SDS-PMA-qPCR法检测乳中无乳链球菌活菌的方法与流程

本发明涉及乳样中致病菌检测技术技术领域，是一种sds-pma-qpcr法检测乳中无乳链球菌活菌的方法。

背景技术：

无乳链球菌(streptococcusagalactiae)是一种革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的致病菌，通常引起奶牛隐性乳房炎，它是链球菌属中最具感染力和传播速度最快的病原菌，也是人类和动物的一种重要的感染性病原菌，有可能发生食物中毒，生鲜乳中无乳链球菌的存在也是乳制品食物链中病原体的潜在来源，随之而来的是食物污染的风险。常规生物学方法是用于检测无乳链球菌的金标准，但它费力费时且特异性低，因此，建立一种快速、准确、灵敏的检测无乳链球菌方法对公众健康具有重要意义。

目前，多种快速检测方法如聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)已被视为检测乳或其他食品中无乳链球菌的可靠方法，实时荧光定量pcr(qpcr)由于其特异性和灵敏性，则可以克服常规生物学方法的这些缺点。然而，使用qpcr难以区分活细胞和死细胞，这导致了活细胞数量可能会被高估，存在假阴性和假阳性的问题。叠氮溴化丙啶(propidiummonoazide,pma)-qpcr检测技术是近年来兴起的活菌检测技术，主要原理是pma能穿透死细胞和受损细胞的细胞膜，在强光下与dna形成共价键，从而抑制死细胞qpcr中dna的扩增，而活细胞未结合dna可在qpcr反应中被扩增和检测，以达到区分死、活菌检测的目的。然而，当细菌暴露于低致死温度时，pma不能完全渗透到死细胞膜中，这表明在qpcr扩增阶段，并非所有来自死细胞的dna都能被抑制，易出现检测值偏高，造成假阳性情况，而pma浓度不适，也可能透过活菌的细胞膜与其dna结合，出现假阴性结果，造成检测结果不准确的情况。

技术实现要素：

本发明提供了一种sds-pma-qpcr法检测乳中无乳链球菌活菌的方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有技术中测定乳中无乳链球菌的qpcr检测方法和pma-qpcr检测方法容易造成结果存在假阳性或假阴性的现象的问题。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种sds-pma-qpcr法检测乳中无乳链球菌活菌的方法，按下述步骤进行：第一步，待测乳样处理：将待测乳样摇匀，取2ml乳样于ep管中，然后向其中加入sds母液10⁴μg/ml4μl、加入终浓度为10mg/ml的pma2μl得到混合物a，接着将混合物a于40℃恒温培养箱中避光培养20min，避光培养完成后，继续将混合物a放入冰水混合铁桶内浮漂开盖、用500w钨丝灯照射10min，照射完成后，将混合物a于1000rpm离心10min得到沉淀a，用1ml生理盐水洗涤沉淀a，再次离心5min得到沉淀b，用1.9mltebuffer对沉淀b进行重悬得到悬浮液a，向悬浮液a中加入100μl终浓度为10mg/ml的溶菌酶，置于37℃恒温培养箱培养30min至60分钟后，于1000rpm离心10min得到沉淀c；

第二步，dna提取：向沉淀c中加入1ml2％ctab裂解液后用移液枪轻吹重悬得到悬浮液b，向悬浮液b加入200mg玻璃珠后密封，进行研磨两次，然后向其中加入20μl蛋白酶k得到混合物b，将混合物b放入55℃水浴30min，每隔5min混匀一次，再70℃水浴20min，每隔5min混匀一次，接着将水浴后的混合物b于14000rpm离心5min，移取上清液、弃掉沉淀，得到上清液a，向上清液a中加入等体积的dna提取液得到混合物c，将混合物c于14000rpm离心5min，移取上清液、弃掉沉淀，得到上清液b，向上清液b中加入等体积的dna提取液得到混合物d，将混合物d于14000rpm离心5min，移取上清液、弃掉沉淀，得到上清液c，向上清液c中加入体积为上清液c0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀得到混合物e，将混合物e于14000rpm离心5min，弃去上清液，留取沉淀，得到沉淀d，用1ml70％乙醇洗涤沉淀d，并于14000rpm离心10min，弃去上清，留取沉淀，得到沉淀e，将沉淀e于滤纸上干燥20min至30min，挥发乙醇，最后向沉淀e中加入100μltebuffer重悬溶解dna得到模板dna；

