本发明属于海洋微生物发酵领域，尤其是涉及一种利用产毒海洋亚硫酸杆菌发酵制备石房蛤毒素的方法。
背景技术
麻痹性贝类毒素（paralyticshellfishposoning，psp）属于胍胺类毒素，在已知赤潮毒素中毒性最强、分布最广、威胁性最大、引发毒害事件最频繁。主要包括石房蛤毒素（saxitoxin，stx）及其衍生物，是典型的钠离子通道阻断剂。stx在有害赤潮检测、神经生物学、医学诊断、药物开发、生化战剂等研究中均有重要应用。在药物开发方面，stx独特的化学结构和毒理作用机制，成为研究细胞na+通道的重要工具药。其具有抗肿瘤、抗病毒、镇痛、麻醉、解痉、降压、止喘等多种功效。目前，石房蛤毒素的获得主要通过甲藻藻株的规模培养及产物提取制备而来。该方法不仅培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备。与甲藻相比，海洋细菌具有基因组小、易培养、遗传操作简单等特性，因此，利用产毒海洋微生物菌株发酵与产物分离制备石房蛤毒素，是一条行之有效的替代方案。
技术实现要素：
本发明是为了克服现有技术中石房蛤毒素的获得方法中培养周期长、成本高，且需要特殊的藻培养设备的问题，提供了一种具有产量高、周期短、成本低的一种利用产毒海洋亚硫酸杆菌发酵制备石房蛤毒素的方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种利用产毒海洋亚硫酸杆菌发酵制备石房蛤毒素的方法，所述的亚硫酸杆菌为亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d菌株，保藏编号为cctccab2016296，购买自中国典型培养物保藏中心，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d接种于斜面培养基中，培养活化菌株；
（2）种子液的准备：挑取活化后的单菌落接种于种子罐中的液体种子培养基，扩培菌株待用；
（3）发酵罐培养发酵：将发酵培养基装入发酵罐中，将步骤（2）中的种子液接入发酵培养基中，发酵得到发酵液；
（4）发酵液的提取：将发酵液板框过滤，获得菌体沉淀，用80%乙醇提取，合并提取液，旋蒸浓缩，得到粗提物；
（5）粗提物的纯化：粗提物经半制备色谱进行梯度洗脱，收集石房蛤毒素组分，旋转蒸发溶剂，获得白色粉末，即得石房蛤毒素。
本发明中的石房蛤毒素采用海洋亚硫酸杆菌发酵法制备得到，其与现有技术相比，本发明的步骤较为简单，整体制备过程时间大大减少，有效的提高石房蛤毒素的制备效率与产量。因而能够有效的合成石房蛤毒素，为研究石房蛤毒素的作用效果提供了有效的途径。
作为优选，所述的步骤（1）中平板培养基配方如下：硫酸铵0.8~1.2g、酵母膏0.2~0.5g、海藻酸钠0.6~1.0g、磷酸铁0.1~0.5g、琼脂2g，加天然海水至100ml，ph6.9~7.3。
本发明中的亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d为海洋细菌，因此在培养过程中需加入一定量的天然海水，以促进其活性。
作为优选，所述的步骤（1）中培养温度为27~31℃，培养时间为2~4天。
作为优选，所述的步骤（2）中液体种子培养基配方如下：酵母膏5g、蛋白胨4g、葡萄糖1g、天然海水1000ml，ph6.2~7.1。
作为优选，所述的步骤（2）中种子罐中的通气量为40-50l/min，搅拌转速160-180转/min，28℃培养16小时，待种子液的od600达到0.6~0.8，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用。
作为优选，所述的步骤（3）中发酵培养基的配方如下：酵母膏10g、蛋白胨6g、葡萄糖4g、精氨酸0.015g、氯化钙0.002g以及天然海水1000ml，ph6.3~7.0。
作为优选。所述的步骤（3）中发酵培养基的装入量为发酵罐装液量体积百分比的35~50%，种子液按体积百分比2.5%~3.5%的接种量接入发酵培养基中。
作为优选，所述的步骤（3）中所述的发酵罐为平叶涡轮搅拌型发酵罐，发酵过程中保持罐压0.12~0.18mpa，搅拌速率为140-160r/min，控制通气量40-60l/min，发酵温度为27~30℃，发酵时间为40-48小时。
作为优选，所述的步骤（4）中80%乙醇的ph为2.0~4.0，提取次数为3次。
作为优选，所述的石房蛤毒素产率为61.5-72.8μg/l。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）本发明方法使用海洋微生物菌株亚硫酸杆菌z1-d为生产菌种，该菌种发酵石房蛤毒素产率较高，可达61.5-72.8μg/l，其发酵时间为40-48小时，节省能耗；
（2）本发明方法步骤简单、工作量小，周期较短，所用试剂与材料均为微生物发酵试验常用试剂，对人体无害，对环境友好，成本低，具有较高的市场前景与经济价值。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1
一种利用产毒海洋亚硫酸杆菌发酵制备石房蛤毒素的方法，所述的亚硫酸杆菌为亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d菌株，保藏编号为cctccab2016296，购买自中国典型培养物保藏中心，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d接种于斜面培养基中，27℃下培养活化菌株2天，其中所述的步骤（1）中平板培养基配方如下：硫酸铵0.8g、酵母膏0.2g、海藻酸钠0.6g、磷酸铁0.1g、琼脂2g，加天然海水至100ml，ph6.9。
