻接种50mg/kg酶解多肽a；酶解多肽b组：滴鼻接种50mg/kg酶解多肽b；酶解多肽c组：滴鼻接种50mg/kg酶解多肽c；酶解多肽d组：滴鼻接种50mg/kg酶解多肽d；ha+酶解多肽a组：滴鼻接种0.2μgha+50mg/kg酶解多肽a；ha+酶解多肽b组：滴鼻接种0.2μgha+50mg/kg酶解多肽b；ha+酶解多肽c组：滴鼻接种0.2μgha+50mg/kg酶解多肽c；ha+酶解多肽d组：滴鼻接种0.2μgha+50mg/kg酶解多肽d。连续免疫3周，每周一次。第4周乙醚轻度麻醉小鼠，以10ld50流感病毒fm1滴鼻感染小鼠，每组10只。连续观察6d后，每组处死10只小鼠，采集标本。每组剩余10只小鼠以15ld50流感病毒fm1滴鼻感染小鼠，观察15d，记录感染鼠的死亡情况。3、肺指数测定攻毒后第6天，每组取10只小鼠，摘取肺组织，生理盐水洗两次，滤纸吸干，称取肺重。计算肺指数。计算公式为：肺指数＝小鼠肺重(g)/小鼠体重(g)×100％。4、保护实验感染15ld50流感病毒fm1后，每组剩余10只小鼠观察15d，记录感染鼠死亡情况和生存时间，评价牛骨髓酶解多肽作为流感疫苗佐剂对感染鼠的保护效果。5、统计学方法用spss17.0统计软件进行数据统计，计量资料以均值±标准差表示，进行多组数据计量资料单因素方差分析，以p＜0.05为差异有统计意义。三、实验结果1、牛骨髓酶解多肽作为流感疫苗佐剂对肺指数的影响结果如表1和图1所示。肺指数是反映肺病病理变化程度的重要指标。流感病毒感染引起肺部炎症变化，大量炎症细胞浸润，使得肺重量增加。与空白对照组相比，酶解多肽a～d组感染鼠肺指数明显增加，表明流感病毒引起肺部炎症变化，单独滴鼻免疫酶解多肽a～d没有发挥保护作用。接种ha后，肺指数有所下降，与ha组相比，ha+酶解多肽a组、ha+酶解多肽b组、ha+酶解多肽d组肺指数进一步下降且差异显著，ha+酶解多肽c组与ha组肺指数无显著差异，表明酶解多肽a、b、d增强了ha的保护作用，酶解多肽c不明显。表1各组小鼠肺指数肺指数空白对照组0.78±0.23ha组1.42±0.29酶解多肽a组1.85±0.34酶解多肽b组1.81±0.35酶解多肽c组1.96±0.31酶解多肽d组1.93±0.38ha+酶解多肽a组0.93±0.22ha+酶解多肽b组0.86±0.24ha+酶解多肽c组1.39±0.37ha+酶解多肽d组0.91±0.202、牛骨髓酶解多肽作为流感疫苗佐剂对感染鼠生存率的影响结果如表2所示。单独滴鼻免疫酶解多肽a～d没有发挥保护作用，但是酶解多肽a、b、d可以有效增强ha的保护作用，而酶解多肽c对ha的增强作用不明显。表2各组小鼠生存率5d存活率(％)10d存活率(％)15d存活率(％)空白对照组100100100ha组10000酶解多肽a组000酶解多肽b组1000酶解多肽c组000酶解多肽d组000ha+酶解多肽a组10010090ha+酶解多肽b组100100100ha+酶解多肽c组100100ha+酶解多肽d组10010090疫苗佐剂在诱导免疫反应中的主要作用是提高机体免疫系统，提高抗原或者是免疫原的免疫应答反应。疫苗佐剂可以激活固有免疫反应以及提高抗原对免疫系统的递承和刺激作用，进而激活适应性免疫应答。本发明提供的牛骨髓酶解多肽a、b、d虽然本身对流感病毒感染鼠无保护作用，但是却可以有效增强ha对流感病毒感染鼠的保护作用，因而可以用作流感疫苗免疫佐剂。现有技术没有报道过本发明技术方案。当前第1页12