本发明属于医药化工领域，具体涉及一种茶黄素-3-没食子酸酯的制备方法。
背景技术
茶黄素-3-没食子酸酯是红茶中茶黄素类的一种主要单体，也是红茶茶汤的色泽及风味的主要指标之一。现有文献表明，茶黄素具有多种药理与保健功能，如降血脂、抗氧化、抗衰老等，某些功能方面甚至优于儿茶素；近年来，茶黄素-3-没食子酸酯的医药保健功能逐渐受到了极大的关注，但是茶黄素的提纯难度较大，尤其是茶黄素-3-没食子酸酯单体成分的分离纯化文献报道更是少之又少。
多酚氧化酶(ppo)又称儿茶酚氧化酶，它广泛存在于植物(如荔枝)组织中，具有较强的催化儿茶素合成茶黄素的能力。
目前关于应用荔枝皮中的ppo催化合成茶黄素-3-没食子酸酯粗品并进行分离纯化获得纯度较高的茶黄素-3-没食子酸酯的方法尚未见报道。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种茶黄素-3-没食子酸酯的制备方法，该发明以新鲜荔枝皮为活性多酚氧化酶来源，以表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)和表儿茶素(ec)为原料制备茶黄素-3-没食子酸酯，再经过大孔吸附树脂柱层析技术进行纯化，分离，制备出高纯度茶黄素-3-没食子酸酯；该制备方法首次以荔枝皮中的ppo作为催化剂，催化合成茶黄素-3-没食子酸酯，并进行分离纯化获得纯度较高的茶黄素-3-没食子酸酯，解决了荔枝皮中ppo在茶黄素-3-没食子酸酯合成中的催化应用，且该方法高效，重复性好，稳定性高。
本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现。
一种茶黄素-3-没食子酸酯的制备方法，具体包括以下步骤：
s1)荔枝多酚氧化酶的提取：称取新鲜荔枝皮，加入缓冲液，捣碎后过滤，保留滤液；向滤渣中加入缓冲液，搅拌，过滤，保留滤液；合并两次滤液，然后离心，取上清液即得荔枝多酚氧化酶液；
s2)茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液的制备：称取表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)与表儿茶素(ec)，加入缓冲液溶解充分，然后加入步骤s1)所述荔枝多酚氧化酶液以及过氧化氢溶液，搅拌反应，过滤，保留滤液，即为茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液；
s3)茶黄素-3-没食子酸酯粗品的纯化：将步骤2)得到的所述茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液作为柱层析上样液逐渐加入已经装有大孔吸附树脂的层析柱内，上样结束后先用水溶液洗脱，然后再用醇溶液洗脱，并收集醇溶液洗脱液，将收集的所述醇溶液洗脱液减压浓缩至无醇味，冷冻干燥即得到茶黄素-3-没食子酸酯。
进一步的，步骤s1中每次加入的所述缓冲溶液以新鲜荔枝皮质量计为0.1～5ml/g，所述缓冲液加入时的温度控制在0～30℃范围内，所述搅拌时间为2～30min，所述离心时间为2～30min。
进一步的，步骤s1中每次加入的所述缓冲溶液以新鲜荔枝皮质量计为1～2ml/g，所述缓冲液加入时的温度控制在4～10℃范围内。
进一步的，步骤s2)中所述表没食子儿茶素没食子酸酯与碳酸乙烯酯的重量比为1:0.1-10；
所述表没食子儿茶素没食子酸酯和碳酸乙烯酯总加入量与新鲜荔枝皮的重量比为1：10-100；
所述缓冲液的体积用量以新鲜荔枝皮质量计为5～200ml/g；
所述过氧化氢溶液与缓冲液的体积比为1：100-500；
所述搅拌反应温度为0～40℃，搅拌反应时间为0.5～3h。
进一步的，步骤s2)中所述表没食子儿茶素没食子酸酯与碳酸乙烯酯的重量比为1:0.25～2；所述表没食子儿茶素没食子酸酯和碳酸乙烯酯总加入量与新鲜荔枝皮的重量比为1：20-60；所述缓冲液的体积用量以新鲜荔枝皮质量计为5～20ml/g。
进一步的，步骤s1)和s2)中所述缓冲液为柠檬酸和柠檬酸钠的混合溶液或磷酸和磷酸钠的混合溶液。
进一步的，步骤s3)上样流速为每小时0.5～3倍柱体积；
洗脱流速为每小时1～4倍柱体积；
水洗脱体积为0.5～2倍柱体积，醇溶液洗脱体积为2～12倍柱体积。
进一步的，步骤s3)所述醇溶液为甲醇或者乙醇与水的混合溶液，混合后醇所占体积比例为10～40％(v:v)。
进一步的，步骤s3)中所述大孔吸附树脂型号为hpd-100、hpd-200或hpd-400。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明率先以新鲜荔枝皮为活性多酚氧化酶来源，以egcg与ec为原料制备茶黄素-3-没食子酸酯，再经过大孔吸附树脂柱层析技术进行纯化，分离制备出高纯度茶黄素-3-没食子酸酯，本制备方法简单、高效，重复性好，稳定性高，更适合于工业化生产。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明。
实施例1：茶黄素-3-没食子酸酯的制备过程
s1)荔枝多酚氧化酶的提取：称取新鲜荔枝皮500g放入榨汁机中，加入预冷至5℃的500ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，捣碎后过滤出滤液，滤渣加入预冷至5℃的500ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液搅拌10min，滤出滤液；合并两次滤液在离心机中离心15min，取上清液即得荔枝多酚氧化酶液。s2)茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液的制备：称取egcg5g与ec5g，加入2500ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解充分，加入步骤s1)中荔枝多酚氧化酶液以及25ml过氧化氢溶液，30℃搅拌反应2h，过滤所得滤液即为茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液。s3)茶黄素-3-没食子酸酯粗品的纯化：将茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液作为柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为hpd-200的大孔吸附树脂层析柱内，控制上样流速为1bv/h，上样结束后先以2.5bv/h流速分别以水洗脱0.5bv，然后使用20％乙醇溶液以2.5bv/h流速洗脱6bv，收集20％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液；将20％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液减压浓缩至无醇味，冷冻干燥即得到茶黄素-3-没食子酸酯4.6g。
