一种同时检测禽腺病毒I、II、III群多重荧光定量PCR试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及了一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光pcr试剂盒及检测方法。

背景技术：

禽腺病毒，双链dna病毒，属于腺病毒科禽腺病毒属。根据群特异性抗原结构不同分为3个群：i群、ii群、iii群。i群主要是传统的禽腺病毒，有12个血清型，代表株是鸡胚致死性孤儿病毒(celo)，具有共同的群特异性抗原。ii群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒(hev)、大理石脾病毒和鸡大脾病毒，它们与i群禽腺病毒无抗原相关性。iii群禽腺病毒目前只有一个成员，即减蛋综合征病毒(edsv)，它们只是部分的含有i群禽腺病毒的共同抗原。禽腺病毒引起的临床症状不一：i群腺病毒引起肉鸡出现严重的肝脏炎症，导致高感染率和高死亡率。ii群腺病毒引起鸡出现精神沉郁、脾脏肿大、血便、免疫抑制和死亡。iii群腺病毒引起禽类产蛋下降和卵壳形成不全等症状。2015年来，禽腺病毒发病区域不断扩大，给我国养禽业造成了巨大经济损失。由于不同群腺病毒之间不能形成交叉保护，故对禽腺病毒进行准确的分群检测，对禽腺病毒感染的预防和控制具有十分重要意义。

当前对于禽腺病毒的检测主要集中在i群和iii群，且采用单重凝胶电泳pcr或单重荧光定量pcr法，尚没有对禽腺病毒i群、ii群、iii群同时进行多重荧光pcr分群检测方法的公开。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光定量pcr引物和探针。

本发明的另一目的在于提供一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光定量pcr试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光定量pcr方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光定量pcr引物组，所述引物组的核苷酸序列如下所示：

i-fadv-f：5’-gcgagatycckcagatg-3’(seqidno：1)；

i-fadv-r：5’-ggaggyckgttctcgagc-3’(seqidno：2)；

ii-fadv-f：5’-gctgttgtgcgatctgaag-3’(seqidno：4)；

ii-fadv-r：5’-cattggaggagcaacggta-3’(seqidno：5)；

iii-fadv-f：5’-gtgggtgataacaggattgtg-3’，(seqidno：7)；

iii-fadv-r：5’-cgccaaaggattgtaagct-3’(seqidno：8)。

一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有上述所述的引物组。

进一步的，上述试剂盒中还含有探针组，所述探针组的核苷酸序列为：

i-fadv-p：5’-cctgggtcaaaccgaacatgtastc-3’(seqidno：3)；

ii-fadv-p：5’-tcagctttattagaaccgcaaacgag-3’(seqidno：6)；

iii-fadv-p：5’-ctacttcgacatccagggcatcttg-3’(seqidno：9)；

或者为该些序列的核苷酸互补序列。

进一步的，上述探针组的序列两端分别标有荧光基团和淬灭基团；各探针序列之间标记的荧光基团不同。

进一步的，上述试剂盒中还含有pcr反应液、taq酶液、阴性质控品、阳性质控品。

进一步的，上述pcr反应液含有200～300mmtris、45～55mmkcl、23～27mmmgcl2、0.02％～0.03％trixon-x100、4.5～5.5％甘油、6～7mmdntp。

进一步的，上述taq酶液由2.5u/μl热启动taq酶、25mmtris、30％甘油、1mmdtt组成。

一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光定量pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)从样品中提取核酸；

2)以提取的核酸为模板，用上述所述的引物组及上述所述探针组进行多重荧光定量pcr扩增反应并收集荧光信号；

3)根据荧光信号判定样品中是否含有禽腺病毒i、ii、iii群；

上述方法用于非疾病的诊断和治疗。

进一步的，上述步骤2)中的多重荧光定量pcr扩增反应体系为：

所述引物探针混合液中含有上述所述的引物组及上述所述探针组。

进一步的，上述步骤2)中多重荧光定量pcr扩增反应程序为：93～95℃，3～10min；93～95℃15～35s，52～58℃35～60s，40个循环。

本发明的有益效果是：

(1)本发明突破了普通pcr方法的限制，可同时实时定量样品中禽腺病毒i、ii、iii群的含量，灵敏度高、特异性强，重复性好。并突破了单荧光pcr检测的限制，可实现同时检测禽腺病毒i、ii、iii群，进一步减少了实验时间和成本，可根据构建的标准品dna进行定量检测；非常适合大量临床样品的检测和疫情监控，为诊断和防控疫情提供技术支持。

(2)本发明在一管反应中只进行1次pcr扩增即可对禽腺病毒i、ii、iii群进行分群的多重荧光定量检测，旨在能快速准确区分禽腺病毒i群、ii群和iii群。为禽腺病毒感染的快速预防和控制提供便利。

附图说明

图1为本发明检测禽腺病毒样本的扩增结果图；

图2为本发明检测梯度标准阳性质控品的扩增结果图；

图3为本发明检测禽腺病毒i群fam灵敏度结果图；

图4为本发明检测禽腺病毒ii群vic灵敏度结果图；

图5为本发明检测禽腺病毒iii群txr灵敏度结果图；

图6为本发明检测阴性质控品扩增结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光pcr试剂盒

(1)特异性引物及探针

本发明根据禽腺病毒i、ii、iii群的基因组序列，比对分析3类群的序列差异，然后设计大量的特异性的引物和探针，经大量实验筛选出一组同时对禽腺病毒i、ii、iii群具有高灵敏度的引物和探针序列，其序列如下：

