修饰的TGF-β寡核苷酸的制作方法

技术背景转化生长因子β(tgf-β)是一种在大多数细胞中控制增殖、细胞分化和其他功能的蛋白质。它是一种类型的细胞因子，其在免疫、癌症、心脏病、糖尿病、马凡综合征、洛伊斯-迪茨综合征、帕金森病和aids等中起作用。tgf-β是一种分泌的蛋白，其以至少三种同种型的形式存在(tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3)，由不同基因编码，但共有强序列和结构同源性。tgf-β在正常上皮细胞和癌发生的早期以抗增殖因子的形式起作用。然而，在肿瘤发展的晚期，tgf-β通过包括诱导上皮至间质瘤转变(emt)的机制促进肿瘤，该转变是一种被认为参与肿瘤进展、侵染和转移的过程(参见“glycoproteomicanalysisoftwomousemammarycelllinesduringtransforminggrowthfactor(tgf)-betainducedepithelialtomesenchymaltransition(转化生长因子(tgf)-β诱导的上皮至间质瘤转变期间两种小鼠乳腺细胞系的糖蛋白质组学分析)”7thspace.com.2009-01-08.恢复：2009-01-29)。在正常(上皮)细胞中，tgf-β在gi期停止细胞周期(并停止细胞增殖)、诱导分化或促进凋亡。当细胞转化为癌细胞时，tgf-β不再抑制细胞增殖，其通常是信号转导途径中突变的结果，且癌细胞增殖。间质成纤维细胞的增殖也由tgf-β诱导。两种细胞都提高其tgf-β生产。该tgf-β作用于周围间质细胞、免疫细胞、内皮、平滑肌细胞和肿瘤微环境(参见pickupet等，“therolesoftgf6inthetumourmicroenvironment(肿瘤微环境中tgf6的作用)”，naturereviewscancer(2013),13:788-799)。因而，其促进血管生成，并通过抑制增殖和免疫细胞的激活导致免疫抑制。tgf-β1缺陷型小鼠死于心、肺和胃炎症，暗示tgf-β在抑制炎性细胞激活和增殖方面至关重要。smad3是tgf-β依赖性下游信号通路中的关键元件之一。smad3缺陷型小鼠由于t细胞激活和粘膜免疫受损而发生慢性粘膜感染，暗示tgf-β在这些过程中的关键作用。对于癌症，某些癌细胞产生和分泌的tgf-β抑制浸润性免疫细胞的活性，从而帮助肿瘤逃脱宿主免疫监控。该免疫抑制作用可以是另一种重要机制，tgf-β通过该机制刺激晚期肿瘤的生长(参加blobegc等，2000年5月，“roleoftransforminggrowthfactorbetainhumandisease(人疾病中转化生长因子β的作用)”,n.engl.j.med.342(18),1350-1358)。tgf-β还将正常情况下使用炎性(免疫)反应攻击癌症的效应t细胞转化为关闭炎性反应的调节性(抑制)t细胞。此外，tgf-β是胞外基质产生和沉积的最有力调控因子之一。其通过两种主要机制刺激胞外基质的产生并影响其粘附性质。首先，tgf-β刺激成纤维细胞和其他细胞产生胞外基质蛋白和细胞粘附蛋白，包括胶原、纤连蛋白和整联蛋白。其次，tgf-β减少降解胞外基质的酶(包括胶原酶、肝素酶和间质溶解素)的产生，并增加抑制降解胞外基质的酶的蛋白质(1型纤溶酶原激活物抑制剂和金属蛋白酶的组织抑制剂)的产生。这些变化的净作用是增加胞外基质蛋白的产生并以细胞特异性方式提高或降低细胞的粘附性质。tgf-β产生在许多癌细胞中增加，其通过提高细胞的蛋白水解活性和促进其结合细胞粘连分子来提高细胞的侵染性(参见blobegc等，2000年5月，"roleoftransforminggrowthfactorbetainhumandisease(人疾病中转化生长因子β的作用)",n.engl.j.med.342(18),1350-1358)。因此，能够分别影响tgf-β表达和活性的治疗剂至关重要，特别是用于预防和/或治疗tgf-β相关疾病时。例如，ep1008649和ep0695354公开了与tgf-β1和/或tgf-β2的mrna杂交的寡核苷酸，且其适用于制造例如用于预防和/或治疗癌症的药物组合物。这些寡核苷酸无一包含诸如lna、ena等的修饰。例如，wo2003/85110、wo2005/061710和wo2008/138904涉及可用于治疗癌症的包含核苷酸修饰的寡核苷酸，其分别涉及抑制hif-1a、bcl-2和her3。寡核苷酸选择的标准主要是寡核苷酸的长度、gc百分比、形成发夹结构的趋势、二聚化和解链温度(tm)。通常，优选高tm(解链温度)。此外，这些寡核苷酸必须特异性针对靶mrna且不与非靶mrna杂交以降低潜在的脱靶作用。因此，科学和医疗上非常需要降低或抑制tgf-β表达和/或活性的治疗剂。具体而言，持续需要诸如反义寡核苷酸的寡核苷酸，其与tgf-β1、tgf-β2和/或tgf-β3特异性相互作用并因此降低或抑制其表达，或者特异性抑制tgf-β1和tgf-β2、或tgf-β1和tgf-β3、或tgf-β2和tgf-β3的表达，而不导致任何(严重的)副作用。技术实现要素：本发明涉及的寡核苷酸由seqidno.1的tgf-β2核酸序列(参见图2)或seqidno.335的tgf-β1核酸序列(参见图12)或seqidno.336的tgf-β3核酸序列(参见图25)的10-20个(优选12-18个)核苷酸组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。本发明的一些寡核苷酸对应于tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3，或tgf-β1和tgf-β2或tgf-β1和tgf-β3或tgf-β2和tgf-β3。优选的寡核苷酸包含seqidno.2-149(tgf-β2)之一、seqidno.150-334(tgf-β1)之一或seqidno.337-402(tgf-β3)之一或由其组成，其示于表1。具体而言，本发明的寡核苷酸包含seqidno.1的第1380-1510位核酸区域的10-20个(优选12-18个)核苷酸或由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑制tgf-β2表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或由以下序列组成：seqidno.2(如asph36:gaccagatgcagga)、seqidno.3(如asph80:gcgaccgtgaccagat)、seqidno.4(如asph98:gcgcgaccgtgacc)、seqidno.5(如asph111:agcgcgaccgtga)，或seqidno.6(如asph121或asph153:gaccgtgaccagat)、seqidno.7(如asph15:ctgcccgcggat)、seqidno.8(如asph17:tctgcccgcggat)、seqidno.9(如asph26或asph27:ggatctgcccgcgga)、seqidno.10(如asph37:cttgctcaggatctgcc)、seqidno.11(如asph52或53:gctcaggatctgcccgcgga)、seqidno.12(如asph112:ggatcgcctcgat)、seqidno.13(如asph119:ccgcggatcgcc)，或seqidno.31(如asph30:cgatcctcttgcgcat)。在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含seqidno.1的tgf-β2核酸序列的第2740-2810位核酸区域的10-20个(优选12-18个)核苷酸或由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑制tgf-β2表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或由以下序列组成：seqidno.57(如asph65:tctgaactagtaccgcc)、seqidno.73(如asph82:aactagtaccgccttt)，或seqidno.103(如asph115:ctagtaccgcctt)。在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含seqidno.1的tgf-β2核酸序列的第1660-1680位核酸区域的10-20个(优选12-18个)核苷酸或由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑制tgf-β1和/或tgf-β2表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或由以下序列组成：seqidno.14(如ashp01或asph02:acctccttggcgtagta)、seqidno.15(如asph03或asph04:cctccttggcgtagta)、seqidno.16(如asph05、asph06或asph07:ctccttggcgtagta)，或seqidno.17(如asph08:tccttggcgtagta)。在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含seqidno.1的tgf-β2核酸序列的第2390-2410位核酸区域的10-20个(优选12-18个，最优选13个)核苷酸或由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑制tgf-β1、tgf-β2和/或tgf-β3表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或由以下序列组成：seqidno.18(如asph9或asph10:cagaagttggcat)。在另一个实施方式中，本发明涉及一种寡核苷酸，其包含seqidno.1的tgf-β2核酸序列的10-20个(优选12-18个)核苷酸或由其组成，该寡核苷酸中的一个或多个核苷酸是经修饰的。这些寡核苷酸分别在降低和抑制tgf-β1、tgf-β2和/或tgf-β3(且最优选tgf-β2)表达和活性方面高度有效。优选的寡核苷酸包含或由以下序列之一组成：seqidno.19-56、58-72、74-102、104-138(例如ashp11-asph14、asph16、asph18-asph25、asph28-asph35、asph38-asph51、asph60-64、asph66-asph79、asph81、asph83-asph97、asph99-asph110、asph113、asph114、asph116-118、asph120、asph122-asph152、asph154-asph183，或t-lna(seqidno:144))。本发明中优选的寡核苷酸分别是asph01、asph03、asph05、asph17、asph22、asph26、asph27、asph35、asph36、asph37、asph45、asph47、asph48、asph65、asph69、asph71、asph80、asph82、asph98、asph105、asph115、asph190、asph191、asph192和asph193。本发明中其他优选的寡核苷酸是表1所示的asph1000至asph1132，其优选抑制tgfβ1mrna的表达和/或活性。该组中优选的寡核苷酸分别是例如asph1047、asph1051、asph1059、asph1106、asph1139、asph1150、asph1162、asph1163、asph1175、asph1178和asph1181。在替代性实施方式中，寡核苷酸优选抑制tgfβ3mrna的表达和/或活性。这类寡核苷酸分别是例如asph2000、asph2001、asph2002、asph2003、asph2004、asph2005、asph2006、asph2007、asph2008、asph2009、asph2010、asph2011、asph2012、asph2013、asph2014、asph2015、asph2016、asph2017、asph2018、asph2019、asph2020、asph2021、asph2022、asph2023、asph2024、asph2025、asph2026、asph2027、asph2028、asph2029、asph2030、asph2031、asph2032、asph2033、asph2034、asph2035、asph2036、asph2037、asph2038、asph2039、asph2040、asph2041、asph2042、asph2043、asph2044、asph2045、asph2046、asph2047、asph2048、asph2049、asph2050、asph2051、asph2052、asph2053、asph2054、asph2055、asph2056、asph2057、asph2058、asph2059、asph2060、asph2061、asph2062、asph2063、asph2064、asph2065和asph2066。本发明的寡核苷酸显示对tgf-β1、tgf-β2或tgf-β3，或tgf-β1和tgf-β2的意料之外的强且特异性抑制。或者，本发明的寡核苷酸显示对tgf-β1和tgf-β3或tgf-β1和tgf-β2或tgf-β2和tgf-β3，并在另一情况下显示对tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3的强且特异性抑制。本发明的核苷酸中的一个或多个核苷酸的修饰选自lna、ena、聚环氧烷(如三甘醇(teg))、2'-氟、2'-o-甲氧基和2'-o-甲基。