第三步，qpcr扩增反应：首先准备引物序列，然后配制qpcr总反应体系，qpcr总反应体系的体积为25μl，qpcr总反应体系包括12.5μlmastermix、模板dna2μl、引物序列中上游引物1μl、引物序列中下游引物1μl、二次蒸馏水8.5μl，配制好qpcr总反应体系后用nanodrop1000分光光度计测其中dna浓度，接着将qpcr总反应体系在如下反应程序下进行30个循环反应：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min；

第四步，结果测定：用cfxmanager3.1计算得到标准曲线，将cq值换算称logcfu值得到乳中无乳链球菌含量，达到定量结果。

下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：

上述ctab包括100nmph为8的tris-hcl、1.4mnacl和20nmedta。

上述dna提取液为酚、氯仿、异丙醇配制而成，其中，按体积比酚：氯仿：异丙醇＝25：24：1。

上述引物序列为：上游引物5'-atgggatttgggataactaagctag-3'、下游引物5'-agcgtgtattccagatttccttat-3'。

本发明方法在提取dna之前，加入最佳浓度溶菌酶，有利于更好地提取dna，提高本检测方法的灵敏性，选用ctab法提取dna，提取效率高于试剂盒法，提取的dna浓度更高，可进一步提高检测方法的灵敏性，在用pma处理菌体之前，使用sds能增强pma对菌体的渗透性，并且合适的sds浓度能够有效促进pma对死菌的渗透效果，二者结合能够精确区分无乳链球菌活细胞和死细胞，总之，本发明方法不受待测乳样中无乳链球菌死菌的干扰，能够准确检测出并定量乳中无乳链球菌的具体含菌量，并且特异性高，可以避免假阳性结果。

附图说明

附图1为本发明中sds浓度优化的条状图。

附图2为本发明中pma浓度优化条状图。

附图3为本发明中当溶菌酶浓度分别为5mg/ml时的标准曲线。

附图4为本发明中当溶菌酶浓度分别为10mg/ml时的标准曲线。

附图5为本发明中当溶菌酶浓度分别为15mg/ml时的标准曲线。

附图6为本发明中当溶菌酶浓度分别为20mg/ml时的标准曲线。

附图7为本发明中向乳中添加不同量死菌、活菌时分别采用现有技术和本发明方法检测活菌含量的柱状图。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明，均为现技术中公知公用的化学试剂和化学用品；本发明中的百分数如没有特殊说明，均为质量百分数；本发明中的水如没有特殊说明，为自来水或纯净水；本发明中的溶液若没有特殊说明，均为溶剂为水的水溶液，例如，盐酸溶液即为盐酸水溶液；本发明中的常温一般指15℃到25℃的温度，一般定义为25℃。

实施例1，该sds-pma-qpcr法检测乳中无乳链球菌活菌的方法按下述步骤进行：第一步，待测乳样处理：将待测乳样摇匀，取2ml乳样于ep管中，然后向其中加入sds母液10⁴μg/ml4μl[理应向其中加入sds母液的浓度为20μg/ml，但是因为在2ml乳样中加入终浓度为20μg/ml的sds体积过少(只需0.008μl)，实际操作中，0.008μl非常不好量取，很容易造成误差，容易导致最终测试结果失真，因此，采用此浓度的sds母液不仅好量取，而且实际最终加入量与20μg/ml的sds加入量一致]、加入终浓度为10mg/ml的pma2μl得到混合物a，接着将混合物a于40℃恒温培养箱中避光培养20min，避光培养完成后，继续将混合物a放入冰水混合铁桶内浮漂开盖、用500w钨丝灯照射10min，照射完成后，将混合物a于1000rpm离心10min得到沉淀a，用1ml生理盐水洗涤沉淀a，再次离心5min得到沉淀b，用1.9mltebuffer对沉淀b进行重悬得到悬浮液a，向悬浮液a中加入100μl终浓度为10mg/ml的溶菌酶，置于37℃恒温培养箱培养30min至60分钟后，于1000rpm离心10min得到沉淀c；