（2）种子液的准备：配制种子培养基1l，加入5l容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，挑取活化后的单菌落，火焰法接种于种子罐中的液体种子培养基中，种子罐中的通气量为40l/min，搅拌转速160转/min，28℃培养16小时，待种子液的od600达到0.6，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用，所述的液体种子培养基配方如下：酵母膏5g、蛋白胨4g、葡萄糖1g、天然海水1000ml，ph6.2。
（3）发酵罐培养发酵：配制发酵培养基，按照发酵罐装液量体积百分比的35%装入平叶涡轮搅拌型发酵罐，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，降温至27℃，种子液按体积百分比2.5%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.12mpa，搅拌速率为140r/min，控制通气量40l/min，发酵温度为27℃，发酵时间为40小时，发酵得到发酵液，所述的发酵培养基的配方如下：酵母膏10g、蛋白胨6g、葡萄糖4g、精氨酸0.015g、氯化钙0.002g以及天然海水1000ml，ph6.3。
（4）发酵液的提取：将发酵液板框过滤，获得菌体沉淀，用ph为2.0的80%（v/v）乙醇提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入ph为2.0的80%（v/v）乙醇溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取。
（5）粗提物的纯化：粗提物经半制备色谱进行梯度洗脱，收集石房蛤毒素组分，旋转蒸发溶剂，获得白色粉末，即得石房蛤毒素，产率61.5μg/l。
实施例2
一种利用产毒海洋亚硫酸杆菌发酵制备石房蛤毒素的方法，所述的亚硫酸杆菌为亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d菌株，保藏编号为cctccab2016296，购买自中国典型培养物保藏中心，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d接种于斜面培养基中，31℃下培养活化菌株4天，其中所述的步骤（1）中平板培养基配方如下：硫酸铵1.2g、酵母膏0.5g、海藻酸钠1.0g、磷酸铁0.5g、琼脂2g，加天然海水至100ml，ph7.3。
（2）种子液的准备：配制种子培养基1l，加入5l容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，挑取活化后的单菌落，火焰法接种于种子罐中的液体种子培养基中，种子罐中的通气量为50l/min，搅拌转速180转/min，28℃培养16小时，待种子液的od600达到0.8，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用，所述的液体种子培养基配方如下：酵母膏5g、蛋白胨4g、葡萄糖1g、天然海水1000ml，ph7.1。
（3）发酵罐培养发酵：配制发酵培养基，按照发酵罐装液量体积百分比的50%装入平叶涡轮搅拌型发酵罐，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，降温至30℃，种子液按体积百分比3.5%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.18mpa，搅拌速率为160r/min，控制通气量60l/min，发酵温度为30℃，发酵时间为48小时，发酵得到发酵液，所述的发酵培养基的配方如下：酵母膏10g、蛋白胨6g、葡萄糖4g、精氨酸0.015g、氯化钙0.002g以及天然海水1000ml，ph7.0。
（4）发酵液的提取：将发酵液板框过滤，获得菌体沉淀，用ph为4.0的80%（v/v）乙醇提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入ph为4.0的80%（v/v）乙醇溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取。
（5）粗提物的纯化：粗提物经半制备色谱进行梯度洗脱，收集石房蛤毒素组分，旋转蒸发溶剂，获得白色粉末，即得石房蛤毒素，产率71.2μg/l。
实施例3
一种利用产毒海洋亚硫酸杆菌发酵制备石房蛤毒素的方法，所述的亚硫酸杆菌为亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d菌株，保藏编号为cctccab2016296，购买自中国典型培养物保藏中心，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d接种于斜面培养基中，28℃下培养活化菌株3天，其中所述的步骤（1）中平板培养基配方如下：硫酸铵1.0g、酵母膏0.4g、海藻酸钠0.8g、磷酸铁0.3g、琼脂2g，加天然海水至100ml，ph7.0。
（2）种子液的准备：配制种子培养基1l，加入5l容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，挑取活化后的单菌落，火焰法接种于种子罐中的液体种子培养基中，种子罐中的通气量为45l/min，搅拌转速170转/min，28℃培养16小时，待种子液的od600达到0.7，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用，所述的液体种子培养基配方如下：酵母膏5g、蛋白胨4g、葡萄糖1g、天然海水1000ml，ph6.8。
