转录效率提高的cbh1定向改造启动子Su-m3及其应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及转录效率提高的cbh1定向改造启动子su-m3及其应用。

背景技术：

里氏木霉作为主要的丝状真菌之一，具有强大的分泌纤维素酶的能力，其混合发酵液中，纤维二糖水解酶的表达占胞外总分泌蛋白的50％以上，所以cbh1启动子也被公认为很强的启动子，目前常将外源基因构建在cbh1启动子和终止子之间，构成外源基因的表达盒。cbh1启动子在转录基因表达时，受多方面因素的影响，转录效率不能满足现代工业的要求。对cbh1启动子定向改造以获得转录效率提高的启动子，用于其他外源基因的表达，具有重要意义。

技术实现要素：

为了解决现有的cbh1启动子不能满足工业要求的问题，本发明提供一种转录效率提高的cbh1定向改造启动子，改造后的cbh1启动子转率性能提高。

本发明的目的是提供一种转录效率提高的cbh1定向改造启动子su-m3。

本发明的再一目的在于提供含有上述启动子的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述启动子的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述启动子的应用。

根据本发明的具体实施方式的转录效率提高的cbh1定向改造启动子，转录效率提高的cbh1定向改造启动子su-m3，将cbh1启动子的核苷酸序列上的4处5’-aggca-3’序列及4处5’-tgcct-3’序列均替换为5’-ggctaa-3’，其中，cbh1启动子的核苷酸序列如seqidno.1所示。

cbh1启动子的核苷酸序列如seqidno.1所示：

ctcattcccgaaaaaactcggagattcctaagtagcgatggaaccggaataatataataggcaatacattgagttgcctcgacggttgcaatgcaggggtactgagcttggacataactgttccgtaccccacctcttctcaacctttggcgtttccctgattcagcgtacccgtacaagtcgtaatcactattaacccagactgaccggacgtgttttgcccttcatttggagaaataatgtcattgcgatgtgtaatttgcctgcttgaccgactggggctgttcgaagcccgaatgtaggattgttatccgaactctgctcgtagaggcatgttgtgaatctgtgtcgggcaggacacgcctcgaaggttcacggcaagggaaaccaccgatagcagtgtctagtagcaacctgtaaagccgcaatgcagcatcactggaaaatacaaaccaatggctaaaagtacataagttaatgcctaaagaagtcatataccagcggctaataattgtacaatcaagtggctaaacgtaccgtaatttgccaacggcttgtggggttgcagaagcaacggcaaagccccacttccccacgtttgtttcttcactcagtccaatctcagctggtgatcccccaattgggtcgcttgtttgttccggtgaagtgaaagaagacagaggtaagaatgtctgactcggagcgttttgcatacaaccaagggcagtgatggaagacagtgaaatgttgacattcaaggagtatttagccagggatgcttgagtgtatcgtgtaaggaggtttgtctgccgatacgacgaatactgtatagtcacttctgatgaagtggtccatattgaaatgtaagtcggcactgaacaggcaaaagattgagttgaaactgcctaagatctcgggccctcgggccttcggcctttgggtgtacatgtttgtgctccgggcaaatgcaaagtgtggtaggatcgaacacactgctgcctttaccaagcagctgagggtatgtgataggcaaatgttcaggggccactgcatggtttcgaatagaaagagaagcttagccaagaacaatagccgataaagatagcctcattaaacggaatgagctagtaggcaaagtcagcgaatgtgtatatataaaggttcgaggtccgtgcctccctcatgctctccccatctactcatcaactcagatcctccaggagacttgtacaccatcttttgaggcacagaaacccaatagtcaaccgcggactgcgcatc