第二步，dna提取：向沉淀c中加入1ml2％ctab裂解液后用移液枪轻吹重悬得到悬浮液b，向悬浮液b加入200mg玻璃珠后密封，进行研磨两次，然后向其中加入20μl蛋白酶k得到混合物b(加入蛋白酶k是为了去掉菌中蛋白质)，将混合物b放入55℃水浴30min，每隔5min混匀一次，再70℃水浴20min，每隔5min混匀一次，接着将水浴后的混合物b于14000rpm离心5min(离心是为了把玻璃珠离成沉淀，细菌已被破碎，dna裂解出来，因此细菌dna是上清液)，移取上清液、弃掉沉淀，得到上清液a，向上清液a中加入等体积的dna提取液得到混合物c，将混合物c于14000rpm离心5min，移取上清液、弃掉沉淀，得到上清液b，向上清液b中加入等体积的dna提取液得到混合物d，将混合物d于14000rpm离心5min，移取上清液、弃掉沉淀，得到上清液c，向上清液c中加入体积为上清液c0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀得到混合物e，将混合物e于14000rpm离心5min，弃去上清液，留取沉淀，得到沉淀d，用1ml70％乙醇洗涤沉淀d，并于14000rpm离心10min，弃去上清，留取沉淀，得到沉淀e，将沉淀e于滤纸上干燥20min至30min，挥发乙醇，最后向沉淀e中加入100μltebuffer重悬溶解dna得到模板dna；

第三步，qpcr扩增反应：首先准备引物序列，然后配制qpcr总反应体系，qpcr总反应体系的体积为25μl，qpcr总反应体系包括12.5μlmastermix、模板dna2μl、引物序列中上游引物1μl、引物序列中下游引物1μl、二次蒸馏水8.5μl，配制好qpcr总反应体系后用nanodrop1000分光光度计测其中dna浓度，接着将qpcr总反应体系在如下反应程序下进行30个循环反应：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min；

第四步，结果测定：用cfxmanager3.1计算得到标准曲线，将cq值换算称logcfu值得到乳中无乳链球菌含量，达到定量结果。

以上操作均为无菌操作。第二步中，向上清液c中加入体积为上清液c0.8倍体积的异丙醇，此处的异丙醇最好用冷的异丙醇，冷的异丙醇的温度为常规dna提取时常用的冷的异丙醇的温度，用冷的异丙醇，因为低温可以促进dna的沉淀，在dna量很少的情况可以提高抽提效率。

实施例2，作为上述实施例的优化，ctab包括100nmph为8的tris-hcl、1.4mnacl和20nmedta。

实施例3，作为上述实施例的优化，dna提取液为酚、氯仿、异丙醇配制而成，其中，按体积比酚：氯仿：异丙醇＝25：24：1。

实施例4，作为上述实施例的优化，引物序列为：上游引物5'-atgggatttgggataactaagctag-3'、下游引物5'-agcgtgtattccagatttccttat-3'。

试验方法

1、菌株的培养

将无乳链球菌(atcc12386)接种至bhi培养液，在37℃摇床孵育24h。取10ml悬浮液转移到50ml康宁管中，4℃下10000g离心3分钟，弃上清，用0.85％的生理盐水重悬。为了确定菌液浓度，用生理盐水将其依次稀释6个梯度，取100μl在bhi琼脂上涂布，37℃孵育24h后计数。

2、dna提取

用tebuffer(10mmtris-hcl和1mmedta，ph8.0)将菌体重悬，加入溶菌酶的储存液并调整其终浓度为200μg/ml，将混合液于37℃下培养1h。dna提取使用十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法，提取后的dna用nanodrop1000分光光度计测定浓度，放置于-20℃下保存。

3、死菌的制备

将含有菌悬液的离心管在90℃水浴中加热20min制备死菌，热处理后冷却至室温，在bhi板上用菌落计数验证无活细胞的存在。

4、引物包容性和排他性验证

使用30株菌株，其中包括1株无乳链球菌标准菌株和19株新疆农业科学院保藏的无乳链球菌菌株，另外10种牛奶已知致病菌菌株，用ctab法提取细菌dna。pcr反应体系(25μl)包括12.5μlmastermix，模板dna2μl，上、下游引物各1μl，引物的浓度为4400nm，ddh2o8.5μl。

引物序列为：上游引物5'-atgggatttgggataactaagctag-3'、下游引物5'-agcgtgtattccagatttccttat-3'；

反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环。扩增产物在1×te缓冲液配制的1.5％的琼脂糖凝胶电泳中进行电泳。

如表1所示，采用上述引物，只有无乳链球菌的dna显示出阳性信号，其他菌种的dna均无阳性信号。这个结果说明选取的引物具有高度特异性且对其他菌种的dna没有任何干扰。

