一种快速鉴定丝光绿蝇的方法与流程

本发明属于分子生物鉴定方法技术领域，特别涉及一种快速鉴定丝光绿蝇的方法。

背景技术：

在法医现场工作中，正确判断死亡时间(thepostmorteminterval，pmi)是尸检工作的重要任务之一。正确估计pmi是刑事案件侦破工作的关键。嗜尸性蝇类种群随死亡时间的变化呈现出不同的生长发育和群落演替规律，对死亡时间pmi推断具有重要意义。双翅目的丽蝇首先发现并到达尸体即产卵在尸体上，所以根据尸体上蝇类幼虫的发育状态就可以推断pmi。

然而，死亡现场经常会有不同嗜尸性蝇类的幼虫、卵或蛹，甚至为头、胸、翅、足等残体，给嗜尸性蝇类种类的准确鉴定造成了困难。对于幼虫的分类鉴定要比成虫困难得多，通常是将幼虫在室内饲养为成虫后进行鉴定，而这需要花费较长的时间，且形态学鉴定要求具有丰富的经验，在我国仅有少数形态学专家具备这方面的能力。鉴于案发现场蝇类的多样性和复杂性，非昆虫专业人员很难鉴定其形态学种属，因此迫切需要发展有关于不同嗜尸性蝇类的快速鉴定识别的技术。

丝光绿蝇(luciliasericata)，是一种重要的法医嗜尸性蝇类，其分布于我国大部分地区，且属于大多数地区的优势蝇种，本发明以丝光绿蝇为研究对象，针对上述问题，提供一种基于种特异性pcr技术的快速准确鉴定法医嗜尸性蝇种--丝光绿蝇的方法。

技术实现要素：

本发明针对丝光绿蝇设计特异性引物，运用快速分子鉴定的ss-pcr技术方法，快速准确地对其进行鉴定，可对幼虫、卵或蛹，甚至为头、胸、翅、足等残体鉴定，大大克服了形态鉴定的困难，缩短了法医鉴定周期。

本发明提供了一种快速鉴定丝光绿蝇的方法，包括以下步骤：

s1，采集蝇类残肢并提取dna样本，所得dna样本为待鉴定样品；

s2，设计特异性引物并对待鉴定样品进行pcr扩增；

其中，所述特异性引物序列为：

5’-ctttgaccctgcaggaggag-3’

5’-agctaatatggcataaatcatccct-3’

s3，对扩增后的产物用质量浓度为2％的琼脂糖凝胶进行电泳，若有片段条带，则样品为丝光绿蝇；若无片段条带，则样品不是丝光绿。

优选地，所述pcr扩增体系为：2×premixtaq溶液5ul，两条引物序列溶液各0.6ul，引物序列溶度均为10umol/l，样品dna模板1.3ul，ddh2o补足10ul。

优选地，所述pcr扩增条件为：95℃预变性1min；94℃40秒，68.3℃45秒，72℃40秒，共32次循环；72℃延伸8min，扩增产物4℃保存。

优选地，所述电泳条件为：120v、18min，溴化乙锭染色。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明针对丝光绿蝇设计特异性引物，运用快速分子鉴定的ss-pcr技术方法，快速准确地对其进行鉴定，可对幼虫、卵或蛹，甚至为头、胸、翅、足等残体鉴定，大大克服了形态鉴定的困难，缩短了法医鉴定周期，可同时对多个样本进行分析，工作效率高，具有快速简便、特异性高、灵敏度高、结果可靠的优点，满足法医学实验室快速分子鉴定的需求，在法医学司法鉴定实践中有推广普及价值。

附图说明

图1为本发明实施例1的鉴定结果图；

图2为本发明利用通用型引物lco1490和hco2198对嗜尸性蝇类dna样品的电泳结果图；

图3为本发明利用设计的种特异性引物对已知嗜尸性蝇类dna样品的电泳结果测试图；

其中，图1中：1-大头金蝇、2-巨尾阿丽蝇、(3至5)-丝光绿蝇(181bp)、6-叉丽蝇、7-反吐丽蝇、8-铜绿蝇、m-dl100bpdnaladder；

图2中：1-丝光绿蝇、2-大头金蝇、3-铜绿蝇、4-叉丽蝇、5-反吐丽蝇、6-叉叶丽蝇，7-亮绿蝇，8-紫绿蝇，9-巨尾阿丽蝇、m-dl100bpdnaladder；

图3中：1-大头金蝇、2-丝光绿蝇(181bp)、3-铜绿蝇、4-叉丽蝇、5-反吐丽蝇、6-叉叶丽蝇，7-亮绿蝇，9-紫绿蝇，10-巨尾阿丽蝇、m-dl100bpdnaladder。

具体实施方式

下面结合附图1-3对本发明的一个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1

s1，现场8种采集嗜尸型蝇类残肢并分别提取dna样本，所得dna样本为待鉴定样品，分别标记为1-8；

其中，蝇类残肢用去离子水中清洗后吸水纸吸干并离心管中，用眼科剪剪碎，使用takaraminibest试剂盒，参照说明书提取dna，4℃保存。

s2，设计特异性引物并对待鉴定样品进行pcr扩增；

其中，所述特异性引物序列为：

5’-ctttgaccctgcaggaggag-3’，如seqidno.1所示；

5’-agctaatatggcataaatcatccct-3’，如seqidno.2所示；

所述pcr扩增体系为：2×premixtaq溶液5ul，两条引物序列溶液各0.6ul，引物序列溶度均为10umol/l，样品dna模板1.3ul，ddh2o补足10ul；

pcr扩增条件为：95℃预变性1min；94℃40秒，68.3℃45秒，72℃40秒，共32次循环；72℃延伸8min，扩增产物4℃保存。

s3，对扩增后的产物用质量浓度为2％的琼脂糖凝胶进行电泳，置于凝胶成像系统观察并拍照，若有片段条带，则样品为丝光绿蝇；若无片段条带，则样品不是丝光绿蝇；

电泳条件为：120v、18min，溴化乙锭染色，dna样品与上样缓冲液loadingbuffer的用量比为3ul:1ul，上样缓冲液loadingbuffer由takara6×loadingbuffer加水稀释成4×loadingbuffer。图1为实施例1的鉴定结果图，从图可知泳道3至5有片段条带，说明样品3-5为丝光绿蝇，其余的则不是。

另外，为验证本发明的准确性，利用通用型引物lco1490和hco2198对嗜尸性蝇类dna样品的电泳结果图，如图2所示；又利用设计的种特异性引物对已知嗜尸性蝇类dna样品的电泳结果测试图，如图3所示，证明了本发明设计的引物对丝光绿蝇具有特异性，证明实施例1的鉴定结果准确可靠。

需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>河南科技大学

<120>一种快速鉴定丝光绿蝇的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctttgaccctgcaggaggag20

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agctaatatggcataaatcatccct25