这些修饰优选位于寡核苷酸的5'和/或3'端。包含这类修饰的核苷酸的寡核苷酸是修饰的寡核苷酸。修饰的核苷酸是排列为例如一列(彼此直接紧邻)或不同的模式(此时一个或多个未修饰的核苷酸在一个修饰的核苷酸后)。例如，寡核苷酸以一个或多个修饰的核苷酸起始，随后是一个或多个(如一个、两个、三个或四个)未修饰的或未锁定的(unlocked)核苷酸，随后再是一个或多个修饰的核苷酸。在一个实施方式中，该寡核苷酸的两端都包含相同模式的修饰的和未修饰的或未锁定的核苷酸。在另一个实施方式中，3'和5'端的修饰模式不同，包括一端不包含修饰的核苷酸。优选地，修饰的寡核苷酸包含连续8或9个未锁定的核苷酸。或者，该寡核苷酸中任何其他位置的核苷酸，或者该寡核苷酸的5'和/或3'端处和该寡核苷酸中的任何其他位置的至少一个核苷酸是经修饰的。例如，asph1071、asph1100、asph1109、asph1110、asph1111、asph1115、asph1126、asph1127和asph1128属于一组tgf-β寡核苷酸，例如tgf-β1寡核苷酸，其包含处于不同模式(例如由未锁定的核苷酸隔开彼此)中的修饰的核苷酸(如lna、ena等)。这些寡核苷酸包含一种类型的修饰，或一种或多种不同的修饰。任选地，寡核苷酸的两个连续核苷酸(修饰或未修饰的)之间的至少一个磷酸连接是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。在优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸是硫代磷酸酯。此外，本发明涉及tgf-β反义寡核苷酸，其与超过一种tgf-β同种型相互作用并抑制其表达，即使在寡核苷酸与tgf-β1、tgf-β2和/或tgf-β3序列非100％互补的情况下也是如此。这类反义寡核苷酸分别是例如asph1024、asph1096、asph1131和asph1132。这些寡核苷酸优选与不同物种(如人和小鼠)的tgf-β序列相互作用，例如分别是asph1131和asph1132。不同实施方式的所有寡核苷酸均用于预防和/或治疗以下疾病的方法：恶性或良性肿瘤、免疫疾病、纤维化(如特发性肺纤维化、肾脏纤维化、肾纤维化)、硬化(肝硬化)、硬皮病或相关皮肤疾病、眼疾病(如青光眼或后囊膜混浊(pco))、cns疾病、脱发等。附图说明图1显示核苷酸修饰的示例。图2显示人tgf-β2mrna的核酸序列(nm_003238.3)。图3a)至3c)显示人a172神经胶质瘤细胞中tgf-β1和tgf-β2mrna表达的抑制。以10nm的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸转染a172细胞(在转染试剂存在的情况下)，并在转染后24小时测量tgf-β1(白色柱)和tgf-β2(黑色柱)mrna表达的抑制。图3a)是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph01、asph02、asph03、asph04、asph05、asph06、asph07、asph08、asph09、asph10、asph11、asph12、asph13、asph14、asph15、asph16、asph17、asph18、asph19、asph20、asph21、asph22、asph24、asph25、asph26、asph27、asph29、asph30、asph31、asph32、asph33、asph34、asph35、asph36、asph37、asph38、asph39、asph40、asph41、asph42、asph43、asph44、asph45、asph46、asph47、asph48、asph49、asph50、asph51、asph52、asph53和asph54；图3b)是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph36、asph60、asph61、asph62、asph63、asph64、asph65、asph66、asph67、asph68、asph69、asph70、asph71、asph72、asph73、asph74、asph75、asph76、asph77、asph78、asph79、asph80、asph81、asph82、asph83、asph84、asph85、asph86、asph87、asph88、asph89、asph90、asph91、asph92、asph93、asph94、asph95、asph96、asph97、asph98、asph99、asph100、asph101、asph102、asph103、asph104、asph105、asph106、asph107、asph108、asph109、asph110、asph111、asph112、asph113、asph114、asph115、asph116、asph117、asph118和asph119；且图3c)是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph36、asph71、asph73、asph120、asph121、asph122、asph123、asph124、asph125、asph126、asph127、asph128、asph129、asph130、asph131、asph132、asph133、asph134、asph135、asph136、asph137、asph138、asph139、asph140、asph141、asph142、asph143、asph145、asph146、asph147、asph148、asph149、asph150、asph151、asph152、asph153、asph154、asph155、asph157、asph158、asph160、asph161、asph162、asph163、asph164、asph165、asph166、asph167、asph168、asph169、asph170、asph171、asph172、asph173、asph174、asph175、asph176、asph177、asph178、asph179、asph180、asph181、asph182和asph183。实验描述于实施例1。图4a)至4c)显示人panc-1胰腺癌细胞中tgf-β1和tgf-β2mrna表达的抑制。以10nm的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸转染panc-1细胞(在转染试剂存在的情况下)，并在转染后24小时测量tgf-β1(白色柱)和tgf-β2(黑色柱)mrna表达的抑制。图4a)是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph01、asph02、asph03、asph04、asph05、asph06、asph07、asph08、asph12、asph14、asph17、asph18、asph20、asph21、asph22、asph24、asph25、asph26、asph27、asph29、asph30、asph31、asph32、asph33、asph35、asph36、asph37、asph38、asph39、asph40、asph41、asph42、asph43、asph44、asph45、asph46、asph47、asph48、asph49、asph50、asph51和asph52；图4b)是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph36、asph60、asph61、asph62、asph63、asph64、asph65、asph66、asph67、asph68、asph69、asph70、asph71、asph72、asph73、asph74、asph75、asph76、asph77、asph78、asph79、asph80、asph81、asph82、asph83、asph84、asph85、asph86、asph87、asph88、asph89、asph90、asph91、asph92、asph93、asph94、asph96、asph97、asph98、asph99、asph100、asph101、asph102、asph103、asph104、asph105、asph106、asph107、asph108、asph109、asph110、asph111、asph112、asph113、asph114、asph115、asph116、asph117、asph118和asph119；且图4c)是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph36、asph71、asph73、asph120、asph121、asph122、asph127、asph128、asph129、asph130、asph131、asph132、asph133、asph135、asph136、asph137、asph139、asph141、asph142、asph143、asph145、asph146、asph147、asph149、asph150、asph151、asph152、asph153、asph154、asph155、asph157、asph160、asph161、asph162、asph163、asph164、asph165、asph166、asph167、asph168、asph169、asph170、asph171、asph172、asph173、asph174、asph175、asph176、asph177、asph178、asph179、asph180、asph181、asph182和asph183。实验描述于实施例2。图5显示panc-1细胞中tgf-β1和tgf-β2mrna表达的抑制。在不存在任何转染试剂的情况下，以3.3μm的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸处理panc-1细胞(自主转染或无协助转染或自主递送)，并在72小时后测量tgf-β1(白色柱)和tgf-β2(黑色柱)mrna表达的抑制。图5是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph17、asph18、asph22、asph25、asph33、asph35、asph36、asph41、asph42、asph45、asph46、asph47、asph48、asph49、asph65、asph66、asph67、asph69、asph71、asph79、asph80、asph82、asph88、asph89、asph90、asph91、asph98、asph99、asph102、asph105、asph111、asph115、asph119、asph121、asph139、asph140、asph146、asph151、asph153、asph165、asph171、asph172、asph176、asph178、asph180和asph183。实验描述于实施例4。图6和图7显示panc-1细胞中tgf-β1(图6a)和tgf-β2(图6b)mrna表达的抑制以及tgf-β1(图7a)和tgf-β2(图7b)蛋白质的抑制。通过自主递送(gymnoticdelivery)(即不存在任何转染剂)以10μm的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸处理panc-1细胞，并在转染后4天测量tgf-β1和tgf-β2mrna表达和蛋白质的抑制。图6a)和图6b)显示以下修饰的寡核苷酸的结果：asph01、asph03、asph05、asph09、asph17、asph18、asph22、asph35、asph36、asph37、asph41、asph45、asph46、asph47和asph48，分别是mrna(图7a)和蛋白质(图7b)水平。实验描述于实施例5。图8显示修饰的寡核苷酸asph05和asph36对于tgf-β1和tgf-β2mrna表达的剂量依赖的作用。在不存在转染试剂的情况下，使用15μμ、10μμ、7.5μμ、5μμ、2.5μμ、1.25μμ或0.625μμ的asph05(双重tgf-β1和tgf-β2寡核苷酸)或asph36(选择性tgf-β2寡核苷酸)修饰的核苷酸处理panc-1细胞持续4天。4天后测量剩余的tgf-β1(图8a)和tgf-β2(图8b)mrna。实验描述于实施例6。图9显示小鼠sma-560神经胶质瘤细胞中tgf-β1和tgf-β2mrna表达的抑制。以10nm的剂量使用asph01、asph03、asph05、asph09、asph17、asph18、asph22、asph26、asph36、asph37、asph41、asph42、asph45、asph46、asph47或asph48转染sma-560细胞(在转染试剂存在的情况下)。转染后24小时测定小鼠tgf-β1(白色柱)和tgf-β2(黑色柱)mrna表达的抑制。实验描述于实施例7。图10的体内数据显示通过连续5天皮下注射14mg/kg体重asph01、asph03、asph05、asph17、asph22、asph37、asph41、asph45、asph46、asph47或asph48来对雌性胸腺裸小鼠进行治疗。最后一次治疗后24小时，处死小鼠并在肾组织裂解液中定量小鼠tgf-β2mrna。tgf-β2与gapdhmrna比例的数据显示于箱线图中，其中显示了中值、最小值和最大值(数据表示为n＝4，例外是asph46组n＝3)。实验描述于实施例8。图11显示panc-1细胞中tgf-β3mrna表达的抑制。