根据本发明的实施方式的所述su-m3启动子，其核苷酸序列如seqidno.2所示：

ctcattcccgaaaaaactcggagattcctaagtagcgatggaaccggaataatataatggctaaatacattgagttgcctcgacggttgcaatgcaggggtactgagcttggacataactgttccgtaccccacctcttctcaacctttggcgtttccctgattcagcgtacccgtacaagtcgtaatcactattaacccagactgaccggacgtgttttgcccttcatttggagaaataatgtcattgcgatgtgtaattggctaagcttgaccgactggggctgttcgaagcccgaatgtaggattgttatccgaactctgctcgtagaggcatgttgtgaatctgtgtcgggcaggacacgcctcgaaggttcacggcaagggaaaccaccgatagcagtgtctagtagcaacctgtaaagccgcaatgcagcatcactggaaaatacaaaccaatggctaaaagtacataagttaaggctaaaaagaagtcatataccagcggctaataattgtacaatcaagtggctaaacgtaccgtaatttgccaacggcttgtgggctaacagaagcaacggcaaagccaatcttccaatcgtttgtttcttcactcagtccaatctcagctggtgatcccccaattgggtcgcttgtttgttccggtgaagtgaaagaagacagaggtaagaatgtctgactcggagcgttttgcatacaaccaagggcagtgatggaagacagtgaaatgttgacattcaaggagtatttagccagggatgcttgagtgtatcgtgtaaggaggtttgtctgccgatacgacgaatactgtatagtcacttctgatgaagtggtccatattgaaatgtaagtcggcactgaacggctaaaaagattgagttgaaacggctaaaagatctcgggccctcgggccttcggcctttgggtgtacatgtttgtgctccgggcaaatgcaaagtgtggtaggatcgaacacactgcggctaattaccaagcagctgagggtatgtgatggctaaaatgttcaggggccactgcatggtttcgaatagaaagagaagcttagccaagaacaatagccgataaagatagcctcattaaacggaatgagctagtggctaaaagtcagcgaatgtgtatatataaaggttcgaggtccgtgcctccctcatgctctccccatctactcatcaactcagatcctccaggagacttgtacaccatcttttgaggcacagaaacccaatagtcaaccgcggactgcgcatc

本发明还提供了包含上述启动子的重组表达载体，其中，在所述重组表达载体的基因表达盒的终止子的下游导入有多个重复序列tel，重复序列tel由序列tel1和序列tel2拼接，并在tel1和tel2之间加入限制性内切酶i-ceu1。重复序列tel以1-2拷贝的低拷贝数插入染色体末端、或以染色体外自主复制形式存在，其能够提高里氏木霉的转化效率。

序列tel1的核苷酸序列如seqidno.3所示：

ttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttaggg

序列tel2的核苷酸序列如seqidno.4所示：

ccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaa

序列tel的核苷酸序列如seqidno.5所示：

ttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggttagggtaactataacggtcctaaggtagcgaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaa

根据本发明的具体实施方式的重组表达载体，其含有红色荧光蛋白基因dsred，作为报告基因验证经改造的cbh1启动子的转录效率。

根据本发明的具体实施方式的重组表达载体，将cbh1启动子、红色荧光蛋白基因dsred、cbh1终止子、tel、pyr4-ampr-ori无缝串联拼接，得到重组表达载体ppcbh1-dsred-tcbh1-pyr4-tel；将su-m3启动子(经改造的cbh1启动子)、dsred、cbh1终止子、tel、pyr4-ampr-ori无缝串联拼接，得到重组表达载体psu-m3-dsred-tcbh1-pyr4-tel。将cbh1启动子、anman5a(opt)、cbh1终止子、tel、pyr4-ampr-ori通过无缝串联拼接，得到重组表达载体ppcbh1-anman5a(opt)-anman5a(opt)-tcbh1-tel；将su-m3启动子(经改造的cbh1启动子)、anman5a(opt)、cbh1终止子、tel、pyr4-ampr-ori无缝串联拼接得到重组表达载体psu-m3-anman5a(opt)-tcbh1-tel。

本发明还提供了包含上述启动子的重组菌株，优选为里氏木霉。

本发明还提供一种提高基因表达效率的方法，该方法包括使用上述启动子su-m3启动目的基因表达，其中目的基因包括纤维素酶基因及甘露聚糖酶基因。

本发明的有益效果：

本发明通过区段操作，将cbh1启动子上的多个序列进行替换，得到经改造的cbh1启动子，并将红色荧光蛋白dsred连接到该启动子的下游，作为报告基因验证启动子的转录效率，与cbh1启动子相比，获得了红色荧光显著提高的转化子。因此，改造的cbh1启动子的转录效率优于原始cbh1启动子。