5、sds浓度的优化

将sds溶解在去离子水中，制备成1％的sds储存液，然后灭菌。

无乳链球菌(atcc12386)菌悬液(8.6×107cfu/ml)在4℃下10000g离心10min。然后用不同浓度的sds重悬，sds的浓度分别为0、5、10、15、20、25、40、50、100、150、200、250、500μg/ml。取100μl重悬液涂平板，37℃下培养24h，观察菌落生长并计数。根据sds对无乳链球菌活菌的生长情况选取最佳浓度。

如图1所示，当sds浓度为0、5、10、15μg/ml时，对应的logcfu值分别为7.93、7.91、7.92、7.92，当sds浓度为20、25、40、50、100、150μg/ml时，logcfu值分别为7.82、7.77、7.77、7.32、6.75、0。从图中可见，当sds浓度为25μg/ml至100μg/ml时，logcfu值出现急剧下降。因此20μg/ml作为抑制死细胞信号的最佳浓度。

6、pma浓度的优化

将pma溶解在无菌水中，制成10mm的储存液，在-20℃下避光保存。

在pma处理前，先将等体积的无乳链球菌(atcc12386)活菌液(8.6×107cfu/ml)和死菌液均匀混合。取2ml混合液于离心管中2份，一份加入选取的最佳浓度的sds溶液，另一份不加sds溶液，再各加入不同浓度的pma溶液，浓度分别为0、10、20、30、40、50μm，充分混匀后暗处培养20min，使pma最大限度进入受损细胞内。然后将离心管置于500w钨灯下20cm处曝光10min(管口朝上，开盖，置于冰上)。曝光后的液体10000g离心10min以除去pma并用pbs冲洗。随后用ctab法提取基因组dna，进行qpcr检测。

qpcr反应体系：pcr反应体系(25μl)包括12.5μlmastermix，模板dna2μl，上、下游引物各1μl，引物的浓度为4400nm，ddh2o8.5μl。

引物序列为：上游引物5'-atgggatttgggataactaagctag-3'、下游引物5'-agcgtgtattccagatttccttat-3'；

反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环。扩增产物在1×te缓冲液配制的1.5％的琼脂糖凝胶电泳中进行电泳。

选取最大cq值对应pma浓度为最佳浓度。

如图2所示，当pma单独处理时，浓度为0、10、20、30、40、50μm时，对应的cq值分别为15.21、16.55、17.07、16.15、17.15、16.46，最大cq值对应的pma浓度为20μm。当pma联合sds同时处理时，浓度为0、10、20、30、40、50μm时，对应的cq值分别为15.39、25.37、24.15、24.16、25.02、25.12，最大cq值对应的pma浓度为10μm，说明sds促进了pma与死菌的结合能力，抑制死菌dna扩增，且能够降低pma完全抑制死菌的浓度，结合成本考虑，pma最优浓度为10μm(mg/ml)。

7、溶菌酶浓度验证

四组梯度稀释的已知浓度的无乳链球菌溶液用来验证最佳溶菌酶的浓度。每组加入不同浓度的溶菌酶溶液，分别为5，10，15，20mg/ml。得到的标准曲线线性最佳的溶菌酶浓度对应为溶菌酶的最佳浓度。

取无乳链球菌(atcc12386)活菌悬液，首先进行梯度稀释平板法确定菌液浓度为107cfu/ml，将菌液取出三份，每份2ml，每份在提取dna之前加入溶菌酶储存液(200mg/ml)，使溶菌酶终浓度为5、10、15、20mg/ml，然后用ctab法提取dna。将提取后的dna按10倍梯度连续稀释5次。

按照本实施例所述qpcr的操作进行qpcr扩增反应：qpcr反应体系：pcr反应体系(25μl)包括12.5μlmastermix，模板dna2μl，上、下游引物各1μl，引物的浓度为4400nm，ddh2o8.5μl。

引物序列为：上游引物5'-atgggatttgggataactaagctag-3'、下游引物5'-agcgtgtattccagatttccttat-3'；

反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环。扩增产物在1×te缓冲液配制的1.5％的琼脂糖凝胶电泳中进行电泳。