在不存在任何转染试剂的情况下，以10μm的剂量使用asph09处理panc-1细胞(自主转染或无协助转染)，并在4天后测量tgf-β3mrna表达的抑制。asph09是一种泛特异性寡核苷酸，其抑制tgf-β3以及tgf-β1和tgf-β2的表达(图6a和6b)。实验描述于实施例9。图12显示人tgf-β1mrna的核酸序列(nm_000660.4)。图13显示人panc-1胰腺癌细胞中tgf-β1mrna表达的抑制。以10nm的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸转染panc-1细胞(在转染试剂存在的情况下)，并在转染后24小时测量tgf-β1mrna表达的抑制。图13是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph05、asph09、asph1000、asph1001、asph1002、asph1003、asph1004、asph1005、asph1006、asph1007、asph1008、asph1009、asph1010、asph1011、asph1012、asph1013、asph1014、asph1015、asph1016、asph1017、asph1018、asph1019、asph1020、asph1021、asph1022、asph1023、asph1024、asph1026、asph1027、asph1028、asph1029、asph1030、asph1031、asph1032、asph1033、asph1034、asph1035、asph1036、asph1038、asph1039、asph1040、asph1041、asph1042、asph1043、asph1044、asph1045、asph1046、asph1047、asph1048、asph1049、asph1050、asph1051、asph1052、asph1054、asph1055、asph1056、asph1057、asph1058、asph1059、asph1060和asph1061。实验描述于实施例12。图14显示小鼠sma-560神经胶质瘤细胞中tgf-β1mrna表达的抑制。以10nm的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸转染细胞(在转染试剂存在的情况下)，并在转染后24小时测量tgf-β1mrna表达的抑制。图14是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph09、asph1000、asph1001、asph1002、asph1003、asph1004、asph1005、asph1006、asph1007、asph1008、asph1009、asph1010、asph1011、asph1012、asph1013、asph1014、asph1015、asph1016、asph1017、asph1018、asph1019、asph1020、asph1021、asph1022、asph1023、asph1024、asph1026、asph1027、asph1028、asph1029、asph1030、asph1031、asph1032、asph1033、asph1034、asph1035、asph1036、asph1037、asph1038、asph1039、asph1040、asph1041、asph1042、asph1043、asph1044、asph1045、asph1046、asph1047、asph1048、asph1049、asph1050、asph1051、asph1052、asph1053、asph1054、asph1055、asph1056、asph1057、asph1058、asph1059、asph1060、asph1061和asph1062。实验描述于实施例13。图15显示人a172细胞中tgf-β1和tgf-β2mrna表达的抑制。以10nm的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸转染细胞(在转染试剂存在的情况下)，并在转染后24小时测量tgf-β1和tgf-β2mrna表达的抑制。图15是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph05、asph09、asph1000、asph1001、asph1002、asph1004、asph1005、asph1006、asph1007、asph1008、asph1009、asph1010、asph1011、asph1012、asph1013、asph1014、asph1015、asph1016、asph1017、asph1018、asph1019、asph1020、asph1021、asph1022、asph1023、asph1024、asph1026、asph1027、asph1028、asph1029、asph1030、asph1031、asph1032、asph1033、asph1034、asph1035、asph1036、asph1038、asph1039、asph1040、asph1041、asph1042、asph1043、asph1044、asph1045、asph1046、asph1047、asph1048、asph1049、asph1050、asph1051、asph1052、asph1053、asph1054、asph1056、asph1057、asph1058、asph1059、asph1060、asph1061和asph1062。实验描述于实施例14。图16显示panc-1细胞中tgf-β1和tgf-β2mrna表达的抑制。在不存在任何转染试剂的情况下，以3.3μm的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸处理panc-1细胞(自主转染或无协助转染或自主递送)，并在转染后72小时测量tgf-β1(黑色柱)和tgf-β2(白色柱)mrna表达的抑制。图16是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph05、asph09、asph1000、asph1001、asph1002、asph1004、asph1006、asph1007、asph1008、asph1009、asph1010、asph1011、asph1012、asph1013、asph1014、asph1015、asph1017、asph1018、asph1019、asph1020、asph1021、asph1022、asph1024、asph1026、asph1027、asph1028、asph1029、asph1032、asph1033、asph1034、asph1035、asph1036、asph1037、asph1038、asph1039、asph1040、asph1041、asph1042、asph1043、asph1044、asph1045、asph1046、asph1047、asph1049、asph1050、asph1051、asph1052、asph1053、asph1054、asph1055、asph1056、asph1057、asph1058、asph1059、asph1060、asph1061和asph1062。实验描述于实施例15。图17显示人a172细胞中tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3mrna表达的抑制。以10nm的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸转染细胞(在转染试剂存在的情况下)，并在转染后24小时测量tgf-β1(黑色柱)、tgf-β2(白色柱)和tgf-β3(条纹柱)mrna表达的抑制。图17是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph09、asph1047、asph1051、asph1059、asph1063、asph1064、asph1065、asph1066、asph1067、asph1068、asph1069、asph1070、asph1071、asph1072、asph1073、asph1074、asph1075、asph1076、asph1077、asph1078、asph1079、asph1080、asph1081、asph1082、asph1083、asph1084、asph1085、asph1086、asph1087、asph1088、asph1089、asph1090、asph1091、asph1092、asph1093、asph1094、asph1095、asph1097、asph1098、asph1099、asph1100、asph1101、asph1102、asph1103、asph1104、asph1105、asph1106、asph1107、asph1108、asph1109、asph1110、asph1111、asph1112、asph1113、asph114、asph1115、asph1116、asph1117、asph1118、asph1119、asph1120、asph1121、asph1122、asph1123、asph1124、asph1125、asph1126、asph1127、asph1128、asph1129、asph1130、asph1131和asph1132。实验描述于实施例16。图18a显示人panc-1和renca细胞中tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3mrna表达的抑制。在不存在任何转染试剂的情况下，以3.3μm的剂量使用不同的修饰的寡核苷酸转染细胞(自主转染或无协助转染或自主递送)，并在转染后72小时测量tgf-β1(黑色柱)、tgf-β2(白色柱)和tgf-β3(条纹柱)mrna表达的抑制。图18a是以下修饰的寡核苷酸的结果：asph1063、asph1064、asph1065、asph1066、asph1067、asph1068、asph1069、asph1070、asph1071、asph1072、asph1073、asph1074、asph1075、asph1076、asph1077、asph1078、asph1079、asph1080、asph1081、asph1082、asph1083、asph1084、asph1085、asph1086、asph1087、asph1088、asph1089、asph1090、asph1091、asph1092、asph1093、asph1094、asph1095、asph1097、asph1098、asph1099、asph1100、asph1101、asph1102、asph1103、asph1104、asph1105、asph1106、asph1107、asph1108、asph1109、asph1110、asph1111、asph1112、asph1113、asph114、asph1115、asph1116、asph1117、asph1118、asph1119、asph1120、asph1121、asph1122、asph1123、asph1124、asph1125、asph1126、asph1127、asph1128、asph1129、asph1130、asph1131和asph1132。图18b显示renca细胞中这些寡核苷酸的抑制效果。图19显示asph1024和asph1096与人tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3mrna序列的序列比对。两种寡核苷酸都与人tgf-β1序列100％同源。asph1024与人tgf-β2序列之间存在三个错配(图19a)且与人tgf-β3序列之间存在两个错配(图19b)。asph1096与人tgf-β2序列之间存在一个错配(图19a)且与人tgf-β3序列之间存在一个错配(图19b)。两种寡核苷酸都显示对不同人tgf-β同种型(tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3)的抑制。例如，asph1024抑制tgf-β1和tgf-β2的表达和活性(参见图16)且asph1096抑制tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3的表达和活性(例如参见图17)。与人tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3序列100％同源的asph009用作对照。图20显示asph1131和asph1132与人tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3mrna序列的序列比对。两种寡核苷酸都与人tgf-β1和tgf-β3序列100％同源。asph1131和asph1132各自与人tgf-β2序列之间存在一个错配。两种寡核苷酸都强力抑制全部三种人同种型的表达，例如参见图17。图21显示asph1131和asph1132与鼠tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3mrna序列的序列比对。两种寡核苷酸都与鼠tgf-β1和tgf-β3序列100％同源。asph1131和asph1132各自与鼠tgf-β2序列之间存在两个错配。asph1131强力抑制鼠tgf-β2和tgf-β3，而asph1132非常强力地抑制所有鼠tgf-β同种型，例如参见图18b。图22显示携带皮下人胰腺癌panc-1的小鼠的肾中tgf-β2mrna的表达。