本发明属于天然植物色素制备技术领域，具体涉及一种基于乌饭树树叶制备不同色调靛蓝色素的方法。
背景技术
乌饭树(vacciniumbracteatumthunb.)是杜鹃花科越橘属常绿植物，其野生资源在我国分布较广，尤其以江、浙、闽一带为多。乌饭树树叶及其果实的营养价值很高，江浙闽一带素有用乌饭树树叶及其果实制作乌米饭食用的习俗。乌饭树树叶中含有丰富的多糖和黄酮类化合物，同时还含有多种脂肪酸、氨基酸及维生素等营养成分。其主要成分中糖类物质占52.10％、黄酮类化合物含量约为19.48％(其中槲皮素占35.71％)。近年来有报道在乌饭树树叶中最新发现了环烯醚萜苷及其衍生物，并鉴定出四种新结构的环烯醚萜苷二聚体化合物，并指出它们具有改善心血管疾病的生理活性。目前对乌饭树树叶色素的具体成分还尚未确定，但就近些年来学者的发现，利用染色活性跟踪法并通过分离鉴定出乌饭树树叶色素的有效成分中含有乌饭树苷类成分。
关于乌饭树树叶色素的分离纯化已有很多报道。王等利用果胶酶和纤维素酶来提高乌饭树树叶色素的提取效率，当果胶酶和纤维素酶的用量在2.5mg/g树叶和3.0mg/g树叶时，vbtl色素的提取率最高，达33mg/g原料。魏等用乙醇浸提的方法确定了提取vbtl色素的最佳条件，并且用ab-8大孔吸附树脂来纯化色素，达到了很好的分离效果。由于乌饭树树叶中含有大量的多糖及部分胶质、蛋白质、矿物质等杂质，若不在提取前对其进行分离处理，则会导致所得色素产品发粘而品相较差。因此，目前国内大多采用树脂对乌饭树树叶色素进行提纯。但目前对乌饭树树叶色素的利用仍处于对其提取方式优化的层面，以提高其提取率，其制备方法不够完善且制得的色素为黑色素，大都因为提取的色素因操作或保存不当而导致氧化变黑。
目前我国准许使用的蓝色素只有七种，其中四种为合成色素，覆盖的蓝色调范围供人们进行颜色选择的余地不大，且这六种蓝色素大都水溶性不好，须在一定的条件下才能增进其水溶效果。国内尚未有基于乌饭树树叶色素来制备不同色调靛蓝色素的发明，且利用葡萄糖苷酶来提高靛蓝色素的生成速率的酶解方法也是首次在本专利中提出。本发明通采用不同种类及用量的氨基酸，并利用β-葡聚糖酶来促进靛蓝色素的生成，从而获得蓝色调范围较广的靛蓝色素。
技术实现要素：
本发明提供了一种基于乌饭树树叶制备不同色调靛蓝色素的方法。
一种基于乌饭树树叶制备不同色调靛蓝色素的方法，该方法的制备步骤如下：
(1)原料干燥制粉：乌饭树叶经干燥粉碎后得乌饭树叶粉末；
(2)水提预处理：将乌饭树叶粉末加入水中，调节ph为4.5-6.5，恒温提取，而后将提取液冷冻离心得到上清液；
(3)过滤：将步骤2中的上清液用超滤膜过滤，得到乌饭树叶粗提液；
(4)乌饭树叶粗提液纯化：用ab-8大孔吸附树脂吸附，分别用水和有机溶剂洗去杂质，再用有机溶剂解析得到洗脱液；
(5)干燥浓缩：减压蒸发浓缩步骤4的洗脱液，回收有机溶剂，再经冷冻干燥得到乌饭树叶粗提物粉末；
(6)酶解转蓝：将步骤5中的粗提物粉末与酶缓冲液在室温下混合，制得酶解液，再与不同氨基酸混合反应生成不同色调的靛蓝色汁；
(7)成品：将步骤6中不同色调的靛蓝色汁进行减压蒸发浓缩，再冷冻干燥得到靛蓝色素成品；
其中，步骤(6)中所述酶缓冲液为：将葡萄糖苷酶溶解于ph4.5-6.5的柠檬酸盐缓冲液中。
进一步的，步骤(1)中的干燥方式为冷冻干燥，粉末细度为40-100目。
进一步的，所述的葡萄糖苷酶为α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶中的一种或两种，α-葡萄糖苷酶或β-葡萄糖苷酶比酶活为8000-10000u/g，其中，酶添加量与步骤(5)中得到的乌饭树叶粗提物粉末质量比为1:20-60。
进一步的，所述葡萄糖苷酶优选为α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的混合物，其中α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的质量比为1：(5-10)。