（3）发酵罐培养发酵：配制发酵培养基，按照发酵罐装液量体积百分比的40%装入平叶涡轮搅拌型发酵罐，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，降温至28℃，种子液按体积百分比2%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.15mpa，搅拌速率为150/min，控制通气量50l/min，发酵温度为28℃，发酵时间为45小时，发酵得到发酵液，所述的发酵培养基的配方如下：酵母膏10g、蛋白胨6g、葡萄糖4g、精氨酸0.015g、氯化钙0.002g以及天然海水1000ml，ph6.5。
（4）发酵液的提取：将发酵液板框过滤，获得菌体沉淀，用ph为4的80%（v/v）乙醇提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入ph为4的80%（v/v）乙醇溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取。
（5）粗提物的纯化：粗提物经半制备色谱进行梯度洗脱，收集石房蛤毒素组分，旋转蒸发溶剂，获得白色粉末，即得石房蛤毒素，产率72.8μg/l。
实施例4
一种利用产毒海洋亚硫酸杆菌发酵制备石房蛤毒素的方法，所述的亚硫酸杆菌为亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d菌株，保藏编号为cctccab2016296，购买自中国典型培养物保藏中心，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d接种于斜面培养基中，30℃下培养活化菌株3天，其中所述的步骤（1）中平板培养基配方如下：硫酸铵0.9g、酵母膏0.4g、海藻酸钠0.7g、磷酸铁0.2g、琼脂2g，加天然海水至100ml，ph7.2。
（2）种子液的准备：配制种子培养基1l，加入5l容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，挑取活化后的单菌落，火焰法接种于种子罐中的液体种子培养基中，种子罐中的通气量为50l/min，搅拌转速175转/min，28℃培养16小时，待种子液的od600达到0.8，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用，所述的液体种子培养基配方如下：酵母膏5g、蛋白胨4g、葡萄糖1g、天然海水1000ml，ph6.9。
（3）发酵罐培养发酵：配制发酵培养基，按照发酵罐装液量体积百分比的35~50%装入平叶涡轮搅拌型发酵罐，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，降温至29℃，种子液按体积百分比2.8%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.17mpa，搅拌速率为145r/min，控制通气量55l/min，发酵温度为29℃，发酵时间为48小时，发酵得到发酵液，所述的发酵培养基的配方如下：酵母膏10g、蛋白胨6g、葡萄糖4g、精氨酸0.015g、氯化钙0.002g以及天然海水1000ml，ph6.8。
（4）发酵液的提取：将发酵液板框过滤，获得菌体沉淀，用ph为3.0的80%（v/v）乙醇提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入ph为3.0的80%（v/v）乙醇溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取。
（5）粗提物的纯化：粗提物经半制备色谱进行梯度洗脱，收集石房蛤毒素组分，旋转蒸发溶剂，获得白色粉末，即得石房蛤毒素，产率66.8μg/l。
实施例5
一种利用产毒海洋亚硫酸杆菌发酵制备石房蛤毒素的方法，所述的亚硫酸杆菌为亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d菌株，保藏编号为cctccab2016296，购买自中国典型培养物保藏中心，所述的方法包括以下步骤：
（1）菌株活化：将亚硫酸杆菌（sulfitobactersp.）z1-d接种于斜面培养基中，27~31℃下培养活化菌株2天，其中所述的步骤（1）中平板培养基配方如下：硫酸铵1.2g、酵母膏0.2g、海藻酸钠0.6g、磷酸铁0.5g、琼脂2g，加天然海水至100ml，ph7.1。
（2）种子液的准备：配制种子培养基1l，加入5l容积种子罐中，蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，冷却至28℃，挑取活化后的单菌落，火焰法接种于种子罐中的液体种子培养基中，种子罐中的通气量为45l/min，搅拌转速180转/min，28℃培养16小时，待种子液的od600达到0.6，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染时待用，所述的液体种子培养基配方如下：酵母膏5g、蛋白胨4g、葡萄糖1g、天然海水1000ml，ph6.3。
（3）发酵罐培养发酵：配制发酵培养基，按照发酵罐装液量体积百分比的35~50%装入平叶涡轮搅拌型发酵罐，通蒸汽加热，121℃灭菌30分钟，降温至28℃，种子液按体积百分比3.0%的接种量接入发酵培养基中，发酵过程中保持罐压0.12~0.18mpa，搅拌速率为145r/min，控制通气量45l/min，发酵温度为28℃，发酵时间为46小时，发酵得到发酵液，所述的发酵培养基的配方如下：酵母膏10g、蛋白胨6g、葡萄糖4g、精氨酸0.015g、氯化钙0.002g以及天然海水1000ml，ph6.6。
（4）发酵液的提取：将发酵液板框过滤，获得菌体沉淀，用ph为4.0的80%（v/v）乙醇提取，将提取液通过0.45微米滤膜过滤，对沉淀进行二次提取，得到二次提取液；将二次澄清液经0.45微米滤膜过滤后，加入ph为4.0的80%（v/v）乙醇溶液进行三次提取，合并三次提取液，旋蒸浓缩，得到粗提取。
（5）粗提物的纯化：粗提物经半制备色谱进行梯度洗脱，收集石房蛤毒素组分，旋转蒸发溶剂，获得白色粉末，即得石房蛤毒素，产率70.6μg/l。