本发明属于生物技术领域，涉及d-氨基酸和阿尔法酮酸的制备方法。
背景技术
自然界存在20种氨基酸，均为l-型氨基酸，它们是组成蛋白质的基本结构单元。所以，一般认为d-氨基酸在自然界中极少存在，近年来，随着科学研究的深入，人们发现d-氨基酸虽然不是构成蛋白质的基本结构氮源，但许多植物、微生物和高等植物中都有d-氨基酸的存在。
目前d-型氨基酸的应用领域主要是：1.医药方面。用于合成多肽药物，如多肽抗生素（阿扑西林aspoxicillin），肠胃药（oxtreotide），利尿药，腹泻药（善得定sandostatinacetate），酶抑制剂，促皮质素类似物，止痛镇痛药，减肥药，ⅱ型糖尿病治疗药（那格列奈nateglinide）等。2.食品方面。天苯二肽（阿斯巴甜），天丙二肽（阿力甜）等新型甜味剂。d-型氨基酸还可用于食品调味剂、保鲜剂、防腐剂、食品发色剂、食品香料等产品。3.农药方面。氨基酸农药无需大面积使用，不但可减少人力物力和药用量，且具有毒性低、高效无公害，易被降解利用，原料来源广泛等特点，成为新型农药研究热点。4.科学研究。通过研究生物体内氨基酸d，l-异构体含量的改变，可作为年带记时器进行气候、水文研究。d-氨基酸还可用于酶的结构-功能分析方面的研究。
不对称转换是制备d-氨基酸的主要方法，根据制备手段和途径不同可分为化学不对称转换和生物不对称转换。根据初始原料不同可分为：不对称合成方法直接制备；合成外消旋体后拆分；由l-氨基酸或消旋氨基酸通过不对称转换制备。其中，现在国内外普遍使用的方法是先用化学法合成外消旋体，再进行拆分制备d-氨基酸。
化学法生产d-氨基酸的反应条件相对比较剧烈、污染大、产率低且费用高，因此不适合大规模生产。而发展较快并且最具有应用潜力的是生物制备方法。在生物制备方法中，根据初始原料不同，目前研究较多的分为以下几种：
1、以消旋的dl-氨基酸或衍生物为原料，用完整的微生物细胞或从微生物细胞中提取的酶作为催化剂，使氨基酸或其衍生物水解。由于生物催化剂的立体选择性强，只能选择性的水解某一旋光氨基酸或其衍生物，另一种不被水解或水解很少。因此，两种旋光氨基酸具有不同的结合形态，也就具有不同的理化性质，可以方便的借助于物理、化学手段加以分离。n-乙酰-氨基酰化酶（n-acyl-d-amioacidamidohydrolase）是拆分dl-型氨基酸制备d-氨基酸的主要酶类之一。从文献报道来看，大多数氨基酰化酶最适合的底物多为中性氨基酸。廖本仁等以dl-乙酰色氨酸为底物用氨基酰化酶拆分得到l-型色氨酸。没有被酶解的n-乙酰-d-色氨酸，再用盐酸水解得到d-色氨酸。d-色氨酸和l-色氨酸的收率和光学纯度都可以达到98％以上。
2、首先制备某一外消旋中间体，通过微生物体产生的水解酶和消旋酶在一定条件下使外消旋中间体向d-氨基酸转化。这一方面研究的比较多的是5-取代海因，5-取代海因在海因水解酶和氨甲酰基水解酶的作用下，生成相应的d-氨基酸。kyriakos等利用含d-海因酶和n-氨甲酰基-d-氨基酸水解酶的微生物一步转化dl-对羟基苯海因为d-对羟基苯甘氨酸，两步酶反应过程的理论收率可达100％。日本的ajinomoto、德国的bayer公司、荷兰的dsm等公司都在用海因酶法生产d-对羟基苯甘氨酸，其规模已达到几千吨/年。除此之外，海因酶法还可以用于制备d-色氨酸、d-缬氨酸等。
3、以来源广泛、价格相对便宜的l-型氨基酸为起始原料，在酶的催化作用下不对称转换为d-型氨基酸。yagasaki等[18]分别构建了两株具有消旋酶活性和脱羧酶活性的重组菌株，l-氨基酸经消旋后得到dl-氨基酸，然后再拆分得到d-氨基酸，通过此方法得到的d-谷氨酸和d-脯氨酸ee值达到99％以上，但收率不到50％。ian等研究发现，l-氨基酸经过脱氨作用形成酮酸，酮酸在d-氨基酸氨基转移酶的作用下可生成d-氨基酸，根据此原理，构建具有l-氨基酸脱氨酶活性和d-氨基酸转氨酶活性的基因工程菌，能够不对称转换多种l-型氨基酸，其中亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸的收率和ee值均在90％以上。
以上的几种方法，都纯在一定缺点或是对部分氨基酸不适用，或则是生产不经济。如海茵酶法在先合成底物海茵时用到有毒化学物质，会污染环境，而且海茵酶法对大部分d-氨基酸不适用。转氨酶法：转氨酶酶活普遍偏低，而且需要氨基供体，需要先制备酮酸。还有其它一些方法都存在一定的局限性。
技术实现要素：
本发明提供一种d-氨基酸和阿尔法酮酸的制备方法，酶催化生产α-酮酸钙和d-氨基酸，两个产物都具有经济价值，产品质量高，从而大大降低了生产成本。
本发明采用如下的技术方案：
一种d-氨基酸和阿尔法酮酸的制备方法，包括如下步骤：
1.重组菌构建
全基因合成来源于奇异变形杆菌(proteusmirabilis)的l-氨基酸脱氨酶（l-aminoaciddeaminase，laad）基因（genbank登录号eu669819.1）laad，并连入pet24a载体（ndeⅰ/hind），构建质粒laad，转化至e.colibl21（de3），构建重组菌pmlaad。
全基因合成来源于乳酸菌(lactobacillusbuchneristrainjcm1115)的氨基酸消旋酶（aminoacidracemase，aar）基因（genbank登录号kc413940.1）aar，并连入pet24a载体（ndeⅰ/hind），构建质粒aar，转化至e.colibl21（de3），构建重组菌aar。