进一步的，步骤(2)中水与乌饭树叶粉末的料液质量比为(20-60)：1，提取温度为40-60℃，提取次数为2-8次，每次提取时间2-4h。
进一步的，步骤(2)中离心方式为低温离心，转速为6000-8000r/min，时间为8-20min。
进一步的，步骤(3)中超滤膜孔径为2-50nm。
进一步的，步骤(4)中除杂所用的有机溶剂为体积分数为10-15％的乙醇溶液，用量为1-2倍柱体积(bv)，流速为1-3bv/h。
进一步的，步骤(4)中解析所用有机溶剂为体积分数为60-80％的乙醇溶液，用量为6-12倍柱体积(bv)，流速为1-3bv/h。
进一步的，步骤(5)中减压蒸发浓缩时的真空度为30-60mbar，温度为40-60℃。
进一步的，步骤(6)中所述粗提物粉末与酶缓冲液混合的质量比为1:400-800。
进一步的，步骤(6)中所述氨基酸为赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸或甘氨酸的一种或两种以上。
进一步的，步骤(6)中所述的氨基酸添加量，与乌饭树叶粗提物粉末的质量比为(1-10):1，添加的氨基酸种类按照最终产品的颜色要求可添加上述氨基酸的一种或多种。
进一步的，随着氨基酸的添加量增多，得到的靛蓝色素从浅蓝色变为黑蓝色。
进一步的，所述水为蒸馏水。
本发明还提供了一种染色方法，所述方法为将权利要求1所述的酶解液与含有氨基酸的物料混合即可将物料染成不同色调的靛蓝色。
本发明取得的有益效果：
本发明与现有技术相比较，具有以下优势：
1、本发明得到的靛蓝色素未经过纯化萃取，即可得到高色价蓝色色素，工艺更加简单，制得的色素稳定性和营养性均较好。
2、本发明得到的靛蓝色素为水溶性色素，且得到的靛蓝色色素在酸碱条件下(ph＝3-9)能够稳定存在。
3、葡萄糖苷酶促进靛蓝色素形成，且通过制成酶缓冲液，能最大限度保持酶活，更大效率地促进靛蓝色素的生成。
4、本发明酶解变蓝过程在室温下就可以进行，反应条件更加温和。
5、多种氨基酸事先配成氨基酸缓冲液，在缓冲液的环境下乌饭树树叶色素更易与氨基酸反应生成不同色调的靛蓝色素。
6、采用ab-8大孔树脂对乌饭树树叶色素粗提物进行提纯，先用蒸馏水初步除杂再用10-15％的乙醇进一步除杂，用60-80％乙醇进行洗脱，提纯效率高且提纯效果好，乌饭树树叶色素前体物质保留率高。
7、用超滤膜，即物理法除去色素粗提物中的非色素大分子，耗能小且除杂效果好。
8、干燥浓缩乌饭树树叶色素是采用减压蒸发浓缩，回收有机溶剂，重复利用，具有绿色可持续性利用理念。
9、用该方法制得的靛蓝色素可按需求调控其色调范围，利用市场应用及推广，具有一定的现实意义。
具体实施方式
实施例1
冷冻干燥乌饭树叶，粉碎后过60目筛。准确称取10g乌饭树叶粉末并加入200g蒸馏水，在30℃水浴条件下进行保温水提(即料液比为1:20)，提取时间2h，提取次数3次，得水提液。
将上述水提液冷冻离心10min(6000r/min)得上清液，用孔径为30nm的超滤膜过滤上清液得乌饭树叶粗提液。将粗提液以2bv/h的流速过ab-8大孔吸附树脂，先用蒸馏水除杂至洗脱液为无色，再用1bv10％的乙醇以1bv/h的流速除去吸附在柱子上的非色素成分，最后用6bv60％的乙醇进行洗脱得洗脱液。
将上述洗脱液在真空度为40mbar，温度为40℃的条件下进行减压蒸发浓缩，回收有机溶剂，将浓缩液经冷冻干燥得乌饭树叶粗提物粉末598mg，提取率为59.8mg/g。
准确称取40mg乌饭树叶粗提物粉末，再称取2mg比酶活为8000u/g的α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，其中α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的质量比为1：8。