在所示治疗方案后使用1、3、10和30mg/kg的asph47治疗小鼠，持续5天：q1dx1-d6(单次sc注射，5天后终止)，q1dx5-d6(每天sc注射持续5天，24小时后终止)以及q1dx5-d10(每天sc注射持续5天，5天后终止)。通过bdna试验检测tgf-β2表达并标准化至gapdh。tgf-β2与gapdhmrna比例的数据显示于箱线图中，其中显示了中值、最小值和最大值(数据表示为n＝10，例外是载剂和3mg/kgq1dx1d6组n＝9)。图23显示携带人胰腺癌panc-1肿瘤的小鼠的肾中tgf-β2mrna的表达。使用所示治疗剂量通过皮下注射多种寡核苷酸对小鼠连续治疗5天：每天注射1、5、15或50mg/kg寡核苷酸，连续注射5天。通过bdna试验检测tgf-β2mrna表达并标准化至gapdh。tgf-β2与gapdhmrna比例的数据显示于箱线图中，其中显示了中值、最小值和最大值(数据表示为n＝5)。图24显示皮下人肾细胞癌786-o肿瘤中tgf-β2mrna的表达。通过每天注射50mg/kg寡核苷酸对小鼠连续治疗5天。通过bdna检测tgf-β2和gapdhmrna表达。tgf-β2与gapdhmrna比例的数据显示于箱线图中，其中显示了中值、最小值和最大值(数据表示为n＝10，例外是asph71组n＝9)。图25显示人tgf-β3mrna的核酸序列(nm_003239.2)。图26显示本发明的寡核苷酸对tgf-β1和tgf-β2蛋白质表达的抑制作用。使用20、6.67、2.22、0.74、0.25、0.08或0.009μμ的修饰的寡核苷酸asph47(图26a)、asph1047(图26b)、asph1106(图26c)、asph1132(图26d)或asph47与asph1047联用(图26e)转染panc-1细胞。阴性对照是浓度为40、13.33、4.44、1.48、0.49、0.16、0.05或0.02μμ的seqidno.145的错义寡核苷酸(scrlna)(图26f)。通过elisa测定细胞上清液中的tgf-β1(菱形)和tgf-β2蛋白质(方形)水平。图27显示本发明的寡核苷酸对tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3表达的抑制作用。在不存在转染试剂的条件下使用3.3μμ不同的tgf-β特异性寡核苷酸转染panc-1细胞(图27a)或renca细胞(图27b)。在转染后72小时测定tgf-β1(黑色柱)、tgf-β2(白色柱)和tgf-β3(条纹柱)mrna的表达。图28显示本发明的寡核苷酸对tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3表达的抑制作用。在存在转染试剂的条件下使用10nμ不同的tgf-β特异性寡核苷酸转染a172神经胶质瘤细胞。在转染后24小时测定tgf-β1(黑色柱)、tgf-β2(白色柱)和tgf-β3(条纹柱)mrna的表达。图29a和29b显示向balb/c小鼠单次皮下推注给予50mg/kg的asph_0047后tgf-β2mrna的时间依赖性血浆(29a)和肾(29b)浓度(pk曲线；值以μg/ml或μg/gr表示)和肾中tgf-β2mrna(pd曲线)下调的比较分析。图30显示皮下重复给予asph_0047或对照寡核苷酸后免疫缺陷小鼠中已建立的皮下肿瘤(图30a-d)或肾(图30e-f)中tgf-β2mrna的下调。通过bdna检测tgf-β2和gapdhmrna表达。结果表示为tgf-β2/gapdhmrna比例，且各单独测试的样品表示为显示中值的线。图31显示在原位和静脉内小鼠renca肾癌模型中的肺转移癌上使用asph_0047(选择性tgf-β2反义寡核苷酸)系统性治疗balb/c小鼠的作用。通过转移癌的数目或基于肺重量来测定肺转移癌的水平。结果显示于箱线图中，其中显示了中值、上四分位数、下四分位数以及90和10百分位数。图32显示在不存在转染试剂的情况下(自主转染或自主递送)，使用3.3μμ的所示寡核苷酸治疗人panc-1胰腺癌细胞。在转染后72小时测定tgf-β1(黑色柱)、tgf-β2(白色柱)和tgf-β3(条纹柱)mrna的表达。图33显示在原位小鼠4t1乳腺癌模型中的肺转移癌上使用asph_0047系统性治疗balb/c小鼠的效果。各单个动物的数据显示为以粗黑线表示的中值。发明详述本发明涉及寡核苷酸，特别是反义寡核苷酸，其包含至少一个修饰的核苷酸并适用于与tgf-βmrna相互作用。这些寡核苷酸包含或由以下序列组成：seqidno.1的tgf-β2核酸或seqidno.335的tgf-β1核酸或seqidno.336的tgf-β3核酸的10-20个(更优选12-18个)核苷酸。最优选地，该寡核苷酸包含或由12、13、14、15、16、17或18个核苷酸组成。这些寡核苷酸优选选自seqidno.1的第1380-1510号(优选第1380-1450号和/或第1480-1510号)、第1660-1680号或第2390-2410号核酸区域。该寡核苷酸是单链或双链rna或dna，包括sirna、微小rna、适体或镜像体(spiegelmer)。优选地，该寡核苷酸是反义寡核苷酸。核苷酸形成寡核苷酸的结构模块，且例如由以下物质组成：核碱基(含氮碱基，如嘌呤或嘧啶)、五碳糖(如核糖、2-脱氧核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖或这些糖的稳定化的修饰体)和一个或多个磷酸基团。修饰的磷酸基团的示例是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。各种核苷酸的化合物都是可修饰的，且是天然产生的或非天然产生的。后者是，例如，锁核酸(lna)、2'-o,4'-c-乙烯桥接核酸(ena)、聚环氧烷(如三甘醇(teg))、2'-氟、2'-o-甲氧基和2'-o-甲基修饰的核苷酸，参见例如freier和altmann(nucl.acidres.,1997,25,4429-4443)和uhlmann(curr.opinionindrug&development(2000,3(2):293-213))，其示于图1。lna是一种修饰的rna核苷酸，其中，核糖部分被连接2'氧和4'碳的额外桥修饰(2'-4'核糖核苷)。该桥将核糖“锁定”为3’-内(北)构象，其通常发现于a型双链体中。lna核苷和核苷酸分别包含例如硫代-lna、氧基-lna或氨基-lna的形式(以α-d-或β-l-构型)，且与寡核苷酸中dna或rna残基分别是可混合和可合并的。本发明的寡核苷酸(即修饰的寡核苷酸)在寡核苷酸的5'和/或3'端包含至少一个修饰的核苷酸(优选lna和/或ena)。在优选的实施方式中，该寡核苷酸包含位于5'端的1、2、3或4个lna或ena和位于3'端的1、2、3或4个lna或ena。在另一个优选的实施方式中，该寡核苷酸包含位于5'端或3'端的1、2、3或4个lna或ena，以及位于3'或5'端的聚环氧烷(如teg)。这些修饰的寡核苷酸分别对于tgf-β表达和修饰显示显著增加的抑制，其导致以下疾病预防和/或治疗的改善：恶性或良性肿瘤、免疫疾病、纤维化(如特发性肺纤维化、肾脏纤维化、肾纤维化)、硬化(肝硬化)、硬皮病或相关皮肤疾病、眼疾病(如青光眼或后囊膜混浊(pco))、cns疾病、脱发等。本发明的寡核苷酸通过以下方式靶向tgf-β连接的疾病：与tgf-βmrna(优选tgf-β1、tgf-β2或tgf-β3)或者tgf-β1、tgf-β2和/或tgf-β3mrna(即tgf-β1和tgf-β2，或tgf-β1和tgf-β3，或tgf-β2和tgf-β3，或tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3mrna)杂交或任何其他直接或间接对tgf-β系统的作用。优选合并两种或更多种寡核苷酸，其中，至少一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β1且至少一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β2，或至少一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β1且至少一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β3，或至少一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β2且至少一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β3，或至少一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β1且至少一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β2且至少一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β3。在另一个实施方式中，一种寡核苷酸抑制两种tgf-β同种型，例如tgf-β1和tgf-β2、tgf-β2和tgf-β3或tgf-β1和tgf-β3。抑制全部三种同种型(tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3)表达的寡核苷酸被定义为泛特异性寡核苷酸。在另一个实施方式中，合并三种或更多种寡核苷酸，其中，至少一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β1，另一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β2，且另一种寡核苷酸特异性抑制tgf-β3，且任选地一种或多种其他寡核苷酸抑制tgf-β1、tgf-β2或tgf-β3。本发明的寡核苷酸的ic50范围是，例如，0.1至20μμ，优选0.2至15μμ，更优选0.4至10μμ，且甚至更优选0.5至5μμ。本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的寡核苷酸作为活性成分。该药物组合物包含至少一种本发明的寡核苷酸且任选还包含反义化合物、抗体、化疗化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物和/或免疫调节化合物。药学上可接受的结合剂和佐剂或运载体任选包含部分药物组合物。在一个实施方式中，寡核苷酸和药物组合物分别配制为胶囊剂、片剂和丸剂等形式的剂量单位，其分别含有例如以下化合物：微晶纤维素、胶或明胶作为粘合剂；淀粉或乳糖作为赋形剂；硬脂酸酯作为润滑剂，多种甜味剂或调味剂。对于胶囊剂，该剂量单位可含有液体运载体如脂肪油。同样地，糖或肠溶剂的包衣可以是剂量单位的一部分。该寡核苷酸和/或药物组合物可通过不同途径给予。这些给药途径包括但不限于：电穿孔、表皮、压印至皮肤(impressionintoskin)、动脉内、关节内、颅内、皮内、伤口内、肌内、鼻内、眼内、鞘内、房内、腹膜内、前列腺内、肺内、椎管内、气管内、瘤内、静脉内、粘膜内、放置于身体腔内、鼻吸入、口服、肺吸入(通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器)、皮下、真皮下、局部(包括眼科和至粘膜，包括阴道和直肠递送)或透皮。对于胃肠道外、皮下、皮内或局部给药，该寡核苷酸和/或药物组合物包含例如无菌稀释剂、缓冲剂、毒性调节剂和抗菌剂。在优选的实施方式中，该寡核苷酸或药物组合物使用保护免于降解或立即清除出身体的运载体制备，包括具有受控释放性质的植入物或微胶囊。对于静脉内给药，优选的运载体是例如生理盐水或磷酸盐缓冲盐水。用于口服给药的寡核苷酸和/或包含这类寡核苷酸的药物组合物包括例如粉末剂或颗粒剂、微粒、纳米微粒、水或非水介质中的混悬剂或溶液剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、囊袋、片剂或小型片剂。用于胃肠道外、鞘内、房内或囊泡内给药的寡核苷酸和/或药物组合物包含例如无菌水溶液，其任选含有缓冲剂、稀释剂和/或其他合适的添加剂(如透过增强剂、运载体化合物和/或其他药学上可接受的运载体或赋形剂)。药学上可接受的运载体是例如液体或固体，且根据计划的给药方式选择，从而在与核酸和给定药物组合物的其他组分合并时提供所需体积、持久性等。典型的药学上可接受的运载体包括但不限于：粘合剂(如预胶化玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(如淀粉、羟乙酸淀粉钠等)或润湿剂(如月桂醇硫酸钠等)。用于口服给药剂型的缓释口服递送系统和/或肠溶包衣描述于美国专利号4,704,295；4,556,552；4,309,406；和4,309,404。在这些短语下包括佐剂。除了用于人疾病预防和/或治疗的方法外，本发明的寡核苷酸和/或药物组合物还可用于其他对象的预防和/或治疗方法，包括兽医动物、爬行类动物、鸟类动物、珍稀动物和农场动物，包括哺乳动物、啮齿类动物等。哺乳动物包括例如马、狗、猪、猫或灵长类动物(例如猴、黑猩猩或狐猴)。啮齿类动物包括例如大鼠、兔、小鼠、松鼠或豚鼠。本发明的寡核苷酸或药物组合物被用于预防和/或治疗许多不同疾病的方法，这些疾病优选是良性或恶性肿瘤、免疫疾病、支气管哮喘、心脏病、纤维化(例如肝纤维化、特发性肺纤维化、肝硬化、肾硬化、硬皮病)、糖尿病、伤口愈合、结缔组织疾病(例如在心脏、血管、骨、关节、眼中，如马凡或洛伊斯-迪茨综合征)、牛皮癣、眼疾病(例如青光眼、后囊膜混浊(pco)(也称为继发性白内障))、cns疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病)、冠状动脉粥样硬化(冠状动脉介入或冠状动脉旁路移植(cabg)手术)或脱发。