附图说明

图1-1显示乳糖平板法cbh1启动子驱动dsred表达的里氏木霉菌落情况；图1-2显示乳糖平板法su-m3启动子驱动dsred表达的里氏木霉菌落情况；

图2显示转入不同启动子的转化子拷贝数；

图3显示pcr鉴定anman5a(opt)重组质粒在里氏木霉基因组中的插入结果；

图4为不同启动子驱动表达的甘露聚糖酶的酶活比较图。

具体实施方式

实施例1启动子su-m3的改造过程

将野生型cbh1启动子上的8处位点进行替换，具体如下：-147～-152位点5’-aggca-3’；-249～-254位点5’-aggca-3’；-280～-285位点5’-tgcct-3’；-374～-379位点5’-tgcct-3’；-396～-401位点5’-aggca-3’；-798～-803位点5’-tgcct-3’；-1016～-1021位点5’-tgcct-3’；-1218～-1223位点5’-aggca-3’，将上述位点全部替换为5’-ggctaa-3’，即得到su-m3启动子。

实施例2构建含有启动子cbh1和启动子su-m3的重组表达载体

为了验证启动子su-m3的转录效率，将含dsred表达质粒经转入里氏木霉中，观察是否在启动子的驱动下，转录出mrna，并翻译成红色荧光蛋白。

1.构建表达红色荧光蛋白的重组质粒：ppcbh1-dsred-tcbh1-pyr4-tel、psu-m3-dsred-tcbh1-pyr4-tel

将启动子cbh1和su-m3启动子分别与tel2以overlap的方式连接；dsred与tcbh1以overlap的方式连接；中间质粒载体是以3个片段：pcbh1-tel2和su-m3-tel2分别与dsred-tcbh1、pyr4-ampr-ori片段以无缝拼接的方式连接。测序成功后，便得到了中间质粒载体ppcbh1-dsred-tcbh1-pyr4-tel2、psu-m3-dsred-tcbh1-pyr4-tel2。

分别将上述两个中间质粒载体和tel1片段用i-ceui和spei双酶切，回收片段后，用t4连接酶连接两个片段。22℃连接1h，转化大肠杆菌trans1后，挑单克隆验证阳性转化子。最终便得到了表达质粒载体ppcbh1-dsred-tcbh1-pyr4-tel、psu-m3-dsred-tcbh1-pyr4-tel。

2.转化入里氏木霉

将里氏木霉tu-6接种于土豆培养基(pda)平板上，28℃静置培养7d待其产孢，将孢子刮下并接种于100ml含有尿嘧啶的pdb培养基中，28℃、160rpm振摇培养过夜。200目筛过滤收集萌发的菌丝，加入10mg/ml的酵母破壁酶，在30℃消化2-3小时。收集原生质体后，将用i-ceui酶切的质粒表达载体转化里氏木霉tu-6菌株。

3.筛选重组转化子

过表达质粒载体转化里氏木霉tu-6菌株，培养5-7天。待单克隆长出后，挑取单个转化子，接种于含mm-乳糖培养基的24孔板，于28℃培养5-7天。培养期间，随时观察转化子是否显色，并拍照做记录，如图1-1、1-2所示，表达红色荧光蛋白的菌落中，使用su-m3启动子的菌落较cbh1启动子的菌落红色更强，说明su-m3启动子可促进纤维酶的转录表达，且转录效率更高。

4.提取代表性转化子的基因组

为了验证cbh1启动子以及改造后的su-m3启动子在里氏木霉中的拷贝数的数目，对不同启动子样本，选择代表性的转化子，提取真菌基因组。将代表性转化子接种pda板生长、产孢7d后，接mm-glucose种子培养基2d后，收集菌丝并压干，分装于2mlep管，迅速冻于液氮中。提取时，用机器研磨菌丝1分30s，提取方法参照真菌试剂盒fungaldnakit。

5.鉴定转化子的启动子拷贝数

转化子的启动子拷贝数的鉴定采用qrt-pcr的方法，选择单一拷贝数的cbh1基因作为内参，dsred作为检测的目标基因。各选择4株具有不同荧光强度的代表性的pcbh1和su-m3的转化子，基因组dna的浓度稀释至1-2ng/μl，取1μl为模板；分别扩增cbh1基因和dsred基因。dsred基因的拷贝数用2-^△△ct法相对定量。

dsred基因是和启动子物理联系在一起并驱动其转录表达的，所以理论上，dsred的拷贝数的差异可以作为不同启动子的拷贝数的差异。如图2所示，包含su-m3的转化子保持在1～2拷贝的低拷贝数。

实施例3.验证su-m3启动子启动外源基因anman5a(opt)表达的效果

本发明应用改造的su-m3启动子，在里氏木霉中表达异源甘露聚糖酶，与cbh1启动子相比，获得了甘露聚糖酶酶活显著提高的转化子。经转入里氏木霉sus1中，在cbh1和su-m3启动子的驱动下，转录出mrna，并翻译成甘露聚糖酶。