用柠檬酸盐配制缓冲液，将已称量好的酶溶解于该缓冲液中，并调节该酶缓冲液的ph至4.5(用0.1mol/l的盐酸或0.1mol/l的氢氧化钠)。
准确称取16g上述酶缓冲液(即乌饭树叶粗提物粉末与酶缓冲液的质量比为1:400)，将称量好的乌饭树叶粗提物粉末40mg溶解于该酶缓冲液中形成酶解液，再称取80mg甘氨酸(即氨基酸添加量与乌饭树叶粗提物粉末的质量比为2:1)添加到酶解液中，常温条件下反应1h即可形成靛蓝色素水溶液。
将上述靛蓝色水溶液经减压蒸发浓缩后冷冻干燥即得靛蓝色素成品，色价为94.6，该蓝色调对应潘通比色卡的色号，与其接近的色号为pantong288c，见表1。
将上述靛蓝色素水溶液常温放置10天，再经减压蒸发浓缩后冷冻干燥制成靛蓝色素成品，其色价为94.1，几乎无变化。
将上述靛蓝色水溶液加热至沸腾，其颜色无明显变化。
将上述靛蓝色色素成品溶于ph＝3-4的酸性溶液或者ph＝8-9的碱性溶液中，颜色无明显变化，能够稳定存在。
实施例2
冷冻干燥乌饭树叶，粉碎后过80目筛。准确称取10g乌饭树叶粉末并加入400g蒸馏水，在30℃水浴条件下进行保温水提(即料液比为1:40)，提取时间3h，提取次数4次，得水提液。
将上述水提液冷冻离心15min(6000r/min)得上清液，用孔径为30nm的超滤膜过滤上清液得乌饭树叶粗提液。将粗提液以2bv/h的流速过ab-8大孔吸附树脂，先用蒸馏水除杂至洗脱液为无色，再用2bv15％的乙醇以2bv/h的流速除去吸附在柱子上的非色素成分，最后用6bv60％的乙醇进行洗脱得洗脱液。
将上述洗脱液在真空度为40mbar，温度为40℃的条件下进行减压蒸发浓缩，回收有机溶剂，将浓缩液经冷冻干燥得乌饭树叶粗提物粉末601mg，提取率为60.1mg/g。
准确称取60mg乌饭树叶粗提物粉末，再称取2mg比酶活为8000u/g的α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，其中α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的质量比为1：6。
用柠檬酸盐配制缓冲液，将已称量好的酶溶解于该缓冲液中，并调节该酶缓冲液的ph至5.0(用0.1mol/l的盐酸或0.1mol/l的氢氧化钠)。
准确称取36g上述酶缓冲液(即乌饭树叶粗提物粉末与酶缓冲液的质量比为1:600)，将称量好的乌饭树叶粗提物粉末60mg溶解于该酶缓冲液中形成酶解液，再称取180mg缬氨酸(即氨基酸添加量与乌饭树叶粗提物粉末的质量比为3:1)添加到酶解液中，常温条件下反应1h即可形成靛蓝色素水溶液。
将上述靛蓝色水溶液经减压蒸发浓缩后冷冻干燥即得靛蓝色素成品，色价为96.7，该蓝色调对应潘通比色卡的色号，与其接近的色号为pantong3035c，结果见表1。
将上述靛蓝色素水溶液常温放置10天，再经减压蒸发浓缩后冷冻干燥制成靛蓝色素成品，其色价为96.0，几乎无变化
将上述靛蓝色水溶液加热至沸腾，其颜色无明显变化。
将上述靛蓝色色素成品溶于ph＝3-4的酸性溶液或者ph＝8-9的碱性溶液中，颜色无明显变化，能够稳定存在。
实施例3
实施例3的操作条件见表1，其余操作和条件与实施例2一致。
将得到靛蓝色水溶液经减压蒸发浓缩后冷冻干燥即得靛蓝色素成品，色价为92.1，该蓝色调对应潘通比色卡的色号，与其接近的色号为pantong2965c，结果见表1。
将上述靛蓝色水溶液加热至沸腾，其颜色无明显变化。
将上述靛蓝色色素成品溶于ph＝3-4的酸性溶液或者ph＝8-9的碱性溶液中，颜色无明显变化，能够稳定存在。
实施例4
实施例4的操作条件见表1，其余操作和条件与实施例1一致。
将得到靛蓝色水溶液经减压蒸发浓缩后冷冻干燥即得靛蓝色素成品，色价为91.8，结果见表1。
将上述靛蓝色水溶液加热至沸腾，其颜色无明显变化。
实施例5
实施例5的操作条件见表1，其余操作和条件与实施例1一致。