肿瘤是例如选自：实体瘤、血源性肿瘤、白血病、转移瘤、血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、化脓性肉芽肿、星形细胞瘤如间变型星形细胞瘤、听神经瘤、胚细胞瘤、尤因瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、成血管细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、成神经管细胞瘤、白血病、黑素瘤如原发性和/或转移性黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、神经纤维瘤、非霍奇金淋巴瘤、松果体瘤、成视网膜细胞瘤、肉瘤、精原细胞瘤、沙眼、维尔姆斯瘤、胆管癌、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、支气管癌、肾癌、宫颈癌、脉络膜癌、绒毛膜癌、囊腺癌、胚胎性癌、上皮癌、食道癌、宫颈癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胆囊癌、胃癌、头癌、肝癌、肺癌、髓样癌、颈癌、非小细胞支气管/肺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、前列腺癌、小肠癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(rcc，例如透明细胞rcc、乳头状rcc、难染性rcc)、大嗜酸粒细胞肾癌、移行细胞肾癌、成视网膜细胞瘤、皮肤癌、小细胞支气管/肺癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、睾丸癌和子宫癌。本发明的寡核苷酸或药物组合物不仅用于预防和/或治疗肿瘤的方法中，还同样适用于转移癌。本发明的反义寡核苷酸的特征为其显示出乎意料的低毒性(参见例如表5)并因此被不同的生物体良好耐受。这些寡核苷酸显示生物体内合理的分布，其中在肾、肝、皮肤和脾中测得最高浓度。本发明提供了多种寡核苷酸，由于寡核苷酸序列的特异性选择和核苷酸的修饰，其高度有效地分别减少和抑制tgf-β(特别是tgf-β1、tgf-β2和/或tgf-β3)表达。下文表1显示多种优选的本发明所述修饰的寡核苷酸(修饰的核苷以粗体显示)。各寡核苷酸定义为asph和一个数字，其由特定的核苷序列和修饰定义：表1显示选定的本发明的寡核苷酸的核酸序列以及核苷酸的修饰，其中，lna4+4表示寡核苷酸5’和3’端的4xlna是经修饰的，lna4+3表示寡核苷酸5’端的4xlna和3’端的3xlna是经修饰的，lna3+4表示寡核苷酸5’端的3xlna和3’端的4xlna是经修饰的，lna3+3表示寡核苷酸5’和3’端的3xlna是经修饰的，lna3+2表示寡核苷酸5’端的3xlna和3’端的2xlna是经修饰的，lna2+3表示寡核苷酸5’端的2xlna和3’端的3xlna是经修饰的，lna2+2表示寡核苷酸5’和3’端的2xlna是经修饰的。或者，一些寡核苷酸包含ena4+4(即寡核苷酸5’和3’端的4xena是经修饰的)或ena3+3(即寡核苷酸5’和3’端的3xena是经修饰的)。其他寡核苷酸包含2'o-甲基4+4(其中，该寡核苷酸包含寡核苷酸5’和3’端的4x2'o-甲基修饰的核苷酸)或包含2'氟4+4(其中，该寡核苷酸包含寡核苷酸5’和3’端的4x2'氟修饰的核苷酸)。包含lna3+teg的寡核苷酸在该寡核苷酸的5'端包含3xlna且在3’端包含一个三甘醇(teg)。一些寡核苷酸包含lna，其不是排列为一行而是由未锁定的核苷隔开，其具有例如以下序列：3lna+9n+1lna+1n+2lna、1lna+1n+2lna+8n+1lna+1n+1lna、2lna+8n+2lna+1n+1lna、2lna+9n+1lna+1n+1lna、2lna+8n+1lna+2n+1lna、3lna+8n+1lna+1n+1lna、3lna+8n+1lna+1n+1lna、2lna+9n+1lna+1n+1lna或2lna+8n+2lna+1n+1lna，其中“n”是不含锁定修饰的核苷。“asph”和一个数字指表1描述的不同寡核苷酸及其不同修饰。这些修饰的寡核苷酸在例如下文实施例中所示实验中测试。本发明的反义寡核苷酸可以不同方式描述，例如asph47、asph0047、asph_47或asph_0047指同一寡核苷酸。出于清楚和简洁的目的，各特征在本发明中被描述为相同或单独的实施方式的一部分，然而，应理解本发明的范围可包括具有所有或一些所述特征的组合的实施方式。以下实施例将用于进一步说明本发明，然而同时，并不对本发明构成任何限制。相反地，应清楚地立即，本发明的范围涉及多种其他实施方式、其修改形式和等价形式，其在本领域技术人员阅读本发明后能够对其做出启示而不背离本发明的精神。实施例在以下实施例中，对表1中列举的寡核苷酸的效果进行了测试，其分别基于tgf-β1和/或tgf-β2表达的降低和抑制。seqidno.144(t-lna:cggcatgtctattttgta，其中5'和3’端的3x核苷酸是lna)和seqidno.145(scr-lna:cgtttaggctatgtactt，其中5'和3’端的3x核苷酸是lna)被用作对照寡核苷酸，其中seqidno.145(阴性对照)是seqidno.144(阳性对照)的错义形式。在转染剂(如脂质转染试剂(lipofectamine))存在的情况下或不存在任何转染剂的情况下(其定义为自主转染或无协助转染或自主递送)对细胞进行转染。在自主递送的情况中，寡核苷酸进入细胞仅依赖于寡核苷酸与细胞的相互作用(没有化合物/试剂支持该进入)。因此，自主转染或自主递送被认为反映了体内环境中较好的条件。实施例1在转染剂存在的情况下，分别使用10nm的asph01、asph02、asph03、asph04、asph05、asph06、asph07、asph08、asph09、asph10、asph11、asph12、asph13、asph14、asph15、asph16、asph17、asph18、asph19、asph20、asph21、asph22、asph24、asph25、asph26、asph27、asph29、asph30、asph31、asph32、asph33、asph34、asph35、asph36、asph37、asph38、asph39、asph40、asph41、asph42、asph43、asph44、asph45、asph46、asph47、asph48、asph49、asph50、asph51、asph52、asph53和asph54(参见图3a)；asph36、asph60、asph61、asph62、asph63、asph64、asph65、asph66、asph67、asph68、asph69、asph70、asph71、asph72、asph73、asph74、asph75、asph76、asph77、asph78、asph79、asph80、asph81、asph82、asph83、asph84、asph85、asph86、asph87、asph88、asph89、asph90、asph91、asph92、asph93、asph94、asph95、asph96、asph97、asph98、asph99、asph100、asph101、asph102、asph103、asph104、asph105、asph106、asph107、asph108、asph109、asph110、asph111、asph112、asph113、asph114、asph115、asph116、asph117、asph118和asph119(参见图3b)，或asph36、asph71、asph73、asph120、asph121、asph122、asph123、asph124、asph125、asph126、asph127、asph128、asph129、asph130、asph131、asph132、asph133、asph134、asph135、asph136、asph137、asph138、asph139、asph140、asph141、asph142、asph143、asph145、asph146、asph147、asph148、asph149、asph150、asph151、asph152、asph153、asph154、asph155、asph157、asph158、asph160、asph161、asph162、asph163、asph164、asph165、asph166、asph167、asph168、asph169、asph170、asph171、asph172、asph173、asph174、asph175、asph176、asph177、asph178、asph179、asph180、asph181、asph182和asph183(参见图3c)以及对照seqidno.144和145转染人a172胶质瘤细胞。在转染后24小时测定tgf-β1和tgf-β2mrna的表达。图3a)至3c)显示了tgf-β1和tgf-β2mrna表达的显著减低。双重tgf-β1和tgf-β2反应性寡核苷酸asph01、asph02、asph03、asph04、asph05、asph06、asph07、asph08和asph09显示tgf-β1和tgf-β2mrna表达的显著减低，而选择性tgf-β2寡核苷酸显著抑制tgf-β2mrna的表达。实施例2在转染剂存在的情况下，分别使用10nm的asph01、asph02、asph03、asph04、asph05、asph06、asph07、asph08、asph12、asph14、asph17、asph18、asph20、asph21、asph22、asph24、asph25、asph26、asph27、asph29、asph30、asph31、asph32、asph33、asph35、asph36、asph37、asph38、asph39、asph40、asph41、asph42、asph43、asph44、asph45、asph46、asph47、asph48、asph49、asph50、asph51和asph52(参见图4a)；asph36、asph60、asph61、asph62、asph63、asph64、asph65、asph66、asph67、asph68、asph69、asph70、asph71、asph72、asph73、asph74、asph75、asph76、asph77、asph78、asph79、asph80、asph81、asph82、asph83、asph84、asph85、asph86、asph87、asph88、asph89、asph90、asph91、asph92、asph93、asph94、asph96、asph97、asph98、asph99、asph100、asph101、asph102、asph103、asph104、asph105、asph106、asph107、asph108、asph109、asph110、asph111、asph112、asph113、asph114、asph115、asph116、asph117、asph118和asph119(参见图4b)，或asph36、asph71、asph73、asph120、asph121、asph122、asph127、asph128、asph129、asph130、asph131、asph132、asph133、asph135、asph136、asph137、asph139、asph141、asph142、asph143、asph145、asph146、asph147、asph149、asph150、asph151、asph152、asph153、asph154、asph155、asph157、asph160、asph161、asph162、asph163、asph164、asph165、asph166、asph167、asph168、asph169、asph170、asph171、asph172、asph173、asph174、asph175、asph176、asph177、asph178、asph179、asph180、asph181、asph182和asph183(参见图4c)以及对照seqidno.144和145转染人panc-1胰腺癌细胞。在转染后24小时测定tgf-β1和tgf-β2mrna的表达。图4a)至4c)显示了tgf-β1和tgf-β2mrna表达的显著减低。双重tgf-β1和tgf-β2反应性寡核苷酸asph01、asph02、asph03、asph04、asph05、asph06、asph07和asph08再次显示tgf-β1和tgf-β2mrna表达的显著减低，而选择性tgf-β2寡核苷酸显著抑制tgf-β2mrna的表达。实施例3在进一步的实验中，在人a172神经胶质瘤细胞中测试asph01、asph03、asph05、asph17、asph18、asph22、asph26、asph27、asph33、asph36、asph37、asph41、asph42、asph45、asph46、asph47、asph48、asph49、asph64、asph65、asph66、asph69、asph71、asph80、asph82、asph88、asph89、asph90、asph98、asph99、asph102、asph105、asph115、asph121、asph140、asph153、asph165、asph171、asph178、asph181、asph184、asph185、asph186、asph187、asph188、asph189和对照seqidno.144和seqidno.145各自的抑制作用。