2.发酵
重组菌pmlaad和aar采用tb进行发酵。
1)培养基
(1)lb：
(2)琼脂lb-kan平板(g/l)：
注：培养基灭菌冷却至50-60℃，100mllb加100μlkan溶液（100mg/ml），混匀，倒平板（25-30ml/6cm平皿）。
(3)tb(g/l)：
2)发酵流程
(1)菌种活化：从甘油管或牛奶管接菌至kanlb琼脂平板，37℃培养12-14h。
(2)一级种子：从平板上挑取单菌至4mllb试管，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养过夜（16h）。
(3)二级种子：取新鲜菌液按2%接种量接种于lb（100ml/500ml）摇瓶，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养3.0-3.5h，od600为1.0左右。
(4)1l/5l的tb发酵：二级种子2%-10%的接种量接入tb培养基（1l/5l发酵摇瓶），加kan至25mg/l，37℃，220rpm，培养3h，开始降温25℃；加iptg至终浓度（0.1mm），220rpm，25度，培养过夜。
(5)发酵20-24h，3500rpm*25min离心收集菌体，菌置-30℃冰箱冷冻24h。
3.酶催化
采用5升发酵罐，称取100g的l-氨基酸（缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等氨基酸之一），加3升水，300rpm搅拌溶解，氢氧化钠溶液调ph6-8，控制温度35℃，加入冷冻的aar菌体10g，加磷酸吡哆醛（plp）150mg。搅拌反应6h，离心回收aar，离心上清加热至80℃，10min灭活残留的消旋酶活性。上清液降温至35℃，加入pmlaad菌体20g，加入3g的商品-过氧化氢酶，通入3l/min的空气，300rpm，搅拌反应至氨基酸不再减少，停止反应，离心回收菌体。
4.分离纯化
转化离心上清过陶瓷膜，超滤膜，脱色膜，调ph3-5，上阳离子交换树脂，吸附d-氨基酸，收集α-酮酸的流穿液，加入氯化钙。氨水洗脱下d-氨基酸。分别浓缩结晶α-酮酸钙和d-氨基酸。抽滤干燥获得α-酮酸钙盐40g和d-氨基酸38g。
通过实施上述技术方案，本发明的酶催化生产α-酮酸钙和d-氨基酸，两个产物都具有经济价值，产品质量高，从而大大降低了生产成本。
具体实施方式
一种d-氨基酸和阿尔法酮酸的制备方法，包括如下步骤：
1.重组菌构建：
全基因合成来源于奇异变形杆菌(proteusmirabilis)的l-氨基酸脱氨酶（l-aminoaciddeaminase，laad）基因（genbank登录号eu669819.1）laad，并连入pet24a载体（ndeⅰ/hind），构建质粒laad，转化至e.colibl21（de3），构建重组菌pmlaad。
全基因合成来源于乳酸菌(lactobacillusbuchneristrainjcm1115)的氨基酸消旋酶（aminoacidracemase，aar）基因（genbank登录号kc413940.1）aar，并连入pet24a载体（ndeⅰ/hind），构建质粒aar，转化至e.colibl21（de3），构建重组菌aar。
2.发酵
重组菌pmlaad和aar采用tb进行发酵。
3)培养基
(1)lb：
(2)琼脂lb-kan平板(g/l)：
注：培养基灭菌冷却至50-60℃，100mllb加100μlkan溶液（100mg/ml），混匀，倒平板（25-30ml/6cm平皿）。
(3)tb(g/l)：
4)发酵流程
(1)菌种活化：从甘油管或牛奶管接菌至kanlb琼脂平板，37℃培养12-14h。
(2)一级种子：从平板上挑取单菌至4mllb试管，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养过夜（16h）。
(3)二级种子：取新鲜菌液按2%接种量接种于lb（100ml/500ml）摇瓶，加kan至终浓度为100mg/l，37℃，220rpm培养3.0-3.5h，od600为1.0左右。
(4)1l/5l的tb发酵：二级种子2%-10%的接种量接入tb培养基（1l/5l发酵摇瓶），加kan至25mg/l，37℃，220rpm，培养3h，开始降温25℃；加iptg至终浓度（0.1mm），220rpm，25度，培养过夜。
(5)发酵20-24h，3500rpm*25min离心收集菌体，菌置-30℃冰箱冷冻24h。
3.酶催化
采用5升发酵罐，称取100g的l-氨基酸（缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等氨基酸之一），加3升水，300rpm搅拌溶解，氢氧化钠溶液调ph6-8，控制温度35℃，加入冷冻的aar菌体10g，加磷酸吡哆醛（plp）150mg。搅拌反应6h，离心回收aar，离心上清加热至80℃，10min灭活残留的消旋酶活性。上清液降温至35℃，加入pmlaad菌体20g，加入3g的商品-过氧化氢酶，通入3l/min的空气，300rpm，搅拌反应至氨基酸不再减少，停止反应，离心回收菌体。
4.分离纯化
转化离心上清过陶瓷膜，超滤膜，脱色膜，调ph3-5，上阳离子交换树脂，吸附d-氨基酸，收集α-酮酸的流穿液，加入氯化钙。氨水洗脱下d-氨基酸。分别浓缩结晶α-酮酸钙和d-氨基酸。抽滤干燥获得α-酮酸钙盐40g和d-氨基酸38g。