将得到靛蓝色水溶液经减压蒸发浓缩后冷冻干燥即得靛蓝色素成品，色价为82.1，结果见表1。
将上述靛蓝色水溶液加热至沸腾，其颜色无明显变化。
表1实施例1-5制备条件的设置及实验结果
其中α指的是α-葡萄糖苷酶，β指的是β-葡萄糖苷酶。
实施例6不同色调的靛蓝色素的制备
实验条件与实施例2相同，其中缬氨酸与乌饭树叶粗提物粉末的质量比分别n:1，其中，n＝1，2，……，10。制备得到的色素的色价均在94.1-97.0之间，得到的靛蓝色色素的颜色随着n的增大而加深，即从浅蓝色到蓝黑色变化。
实施例7糯米染色
按照实施例1的方法制得酶解液，再称取2g糯米加到酶解液中，50℃保温条件下反应2h后糯米表面呈现较明亮的蓝绿色。
将染色糯米干燥并放置30天后，染色糯米仍呈较明亮的蓝绿色。
将染色糯米用清水进行洗涤，得到的糯米颜色仍呈较明亮的蓝绿色，洗米水几乎无蓝色。
将清水洗涤过的染色糯米进行高温蒸煮，煮熟后的糯米为墨绿色。
实施例8破壁燕麦米染色
按照实施例2的方法制得酶解液，再称取2g破壁燕麦米加到酶解液中，50℃保温条件下反应2h后燕麦米表面呈现蓝黑色。
将染色燕麦米干燥并放置30天后，燕麦米仍呈较明亮的蓝绿色。
将染色燕麦米用清水进行洗涤，得到的燕麦米颜色仍呈较明亮的蓝绿色，洗米水几乎无颜色变化。
将清水洗涤过的染色燕麦米进行高温蒸煮，煮熟后的燕麦米为墨绿色。
对比例1
与实施例1其他步骤相同，其中乌饭树叶粗提液纯化步骤中乙醇除杂与实施例1不同，分别选用流速为1bv/h的1bv5％的乙醇、1bv20％的乙醇、0.5bv10％的乙醇、4bv10％的乙醇和流速为4bv/h的1bv10％的乙醇，以及不使用乙醇溶剂进行除杂操作，得到的靛蓝色色素样品分别为样品1-6。得到的靛蓝色色素的色价见表2。可知，除杂所用乙醇的浓度和体积对色素的提取过程影响较大，当除杂所用乙醇浓度为10-15％，用量为1-2倍柱体积(bv)，流速为1-3bv/h时的提取效果最好，且乙醇用量较少，降低成本。
表2除杂所用的乙醇对靛蓝色素制备的影响结果
对比例2(未制成酶缓冲液)
此实施例未将酶制成缓冲液，直接以干酶粉的形式加入，其余步骤和实施例1相同。
将制备靛蓝色水溶液经减压蒸发浓缩后冷冻干燥即得靛蓝色素成品，色价为70.7，该蓝色调对应潘通比色卡的色号，与其接近的色号为pantong292c。
对比例3
准确称取40mg实验室自制得到乌饭树黑色素成品(制备方法见专利cn200610040413.8中有关乌饭树树叶黑色素溶液的提取，说明书低2页，第4段，将得到的黑色素溶液减压蒸发浓缩，干燥即可得到乌饭树黑色素)，再称取2mg比酶活为8000u/g的β-葡萄糖苷酶(即酶的添加量与乌饭树叶粗提物粉末的质量比为1:20)。
用柠檬酸盐配制缓冲液，将已称量好的酶溶解于该缓冲液中，并调节该酶缓冲液的ph至4.5(用0.1mol/l的盐酸或0.1mol/l的氢氧化钠)。
准确称取16g上述酶缓冲液(即乌饭树色素成品与酶缓冲液的质量比为1:400)，将称量好的乌饭树色素成品40mg溶解于该酶缓冲液中形成酶解液，再称取80mg甘氨酸(即氨基酸添加量与乌饭树色素成品的质量比为2:1)添加到酶解液中，常温条件下反应1h，未得到靛蓝色溶液。
对比例4
取市售的两种蓝色素：①亮蓝色素，型号3844-455-9，上海麦克林生化科技有限公司；②栀子蓝，型号106441-42-3，上海曙灿实业有限公司。
将称量好的市售蓝色素40mg与2g糯米混合，进行染色，得到糯米表面呈现蓝色。同样的进行放置30天、用清水洗涤和高温蒸煮，其结果见表3。可知，本发明染色后色糯米在经过长期放置、清水洗涤后无明显颜色变化，高温蒸煮后颜色会有所加深。而使用市售蓝色素染色后的糯米长期放置后颜色略微变浅，清水洗涤和高温蒸煮使其褪色严重。
表3市售蓝色素与本发明染色方法对糯米的染色结果
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。