在转染剂存在的情况下，分别以20nm、4nm、0.8nm、0.16nm、和0.04nm的剂量使用这些修饰的寡核苷酸转染a172细胞。在转染后24小时测量剩余的tgf-β2mrna。将tgf-β2值标准化至gapdh并计算导致tgf-β2mrna减少50％的寡核苷酸浓度(＝ic50值)。所有ic50值都参考asph_036(asph36)的ic50值(该值是0.33nm)且结果显示为asph_036的ic50值的倍数差异。表2：所有修饰的寡核苷酸都显示低纳摩尔至皮摩尔范围的ic50，其显著低于阳性对照寡核苷酸seqidno.144的ic50；未计算阴性对照seqidno.145的ic50。实施例4在不存在转染剂的情况下(自主转染或自主递送)，分别使用3.3μμ的asph17、asph18、asph22、asph25、asph33、asph35、asph36、asph41、asph42、asph45、asph46、asph47、asph48、asph49、asph65、asph66、asph67、asph69、asph71、asph79、asph80、asph82、asph88、asph89、asph90、asph91、asph98、asph99、asph102、asph105、asph111、asph115、asph119、asph121、asph139、asph140、asph146、asph151、asph153、asph165、asph171、asph172、asph176、asph178、asph180和asph183或对照seqidno.144和145处理人panc-1胰腺癌细胞。在处理开始后72小时分别测量修饰的寡核苷酸对tgf-β1和tgf-β2mrna表达的抑制作用。在自主递送实验条件下，这些寡核苷酸进入细胞并强烈抑制tgf-β2mrna的表达。实验结果如图5所示。实施例5在进一步的实验中，在不存在转染剂的情况下(自主转染或自主递送)，分别使用10μm的修饰的寡核苷酸asph01、asph03、asph05、asph09、asph17、asph18、asph22、asph35、asph36、asph37、asph41、asph45、asph46、asph47和asph48或对照seqidno.144和145转染人panc-1胰腺癌细胞。随后向细胞中添加寡核苷酸持续2天，之后改变介质，并在含寡核苷酸的介质中再孵育2天。随后测量tgf-β1mrna(图6a)和tgf-β2mrna(图6b)的表达并标准化至hprt1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1)通过elisa分析细胞上清液中的tgf-β1(图7a)和tgf-β2(图7b)蛋白质。在自主递送实验条件下，双重tgf-β1和tgf-β2反应性寡核苷酸asph01、asph03、asph05和泛特异性asph09显著抑制tgf-β1和tgf-β2mrna和蛋白质的表达。所有其他的寡核苷酸都在mrna和蛋白质水平上显著抑制tgf-β2的表达。实施例6在另一个实验中，测试了本发明的修饰的寡核苷酸的抑制作用的剂量依赖性。在不使用转染试剂的情况下，分别使用15μμ、10μμ、7.5μμ、5μμ、2.5μμ、1.25μμ或0.625μμ的asph05或asph36或对照seqidno.144和145处理人panc-1胰腺癌细胞。向细胞中加入寡核苷酸持续2天。之后改变介质并将细胞在含有寡核苷酸的介质中再孵育2天，之后(总处理时间：4天)测量tgf-β1(图8a)和tgf-β2(图8b)mrna的表达。双重tgf-β1和tgf-β2反应性寡核苷酸asph05显示对tgf-β1和tgf-β2mrna表达的显著的剂量依赖性抑制，且asph36以剂量依赖的方式特异性抑制tgf-β2mrna的表达。实施例7分别使用10nm的asph01、asph03、asph05、asph09、asph17、asph18、asph22、asph26、asph36、asph37、asph41、asph42、asph45、asph46、asph47或asph48或对照seqidno.144和145转染小鼠sma-560胶质瘤细胞(在转染试剂存在的情况下)。转染后24小时，测定对tgf-β1(白色柱)和tgf-β2(黑色柱)mrna表达的抑制。泛特异性asph09抑制小鼠tgf-β1mrna的表达，而测试的其他寡核苷酸强烈抑制小鼠tgf-β2mrna的表达。结果如图9所示。实施例8通过皮下分别注射14mg/kg或50mg/kg的寡核苷酸asph01、asph03、asph05、asph17、asph22、asph37、asph41、asph45、asph46、asph47或asph48和对照seqidno.145或盐水对雌性无胸腺裸鼠(hsd：无胸腺裸-foxnlnu)连续治疗5天。最后一次治疗后一天处死小鼠。定量肾组织裂解物中的小鼠tgf-β2mrna。在图10中，tgf-β2与gapdhmrna比例的数据显示于箱线图中，其中显示了中值、最小值和最大值(数据表示为n＝4，例外是asph46组n＝3)。所有测试的寡核苷酸都在这些小鼠的肾中抑制tgf-β2mrna的表达。实施例9在另一个实验中，在不存在任何转染剂的情况下(自主转染或自主递送)，使用10μμ的修饰的寡核苷酸asph09或对照seqidno.145转染人panc-1胰腺癌细胞。随后向细胞中添加寡核苷酸持续2天，之后改变介质，并在含寡核苷酸的介质中再孵育2天。随后测量tgf-β3mrna的表达(参见图11)并标准化至hprt1(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1)。在自主递送实验条件下，泛特异性寡核苷酸asph09显著抑制tgf-β3mrna的表达。实施例10在不存在转染剂的情况下(自主转染或自主递送)，分别使用10μμ、3.3μμ、1.1μμ、0.37μμ和0.12μμ的asph03、asph36、asph45、asph47、asph65、asph69、asph71、asph80、asph115、asph121、asph153、asph185和asph189处理人panc-1胰腺癌细胞。在处理开始后72小时测量修饰的寡核苷酸对tgf-β2mrna表达的抑制作用。将tgf-β2值标准化至gapdh并计算导致tgf-β2mrna减少50％的寡核苷酸浓度(＝ic50值)。在自主递送实验条件下，这些寡核苷酸进入细胞并强烈抑制tgf-β2mrna的表达。实验结果如表3所示：名称ic50(μμ)asph_0650.37asph_0710.371asph_1150.6asph_0690.655asph_0470.78asph_0800.81asph_1530.9asph_0451.21asph_1211.27asph_0361.5asph_1853.05asph_0033.62asph_1894.26所有修饰的寡核苷酸都显示低纳摩尔或甚至皮摩尔范围的ic50，表明即使在不需要转染试剂的情况下其仍具有非常高的效力。实施例11在不存在转染剂的情况下(自主转染或自主递送)，分别使用10μμ、3.3μμ、1.1μμ、0.37μμ和0.12μμ的asph47、asph190、asph191、asph192和asph193处理人panc-1胰腺癌细胞。在处理开始后72小时测量修饰的寡核苷酸对tgf-β2mrna表达的抑制作用。将tgf-β2值标准化至gapdh并计算导致tgf-β2mrna减少50％的寡核苷酸浓度(＝ic50值)。在自主递送实验条件下，这些寡核苷酸进入细胞并强烈抑制tgf-β2mrna的表达。实验结果如表4所示：所有修饰的寡核苷酸都显示亚微摩尔至较低亚微摩尔范围的ic50，表明即使在不需要转染试剂的情况下其仍具有极高的效力。实施例12在转染剂存在的情况下，分别使用10nm的asph05、asph09、asph1000、asph1001、asph1002、asph1003、asph1004、asph1005、asph1006、asph1007、asph1008、asph1009、asph1010、asph1011、asph1012、asph1013、asph1014、asph1015、asph1016、asph1017、asph1018、asph1019、asph1020、asph1021、asph1022、asph1023、asph1024、asph1026、asph1027、asph1028、asph1029、asph1030、asph1031、asph1032、asph1033、asph1034、asph1035、asph1036、asph1038、asph1039、asph1040、asph1041、asph1042、asph1043、asph1044、asph1045、asph1046、asph1047、asph1048、asph1049、asph1050、asph1051、asph1052、asph1054、asph1055、asph1056、asph1057、asph1058、asph1059、asph1060或asph1061和对照seqidno.145转染人panc-1胰腺癌细胞。在转染后24小时测定tgf-β1mrna的表达。panc-1细胞中tgf-β1表达的显著降低示于图13。实施例13在转染剂存在的情况下，分别使用10nm的asph09、asph1000、asph1001、asph1002、asph1003、asph1004、asph1005、asph1006、asph1007、asph1008、asph1009、asph1010、asph1011、asph1012、asph1013、asph1014、asph1015、asph1016、asph1017、asph1018、asph1019、asph1020、asph1021、asph1022、asph1023、asph1024、asph1026、asph1027、asph1028、asph1029、asph1030、asph1031、asph1032、asph1033、asph1034、asph1035、asph1036、asph1037、asph1038、asph1039、asph1040、asph1041、asph1042、asph1043、asph1044、asph1045、asph1046、asph1047、asph1048、asph1049、asph1050、asph1051、asph1052、asph1053、asph1054、asph1055、asph1056、asph1057、asph1058、asph1059、asph1060、asph1061或asph1062和对照seqidno.145转染小鼠sma-560胶质瘤细胞。在转染后24小时测定tgf-β1mrna的表达。sma-560细胞中tgf-β1表达的显著降低示于图14。实施例14在这些实验中，在转染剂存在的情况下，分别使用10nm的asph05、asph09、asph1000、asph1001、asph1002、asph1004、asph1005、asph1006、asph1007、asph1008、asph1009、asph1010、asph1011、asph1012、asph1013、asph1014、asph1015、asph1016、asph1017、asph1018、asph1019、asph1020、asph1021、asph1022、asph1023、asph1024、asph1026、asph1027、asph1028、asph1029、asph1030、asph1031、asph1032、asph1033、asph1034、asph1035、asph1036、asph1038、asph1039、asph1040、asph1041、asph1042、asph1043、asph1044、asph1045、asph1046、asph1047、asph1048、asph1049、asph1050、asph1051、asph1052、asph1053、asph1054、asph1056、asph1057、asph1058、asph1059、asph1060、asph1061或asph1062和对照seqidno.145转染人a172胶质瘤细胞。在转染后24小时测定tgf-β1和tgf-β2mrna的表达。tgf-β1mrna表达的显著降低示于图15。双重tgf-β1和tgf-β2反应性寡核苷酸asph05显示tgf-β1和tgf-β2mrna表达的显著减低，而选择性tgf-β1寡核苷酸显著抑制tgf-β1mrna的表达。实施例15在不存在转染剂的情况下(自主转染或自主递送)，使用3.3μμ的asph05、asph09、asph1000、asph1001、asph1002、asph1004、asph1006、asph1007、asph1008、asph1009、asph1010、asph1011、asph1012、asph1013、asph1014、asph1015、asph1017、asph1018、asph1019、asph1020、asph1021、asph1022、asph1024、asph1026、asph1027、asph1028、asph1029、asph1032、asph1033、asph1034、asph1035、asph1036、asph1037、asph1038、asph1039、asph1040、asph1041、asph1042、asph1043、asph1044、asph1045、asph1046、asph1047、asph1049、asph1050、asph1051、asph1052、asph1053、asph1054、asph1055、asph1056、asph1057、asph1058、asph1059、asph1060、asph1061或asph1062或对照seqidno.145处理人panc-1胰腺癌细胞。在处理开始后72小时分别测量修饰的寡核苷酸对tgf-β1和tgf-β2mrna表达的抑制作用。