1.构建ppcbh1-anman5a(opt)-tcbh1-tel、psu-m3-anman5a(opt)-tcbh1-tel质粒

将片段pcbh1-tel和su-m3-tel分别与anman5a(opt)、tcbh1-ori-ampr，按照无缝拼接试剂盒的方法在37℃，连接30min连接后，转化入大肠杆菌trans1，挑单克隆验证阳性转化子。最终便得到了表达质粒载体ppcbh1-anman5a(opt)-tcbh1-tel、psu-m3-anman5a(opt)-tcbh1-tel。提取质粒，备用于转化。

2.用质粒转化入里氏木霉

将里氏木霉sus1接种于土豆培养基(pda)平板上，28℃静置培养5d待其产孢后，将孢子刮下并接种于100ml含有尿嘧啶的pdb培养基中，28℃、160rpm振摇培养过夜。200目筛过滤收集萌发的菌丝，加入10mg/ml的酵母破壁酶，在30℃消化2-3小时。收集原生质体后，用i-ceui酶切的质粒表达载体转化里氏木霉sus1菌株。

3.筛选重组转化子

转化子在含1m山梨醇的mm-glucose琼脂培养基上生长、选择。挑取单个克隆，接种于25ml液体mm-glucose中，28℃、160rpm振摇培养2d。提取基因组dna以其为模板，进行pcr验证，在1％琼脂糖凝胶上验证不同启动子驱动的anman5a(opt)载体是否成功转入里氏木霉。将鉴定为阳性的转化子和出发菌株的孢子，接种至pda平板上，28℃培养4～7天。

如图3所示，在1％琼脂糖胶上电泳，其中，m为dna分子量；1-8验证ppcbh1-anman5a(opt)-tcbh1-tel质粒在里氏木霉基因组中的插入情况，9-16验证psu-m3-anman5a(opt)-tcbh1-tel在里氏木霉基因组中的插入情况，箭头所指为预期的目的条带。因此，这些转化子是含anman5a(opt)质粒转入的阳性转化子。将阳性转化子接种于pda培养基上，30℃静置培养7d产孢，收集孢子备用。

4.测定甘露聚糖酶酶活

采用角豆胶作为底物进行甘露聚糖酶酶活的测定。称量0.5g角豆胶，用0.1m柠檬酸-0.2m磷酸氢二钠缓冲液(ph5.0)定容至100ml，配置0.5％角豆胶底物。取酶液100μl，加入到900μl底物中，振荡混合均匀，50℃水浴保温15min后，向各试管中加入1.5mldns试剂，再向空白中加酶液0.1ml，混合均匀。在沸水中煮5min，迅速冷却，测定540nm的吸光度。在50℃、ph5.0的条件下，每分钟水解角豆胶底物，产生1μmol还原糖(以甘露糖计)所需要的酶量定义为一个酶活力单位(u)。

酶活测定如图4所示，转化子在mm-avicel中培养6天后，pcbh1-anman5a(opt)的甘露聚糖酶酶活为5.27u/ml，而su-m3-anman5a(opt)的甘露聚糖酶酶活为24.2u/ml，较cbh1启动子的菌株提高了4.59倍。因此，使用su-m1启动子的转化子表达甘露聚糖酶的活性要显著高于使用cbh1启动子的转化子。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>转录效率提高的cbh1定向改造启动子su-m3及其应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1281

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ctcattcccgaaaaaactcggagattcctaagtagcgatggaaccggaataatataatag60

gcaatacattgagttgcctcgacggttgcaatgcaggggtactgagcttggacataactg120

ttccgtaccccacctcttctcaacctttggcgtttccctgattcagcgtacccgtacaag180

tcgtaatcactattaacccagactgaccggacgtgttttgcccttcatttggagaaataa240

tgtcattgcgatgtgtaatttgcctgcttgaccgactggggctgttcgaagcccgaatgt300

aggattgttatccgaactctgctcgtagaggcatgttgtgaatctgtgtcgggcaggaca360

cgcctcgaaggttcacggcaagggaaaccaccgatagcagtgtctagtagcaacctgtaa420

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<210>3

<211>90

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<210>4

<211>90

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaa60

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<210>5

<211>207

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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