实施例2：茶黄素-3-没食子酸酯的制备过程
s1)荔枝多酚氧化酶的提取：称取新鲜荔枝皮500g放入榨汁机中，加入预冷至15℃的2500ml柠檬酸-磷酸钠缓冲液，捣碎后过滤出滤液，滤渣加入预冷至15℃的2500ml柠檬酸-磷酸钠缓冲液搅拌2min，滤出滤液；合并两次滤液在离心机中离心30min，取上清液即得荔枝多酚氧化酶液。s2)茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液的制备：称取egcg20g与ec5g，加入5000ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解充分，加入步骤s1)中荔枝多酚氧化酶液以及10ml过氧化氢溶液，40℃搅拌反应3h，过滤所得滤液即为茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液。s3)茶黄素-3-没食子酸酯粗品的纯化：将茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液作为柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为hpd-400的大孔吸附树脂层析柱内，控制上样流速为0.5bv/h，上样结束后以1bv/h流速先用水洗脱2bv，然后用20％乙醇溶液以1bv/h流速洗脱12bv，收集10％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液；将10％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液减压浓缩至无醇味，冷冻干燥即得到茶黄素-3-没食子酸酯10.2g。
实施例3：茶黄素-3-没食子酸酯的制备过程
s1)荔枝多酚氧化酶的提取：称取新鲜荔枝皮500g放入榨汁机中，加入预冷至5℃的50ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，捣碎后过滤出滤液，滤渣加入预冷至5℃的50ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液搅拌30min，滤出滤液；合并两次滤液在离心机中离心2min，取上清液即得荔枝多酚氧化酶液。s2)茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液的制备：称取egcg10g与ec5g，加入10000ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解充分，加入步骤s1)中荔枝多酚氧化酶液以及50ml过氧化氢溶液，5℃搅拌反应0.5h，过滤所得滤液即为茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液。s3)茶黄素-3-没食子酸酯粗品的纯化：将茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液作为柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为hpd-100的大孔吸附树脂层析柱内，控制上样流速为3bv/h，上样结束后先以4bv/h流速分别以水洗脱1bv，然后使用20％乙醇溶液以4bv/h流速洗脱2bv，收集40％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液；将40％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液减压浓缩至无醇味，冷冻干燥即得到茶黄素-3-没食子酸酯4.6g。
实施例4：茶黄素-3-没食子酸酯的制备过程
s1)荔枝多酚氧化酶的提取：称取新鲜荔枝皮500g放入榨汁机中，加入预冷至10℃的1000ml磷酸和磷酸钠缓冲液，捣碎后过滤出滤液，滤渣加入预冷至10℃的1000ml磷酸和磷酸钠缓冲液搅拌17min，滤出滤液；合并两次滤液在离心机中离心25min，取上清液即得荔枝多酚氧化酶液。s2)茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液的制备：称取egcg5g与ec5g，加入5000ml磷酸和磷酸钠缓冲液溶解充分，加入步骤s1)中荔枝多酚氧化酶液以及10ml过氧化氢溶液，30℃搅拌反应1.5h，过滤所得滤液即为茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液。s3)茶黄素-3-没食子酸酯粗品的纯化：将茶黄素-3-没食子酸酯粗品溶液作为柱层析上样液逐渐加入已经装有型号为hpd-200的大孔吸附树脂层析柱内，控制上样流速为0.5bv/h，上样结束后以1bv/h流速先用水洗脱2bv，然后用20％乙醇溶液以1bv/h流速洗脱12bv，收集10％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液；将10％乙醇溶液洗脱树脂柱流出液减压浓缩至无醇味，冷冻干燥即得到茶黄素-3-没食子酸酯9.2g。
本发明按照上述实施例进行了说明应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。