tgf-β1mrna表达的显著降低示于图16。双重tgf-β1和tgf-β2反应性寡核苷酸asph05显示tgf-β1和tgf-β2mrna表达的显著减低，而选择性tgf-β1寡核苷酸显著抑制tgf-β1mrna的表达。实施例16在转染剂存在的情况下，分别使用10nm的asph09、asph1047、asph1051、asph1059、asph1063、asph1064、asph1065、asph1066、asph1067、asph1068、asph1069、asph1070、asph1071、asph1072、asph1073、asph1074、asph1075、asph1076、asph1077、asph1078、asph1079、asph1080、asph1081、asph1082、asph1083、asph1084、asph1085、asph1086、asph1087、asph1088、asph1089、asph1090、asph1091、asph1092、asph1093、asph1094、asph1095、asph1097、asph1098、asph1099、asph1100、asph1101、asph1102、asph1103、asph1104、asph1105、asph1106、asph1107、asph1108、asph1109、asph1110、asph1111、asph1112、asph1113、asph114、asph1115、asph1116、asph1117、asph1118、asph1119、asph1120、asph1121、asph1122、asph1123、asph1124、asph1125、asph1126、asph1127、asph1128、asph1129、asph1130、asph1131和asph1132或阳性对照asph1047处理人a172神经胶质瘤细胞。在转染后24小时测定tgf-β1(黑色柱)、tgf-β2(白色柱)和tgf-β3(条纹柱)mrna的表达。tgf-β1mrna表达的显著降低示于图17。泛特异性tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3反应性寡核苷酸asph0009、asph1096、asph1131和asph1132显示全部三种同种型表达的显著降低，而选择性tgf-β1寡核苷酸显著抑制tgf-β1mrna的表达。实施例17在不存在转染剂的情况下(自主转染或自主递送)，分别使用3.3μm的asph09、asph1047、asph1051、asph1059、asph1063、asph1064、asph1065、asph1066、asph1067、asph1068、asph1069、asph1070、asph1071、asph1072、asph1073、asph1074、asph1075、asph1076、asph1077、asph1078、asph1079、asph1080、asph1081、asph1082、asph1083、asph1084、asph1085、asph1086、asph1087、asph1088、asph1089、asph1090、asph1091、asph1092、asph1093、asph1094、asph1095、asph1097、asph1098、asph1099、asph1100、asph1101、asph1102、asph1103、asph1104、asph1105、asph1106、asph1107、asph1108、asph1109、asph1110、asph1111、asph1112、asph1113、asph114、asph1115、asph1116、asph1117、asph1118、asph1119、asph1120、asph1121、asph1122、asph1123、asph1124、asph1125、asph1126、asph1127、asph1128、asph1129、asph1130、asph1131和asph1132或阳性对照asph1047处理人panc-1胰腺癌细胞(图18a)或小鼠renca肾细胞癌细胞(图18a)。在转染后72小时测定tgf-β1(黑色柱)、tgf-β2(白色柱)和tgf-β3(条纹柱)mrna的表达。tgf-β1mrna表达的显著降低示于图17。泛特异性tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3反应性寡核苷酸asph0009、asph1096、asph1131和asph1132显示全部三种同种型表达的显著降低，而选择性tgf-β1寡核苷酸显著抑制tgf-β1mrna的表达。实施例18在以下多种治疗方案下，使用1、3、10和30mg/kg的asph47治疗携带人panc-1胰腺癌皮下肿瘤的小鼠：q1dx1-d6(单次sc注射，5天后终止)，q1dx5-d6(每天sc注射持续5天，24小时后终止)以及q1dx5-d10(每天sc注射持续5天，5天后终止)。在这些动物的肾中存在tgf-β2mrna的剂量依赖性下调。在使用asph47进行最后一次治疗后，tgf-β2下调持续最多5天，即使在单次给药后也是如此。通过bdna试验(分支dna试验，其是一种夹心核酸杂交方法，使用bdna分子扩增来自捕获的靶rna的信号)检测tgf-β2的表达并标准化至gapdh。如图22所示，tgf-β2与gapdhmrna比例的数据显示于箱线图中，其中显示了中值、最小值和最大值(数据表示为n＝10，例外是载剂和3mg/kgq1dx1d6组n＝9)。实施例19通过每日皮下注射1、5、15或50mg/kg寡核苷酸连续持续5天治疗在左肋和右肋上携带人panc-1胰腺癌皮下肿瘤的小鼠。最后一次治疗后24小时收集肿瘤并速冻。通过bdna试验检测肿瘤中的tgf-βmrna表达。tgf-β2与gapdhmrna比例的数据显示于箱线图中，其中显示了中值、最小值和最大值(数据表示为n＝5)。tgf-β2mrna在使用多种寡核苷酸治疗的肿瘤中下调(图23)。在那些组中不存在显著的tgf-β1mrna下调(数据未显示)。实施例20通过每日注射50mg/kg寡核苷酸连续持续5天治疗在左肋和右肋上携带人786-o肾细胞癌皮下肿瘤的小鼠。最后一次治疗后24小时收集肿瘤并速冻。通过bdna试验检测肿瘤中的tgf-βmrna表达。在使用asph05、asph17、asph26、asph36、asph45、asph47、asph71、asph82、asph98和asph105治疗的肿瘤中出现tgf-β2mrna的显著下调(图24)。tgf-β2与gapdhmrna比例的数据显示于箱线图中，其中显示了中值、最小值和最大值(数据表示为n＝10，例外是asph71组n＝9)。实施例21使用20、6.67、2.22、0.74、0.25、0.08或0.009μm的修饰的寡核苷酸asph47、asph1047、asph1106、asph1132或asph47以及asph1047转染人panc-l胰腺癌细胞；结果示于图26a至26e。阴性对照是seqidno.145的错义寡核苷酸(scrlna)(图26f)。所有细胞都在不存在转染剂的情况下转染(自主转染或自主递送)。向细胞中加入修饰的寡核苷酸持续3天，其在37℃下孵育。之后使用新鲜的含寡核苷酸的介质更换介质并将细胞在37℃下再孵育4天。通过elisa测定细胞上清液中的tgf-β1和tgf-β2蛋白质水平。asph47以剂量依赖的方式特异性抑制tgf-β2的表达且对于tgf-β1不具有任何靶向抑制作用(图26a)。asph47特异性抑制tgf-β1的表达且对于tgf-β2不具有任何靶向抑制作用(图26b)，或在更高浓度下对tgf-β2仅具有轻微的抑制作用。同样地，asph1106以剂量依赖的方式抑制tgf-β1的表达(图26c)。泛特异性asph1132显示对tgf-β1和tgf-β2蛋白质表达的剂量依赖性抑制(图26d)。合并asph47和asph1047时，以剂量依赖的方式同时抑制tgf-β1和tgf-β2蛋白质的表达(图26e)。sqeidno.145的scrlna未显示对tgf-β1或tgf-β2表达的任何抑制作用，即使在与asph47、asph1047、asph1106或asph1132的单一浓度相比倍增的浓度下(40、13.33、4.44、1.48、0.49、0.16、0.05或0.02μμ)也是如此。在图26a至26f中，tgf-β1的结果显示为菱形，tgf-β2的结果显示为方形。实施例22在转染剂不存在的情况下(自主转染或自主递送)，使用3.3μμ的asph0009、asph1132、asph2000、asph2001、asph2002、asph2003、asph2004、asph2005、asph2006、asph2007、asph2009、asph2010、asph2012、asph2013、asph2014、asph2015、asph2016、asph2017、asph2018、asph2019、asph2020、asph2021、asph2023、asph2024、asph2025、asph23026、asph2027、asph2028、asph2029、asph2030、asph2031、asph2032、asph2033、asph2034、asph2035、asph2036、asph2037、asph2038、asph2039、asph2040、asph2041、asph2043、asph2044、asph2045、asph2046、asph2047、asph2048、asph2049、asph2050、asph2052、asph2053、asph2054、asph2055、asph2056、asph2057、asph2060、asph2061、asph2062、asph2063、asph2064、asph2065或asph2066处理人panc-1胰腺癌细胞(图27a)或小鼠renca肾细胞癌细胞(图27b)。在转染后72小时测定tgf-β1(黑色柱)、tgf-β2(白色柱)和tgf-β3(条纹柱)mrna的表达。tgf-β3mrna表达的显著降低示于图27a和27b。如从序列中预期的那样，tgf-β1、-β2和-β3反应性寡核苷酸asph_0009(泛选择性)和asph_1132(其与人tgf-β1和-β3的mrna具有100％同源性但与tgf-β2之间存在一个错配)显示所有三种同种型表达的显著减低。选择性tgf-β3寡核苷酸仅显著抑制tgf-β3mrna的表达。实施例23在存在转染剂的情况下，使用10nm的asph0009、asph1132、asph2000、asph2001、asph2002、asph2003、asph2004、asph2006、asph2007、asph2008、asph2009、asph2010、asph2011、asph2012、asph2013、asph2014、asph2016、asph2017、asph2018、asph2020、asph2021、asph2022、asph2023、asph2024、asph2025、asph2026、asph2027、asph2028、asph2029、asph2030、asph2031、asph2032、asph2033、asph2034、asph2035、asph2036、asph2037、asph2038、asph2039、asph2040、asph2041、asph2042、asph2043、asph2044、asph2045、asph2047、asph2049、asph2050、asph2051、asph2052、asph2053、asph2054、asph2056、asph2057、asph2058、asph2059、asph2060、asph2061、asph2062、asph2063或asph2066对人a172胶质瘤细胞处理24小时。随后通过bdna试验从细胞提取物中测定tgf-β1(黑色柱)、tgf-β2(白色柱)和tgf-β3(条纹柱)mrna的表达。tgf-β3mrna表达的显著降低示于图28。如从序列中预期的那样，tgf-β1、-β2和-β3反应性寡核苷酸asph_0009(泛选择性)和asph_1132(其与人tgf-β1和-β3的mrna具有100％同源性但与tgf-β2之间存在一个错配)显示所有三种同种型表达的显著减低。选择性tgf-β3寡核苷酸仅显著抑制tgf-β3mrna的表达。实施例24：兔细胞中的靶mrna下调将选定寡核苷酸的序列与tgf-β1和2的兔mrna序列比对。asph_0036(tgf-β2选择性反义寡核苷酸，基于人mrna序列)显示与兔tgf-β2mrna100％同源，而asph_1059(tgf-β1选择性反义寡核苷酸，基于人mrna序列)显示与兔tgf-β1mrna100％同源。在转染剂存在的情况下，使用5nm或20nm的asph_0036或asph_1059对兔rab-9皮肤成纤维细胞处理24小时。随后通过bdna试验在细胞提取物中测定tgf-β1和tgf-β2mrna的表达。使用asph_1059实现了tgf-β1mrna表达的显著降低(在5和20nm下分别为51和77％)。使用asph_0036实现了tgf-β2mrna的显著降低(在5和20nm下分别为79和80％)。实施例25：balb/c小鼠中系统性给予asph_0047后的组织生物分布和靶mrna下调以5、20和50mg/kg动物体重使用单次皮下注射asph_0047(在无菌生理盐水中配制)治疗balb/c小鼠。在所示时间(从3只单独动物中)收集血浆和组织，立即速冻并储存在-80℃下直至使用aex-hplc方法分析(血浆/组织pk)或通过bdna试验测量tgf-β2和gapdhmrna水平。相对于相应样品中的gapdhmrna表达水平来表示tgf-β2mrna水平。该数据显示，单次皮下推注给予50mg/kgasph_0047导致药物从皮下迅速转移至循环血液腔(t最大为约5-30分钟)，血浆中的双相药代动力学特征，具有快速的初始消除相(在最初的24小时内)，随后是长末端半衰期(图29a)。