用cfxmanager3.1计算得到标准曲线如图3至图4所示。

当溶菌酶浓度分别为5mg/ml时，标准曲线如图3所示，r2为0.9881，e值为118％；

当溶菌酶浓度分别为10mg/ml时，标准曲线如图4所示，r2为0.9996，e值为95％；

当溶菌酶浓度分别为15mg/ml时，标准曲线如图5所示，r2为0.9992，e值为89％；

当溶菌酶浓度分别为20mg/ml时，标准曲线如图6所示，r2为0.9795，e值为80％；

当r²＞0.99，e值在90-110％的范围时，标准曲线线性良好。因此溶菌酶的最佳浓度为10mg/ml。

8、分别采用本发明上述实施例的sds-pma-qpcr法以及现有技术的qpcr法和pma-qpcr法进行待测乳样中无乳链球菌活菌含量的检测。

下面，向uht灭菌乳的待测乳样中加入不同量的无乳链球菌活菌和死菌，分别采用本发明上述实施例的sds-pma-qpcr法以及现有技术的qpcr法和pma-qpcr法进行待测乳样中无乳链球菌活菌含量的检测。

检测结果如附图7所示：

a组：当向乳中添加3×10³cfu/ml的无乳链球菌活菌时，qpcr法检测值为2.5×10⁴cfu/ml，pma-qpcr法检测值为2.1×10⁴cfu/ml，本发明的sds-pma-qpcr法检测值为2.0×10⁴cfu/ml，说明使用的牛奶中本身存在一定菌量的无乳链球菌活菌，测出的值均大于添加量。

b组：通过死菌、活菌不同比例设置，当向乳中添加3×10³cfu/ml的无乳链球菌活菌和3×10⁴cfu/ml无乳链球菌死菌时，qpcr法检测值为8.3×10⁴cfu/ml，pma-qpcr法检测值为2.1×10⁴cfu/ml，本发明的sds-pma-qpcr法检测值为2.2×10⁴cfu/ml，说明本发明的sds-pma-qpcr法和现有技术的pma-qpcr法能够去除无乳链球菌死菌只保留无乳链球菌活菌，而现有技术的qpcr方法却不能辨别无乳链球菌死菌；

c组，通过死菌活菌不同比例设置，当向乳中加入3×10⁴cfu/ml无乳链球菌活菌和3×10³cfu/ml无乳链球菌死菌时，qpcr法检测值为25.7×10⁴cfu/ml，pma-qpcr法检测值为7.4×10⁴cfu/ml，本发明的sds-pma-qpcr法检测值为4.8×10⁴cfu/ml,说明在无乳链球菌活菌和无乳链球菌死菌都存在的情况下，本发明的sds-pma-qpcr法能够结合无乳链球菌死菌dna，抑制其扩增，使其不干扰无乳链球菌活菌的检测，而现有技术中的qpcr方法和pma-qpcr方法无法真正辨别无乳链球菌活、死菌，从而影响检测结果，可以说本技术灵敏度更高，特异性更强。

通过上述检测结果可知，本发明方法与现有技术的qpcr法及pma-qpcr法相比，在uht灭菌乳中检测出无乳链球菌活菌含量更接近人为添加量。

一般情况下，患病乳(乳房炎)含有较高无乳链球菌，而健康乳中无乳链球菌含量较少，本发明方法对乳中无乳链球菌的检测限最低为10³cfu/ml，因此，使用本发明方法检测待测乳样得到的结果有两种情况：(1)检测值≥10³cfu/ml；(2)未检出。

综上所述，能够充分说明本发明方法特异性高，灵敏度强，并且能够精准检测乳中活的无乳链球菌。在dna提取之前，加入合适浓度的sds和pma，假阳性信号可以完全被消除，说明本发明方法不受待测乳样中无乳链球菌死菌的干扰，能够准确检测出并定量乳中无乳链球菌的具体含菌量，并且特异性高，所以该方法适用于乳中无乳链球菌活菌的检测。

本发明方法在提取dna之前，加入最佳浓度溶菌酶，有利于更好地提取dna，提高本检测方法的灵敏性，选用十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法提取dna，该方法的提取效率高于试剂盒法，提取的dna浓度更高，可进一步提高检测方法的灵敏性，本发明方法在用pma处理菌体之前，使用sds能增强pma对菌体的渗透性。并且合适的sds浓度能够有效促进pma对死菌的渗透效果，二者结合能够精确区分无乳链球菌活细胞和死细胞，说明本发明方法不受待测乳样中无乳链球菌死菌的干扰，能够准确检测出并定量乳中无乳链球菌的具体含菌量，并且特异性高，可以避免假阳性结果。

上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。

表1用于包容性和排他性测试的菌株