1)i群禽腺病毒特异性的正向、反向的引物和探针序列分别是：

i-fadv-f：5’-gcgagatycckcagatg-3’(seqidno：1)；

i-fadv-r：5’-ggaggyckgttctcgagc-3’(seqidno：2)；

i-fadv-p：5’-fam-cctgggtcaaaccgaacatgtastc-bhq1-3’(seqidno：3)；

2)ii群禽腺病毒特异性的正向、反向的引物和探针序列分别是：

ii-fadv-f：5’-gctgttgtgcgatctgaag-3’(seqidno：4)；

ii-fadv-r：5’-cattggaggagcaacggta-3’(seqidno：5)；

ii-fadv-p：5’-vic-tcagctttattagaaccgcaaacgag-bhq1-3’(seqidno：6)；

3)iii群禽腺病毒特异性的正向、反向的引物和探针序列分别是：

iii-fadv-f：5’-gtgggtgataacaggattgtg-3’，(seqidno：7)；

iii-fadv-r：5’-cgccaaaggattgtaagct-3’(seqidno：8)；

iii-fadv-p：5’-txr-ctacttcgacatccagggcatcttg-bhq2-3’(seqidno：9)。

(2)一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光pcr试剂盒包括如下成分：

1)优选的引物探针混合液中引物浓度均为2.5μm，i群禽腺病毒探针浓度为1.5μm，ii群禽腺病毒探针浓度为2μm，iii群禽腺病毒探针浓度为2μm。优选的引物探针混合液经过在0.5～4μm浓度范围内以0.5μm梯度变化筛选获得。

2)优选的pcr反应液含有250mmtris、50mmkcl、25mmmgcl2、0.025％trixon-x100、5％甘油、6.5mmdntp。

3)优选的酶液含有2.5u/μl热启动taq酶、25mmtris、30％甘油、1mmdtt。优选的酶液主要是热启动taq酶在0.5～5u/μl浓度范围内以0.5u/μl梯度变化筛选获得。

4)阳性质控品

以禽腺病毒i、ii、iii类群引物扩增标准菌株，利用上述引物pcr扩增获得目的片段，然后将3段目的片段运用多片段重组方式构建与质粒载体中获得。

5)阴性质控品：为不含禽腺病毒核酸的生理盐水溶液。

实施例2一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光pcr检测方法

本实施例采用实施例1中所述的试剂盒进行相应的实时荧光定量pcr检测。

(1)核酸提取

1)本方法及试剂盒适用标本类型包括禽呼吸道分泌物、脾脏、肝脏组织、肠道内容物、分泌排泄物、卵黄和病毒培养液等。

以实际样本为例(10例)：

已知i群禽腺病毒感染鸡脾脏组织2例和致死性孤儿病毒、fadv-4细胞培养液各1例；

已知ii群禽腺病毒(火鸡出血性肠炎病毒)感染鸡肠道内容物3例；

已知iii群禽腺病毒感染鸡的卵黄3例。

其它已知样本：h9亚型禽流感、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸭瘟病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽呼肠孤病毒、马立克病毒。

2)样本处理：

组织样品：取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5ml的ep管中，8000rpm离心2min，取上清200μl于1.5ml的ep管中；液体样品直接取200μl用于dna/rna提取。

3)核酸提取：取上述处理好的样本，再用quegen的专用病毒总dna/rna核酸提取试剂盒进行核酸提取。

(2)pcr扩增

每个测试反应体系配制如下，

待检测样本的dna、阴阳性对照都加4μl。将各反应管放入定量pcr仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类，报告基团为fam、vic、txr，淬灭基团选择none，设定扩增条件：93～95℃，3～7min；93～95℃15～35s，52～58℃35～60s，40个循环。优选的扩增条件为95℃，5min；95℃20s，55℃40s，40个循环。

(3)结果分析和判定：

1、结果分析条件设定

1)设置基线(baseline)：6-15cycle荧光信号。可根据具体情况对基线适当调整。

2)设置阈值(threshold)：以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点。

2、结果判断标准

阳性：检测样本ct值小于等于35.0，且曲线有明显的指数增长期；

可疑：检测样本ct值大于35.0且小于38.0，重复一次实验，如果ct值仍小于38.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；

阴性：检测不到样本ct值或ct值大于38。

3、结果显示已知禽腺病毒i、ii、iii群的10例样本全为阳性；已知h9亚型禽流感、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸭瘟病毒、禽网状内皮组织增生病毒、禽呼肠孤病毒、马立克病毒、阴性对照组共计8例样本全为阴性。实验结果见图1所示。从中可以看出，本发明引物和探针检测靶标的准确率达100％，具有很好的特异性。

实施例3一种同时检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光pcr试剂盒灵敏度实验

用紫外分光光光度计测定阳性质控品核酸浓度为3.5×10⁶，将其依次进行10倍梯度稀释为3.5×10⁵、3.5×10⁴、3.5×10³、3.5×10²、3.5×10¹copies/ml，pcr扩增进行灵敏度实验。

检测禽腺病毒i、ii、iii群多重荧光pcr试剂盒敏感性，实验结果见图2～图6，其中图3～5分别为本发明检测禽腺病毒i群中荧光fam的灵敏度结果、ii群中荧光的vic灵敏度结果图、iii群中荧光txr灵敏度结果，图从左到右的样本浓度依次为3.5×10⁶、3.5×10⁵、3.5×10⁴、3.5×10³、3.5×10²copies/ml的扩增结果，3.5×10¹copies/ml无扩增曲线。说明本发明检测灵敏度为：3.5×10²copies/ml。图2为本发明3组引物对检测梯度标准阳性质控品的扩增结果图；图6为本发明检测阴性质控品扩增结果图。

上述结果说明本发明对禽腺病毒i、ii、iii群的检测限分别可达3.5×10²copies/ml。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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