还显示在多种选定组织中药物的显著长效累积。主要的靶器官(最高暴露/c最大)是肾，随后是肝、皮肤和脾，最小值在脑中(数据未显示)。还如图29b所示，asph_0047在肾组织以药理学相关剂量(约50μg/gr，相当于10μμ)中维持24小时至最多14天，在肾组织中随后具有长效和显著的tgf-β2mrna表达抑制，其中有效地观察到约80％的靶mrna下调持续至少14天。实施例26使用人786-o肾细胞癌细胞(图30a)、胰腺panc1癌细胞(图30b、c)或小鼠sma-560胶质瘤细胞(图30d)对免疫缺陷型小鼠进行皮下注射。在皮下肿瘤尺寸达到100-300mm3(建立的肿瘤)时，使用盐水(模拟)、对照寡核苷酸(对照；50mg/kg)、本文中的无活性寡核苷酸(如asph_0065和asph_0071；50mg/kg)或50mg/kg的asph_0047或所示剂量皮下治疗动物(q1dx5)。在最后一次给药后24小时收集肿瘤(图30a-d)和肾(图30e-f)。随后进一步处理肿瘤/肾以通过bdna试验测定tgf-β2和gapdhmrna水平。在这些实验中，对照寡核苷酸是18聚体3+3lna错义序列。结果表示为tgf-β2/gapdhmrna比例，且各单独测试的样品表示为红线所示的中值。在所述实验条件下(给药方案和途径)，在balb/c小鼠中系统性重复给予asph_0047导致建立的皮下肿瘤和肾中tgf-β2mrna的序列特异性下调。实施例27在第0天将小鼠renca细胞囊下(图31a、b)或静脉内(图31c、d)注射至balb/c小鼠中。使用载剂或所示寡核苷酸进行系统性治疗，起始于第7天(图31a；50mg/kg，皮下，每周两次)，第1天(图31b；12.5mg/kg，皮下，每周两次)持续连续两周，或第7天(图31c和31d；所示剂量，皮下，每周两次)持续26-27天。宏观评估肺转移癌数目并通过转移癌数目(图31a、c)或基于肺重量(图31b、d)测定肺转移癌水平。结果显示于箱线图中，其中显示了中值、上四分位数、下四分位数以及90和10百分位数。在所述实验设计下，在小鼠rencarcc模型中使用asph_0047治疗的balb/c小鼠显示肺转移癌数目减少或肺重量降低(肺重量对应于肺转移癌程度)。实施例28在不存在转染试剂的情况下(自主转染或自主递送)，使用3.3μμ的所示寡核苷酸治疗人panc-1胰腺癌细胞。在转染后72小时测定tgf-β1(黑色柱)、tgf-β2(白色柱)和tgf-β3(条纹柱)mrna的表达。tgf-β1mrna表达的显著降低示于图32。选择性tgf-β1寡核苷酸仅显著抑制tgf-β1mrna表达而对照寡核苷酸lna-scr不影响任何tgf-β同种型的表达。实施例29在第0天将小鼠4t1细胞注射至balb/c小鼠的乳腺脂肪垫中。使用盐水(模拟)、泛tgf-β抗体(1d11)、对照寡核苷酸(lna-scr)或asph_0047进行系统性治疗，起始于第3天(30mg/kg，皮下，每周两次)并持续直至第28天，此时处死动物。宏观评估肺转移癌数目并通过转移癌数目(左图)或基于肺重量(右图)测定肺转移癌水平。在所述实验设计下，在该模型中，使用asph_0047治疗减少了至肺的转移癌，而阳性对照单克隆tgf-β抗体1d11对肺转移癌没有影响。实施例30使用14-15mg/kg所示lna修饰的寡核苷酸对cb17scid或balb/c裸小鼠(n＝3-5，例外是asph_0018n＝1和asph_0037n＝2)连续治疗四或五天(q1dx4-5)。最后一次治疗后24小时收集血浆并测定血浆中的alt水平。结果表示为中值。在该实验条件下，仅6/48(12.5％)的测试的寡核苷酸诱导显示肝毒性的血浆alt的显著增加(大于300单位/升)。下文表7显示系统性给予的lna修饰的寡核苷酸的肝毒性：序列表<110>伊萨纳治疗有限公司（isarnatherapeuticsgmbh）<120>修饰的tgf-β寡核苷酸<130>p101116pc00<140>pct/ep2014/056221<141>2014-03-27<150>ep13161474.5<151>2013-03-27<150>13199826.2<151>2013-12-30<150>ep13173078.0<151>2013-06-20<160>402<170>patentinversion3.5<210>1<211>5882<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>1gtgatgttatctgctggcagcagaaggttcgctccgagcggagctccagaagctcctgac60aagagaaagacagattgagatagagatagaaagagaaagagagaaagagacagcagagcg120agagcgcaagtgaaagaggcaggggagggggatggagaatattagcctgacggtctaggg180agtcatccaggaacaaactgaggggctgcccggctgcagacaggaggagacagagaggat240ctattttagggtggcaagtgcctacctaccctaagcgagcaattccacgttggggagaag300ccagcagaggttgggaaagggtgggagtccaagggagcccctgcgcaaccccctcaggaa360taaaactccccagccagggtgtcgcaagggctgccgttgtgatccgcagggggtgaacgc420aaccgcgacggctgatcgtctgtggctgggttggcgtttggagcaagagaaggaggagca480ggagaaggagggagctggaggctggaagcgtttgcaagcggcggcggcagcaacgtggag540taaccaagcgggtcagcgcgcgcccgccagggtgtaggccacggagcgcagctcccagag600caggatccgcgccgcctcagcagcctctgcggcccctgcggcacccgaccgagtaccgag660cgccctgcgaagcgcaccctcctccccgcggtgcgctgggctcgcccccagcgcgcgcac720acgcacacacacacacacacacacacacgcacgcacacacgtgtgcgcttctctgctccg780gagctgctgctgctcctgctctcagcgccgcagtggaaggcaggaccgaaccgctccttc840tttaaatatataaatttcagcccaggtcagcctcggcggcccccctcaccgcgctcccgg900cgcccctcccgtcagttcgccagctgccagccccgggaccttttcatctcttcccttttg960gccggaggagccgagttcagatccgccactccgcacccgagactgacacactgaactcca1020cttcctcctcttaaatttatttctacttaatagccactcgtctctttttttccccatctc1080attgctccaagaatttttttcttcttactcgccaaagtcagggttccctctgcccgtccc1140gtattaatatttccacttttggaactactggccttttctttttaaaggaattcaagcagg1200atacgtttttctgttgggcattgactagattgtttgcaaaagtttcgcatcaaaaacaac1260aacaacaaaaaaccaaacaactctccttgatctatactttgagaattgttgatttctttt1320ttttattctgacttttaaaaacaacttttttttccacttttttaaaaaatgcactactgt1380gtgctgagcgcttttctgatcctgcatctggtcacggtcgcgctcagcctgtctacctgc1440agcacactcgatatggaccagttcatgcgcaagaggatcgaggcgatccgcgggcagatc1500ctgagcaagctgaagctcaccagtcccccagaagactatcctgagcccgaggaagtcccc1560ccggaggtgatttccatctacaacagcaccagggacttgctccaggagaaggcgagccgg1620agggcggccgcctgcgagcgcgagaggagcgacgaagagtactacgccaaggaggtttac1680aaaatagacatgccgcccttcttcccctccgaaaatgccatcccgcccactttctacaga1740ccctacttcagaattgttcgatttgacgtctcagcaatggagaagaatgcttccaatttg1800gtgaaagcagagttcagagtctttcgtttgcagaacccaaaagccagagtgcctgaacaa1860cggattgagctatatcagattctcaagtccaaagatttaacatctccaacccagcgctac1920atcgacagcaaagttgtgaaaacaagagcagaaggcgaatggctctccttcgatgtaact1980gatgctgttcatgaatggcttcaccataaagacaggaacctgggatttaaaataagctta2040cactgtccctgctgcacttttgtaccatctaataattacatcatcccaaataaaagtgaa2100gaactagaagcaagatttgcaggtattgatggcacctccacatataccagtggtgatcag2160aaaactataaagtccactaggaaaaaaaacagtgggaagaccccacatctcctgctaatg2220ttattgccctcctacagacttgagtcacaacagaccaaccggcggaagaagcgtgctttg2280gatgcggcctattgctttagaaatgtgcaggataattgctgcctacgtccactttacatt2340gatttcaagagggatctagggtggaaatggatacacgaacccaaagggtacaatgccaac2400ttctgtgctggagcatgcccgtatttatggagttcagacactcagcacagcagggtcctg2460agcttatataataccataaatccagaagcatctgcttctccttgctgcgtgtcccaagat2520ttagaacctctaaccattctctactacattggcaaaacacccaagattgaacagctttct2580aatatgattgtaaagtcttgcaaatgcagctaaaattcttggaaaagtggcaagaccaaa2640atgacaatgatgatgataatgatgatgacgacgacaacgatgatgcttgtaacaagaaaa2700cataagagagccttggttcatcagtgttaaaaaatttttgaaaaggcggtactagttcag2760acactttggaagtttgtgttctgtttgttaaaactggcatctgacacaaaaaaagttgaa2820ggccttattctacatttcacctactttgtaagtgagagagacaagaagcaaatttttttt2880aaagaaaaaaataaacactggaagaatttattagtgttaattatgtgaacaacgacaaca2940acaacaacaacaacaaacaggaaaatcccattaagtggagttgctgtacgtaccgttcct3000atcccgcgcctcacttgatttttctgtattgctatgcaataggcacccttcccattctta3060ctcttagagttaacagtgagttatttattgtgtgttactatataatgaacgtttcattgc3120ccttggaaaataaaacaggtgtataaagtggagaccaaatactttgccagaaactcatgg3180atggcttaaggaacttgaactcaaacgagccagaaaaaaagaggtcatattaatgggatg3240aaaacccaagtgagttattatatgaccgagaaagtctgcattaagataaagaccctgaaa3300acacatgttatgtatcagctgcctaaggaagcttcttgtaaggtccaaaaactaaaaaga3360ctgttaataaaagaaactttcagtcagaataagtctgtaagtttttttttttctttttaa3420ttgtaaatggttctttgtcagtttagtaaaccagtgaaatgttgaaatgttttgacatgt3480actggtcaaacttcagaccttaaaatattgctgtatagctatgctataggttttttcctt3540tgttttggtatatgtaaccatacctatattattaaaatagatggatatagaagccagcat3600aattgaaaacacatctgcagatctcttttgcaaactattaaatcaaaacattaactactt3660tatgtgtaatgtgtaaatttttaccatattttttatattctgtaataatgtcaactatga3720ttta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