灰霉菌分泌型蛋白激发子BcXyl1及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种灰霉菌(botrytiscinere)分泌型蛋白激发子。

背景技术：

目前，对植物病害的防治主要采取化学防治和选育抗病品种。但是随着病原菌致病小种的不断进化，对农药产生了抗药性而降低了防治效果，进而导致用药量的不断增加。同时大量使用化学农药导致的农产品安全、生态安全也越备受重视。随着生物技术的发展，植物诱导抗性受到极大关注，激发子作为诱导植物抗性的主要因子，愈发受到关注，并成为生物农药的重要发展方向。因此，从病原菌中分离鉴定出具有新功能的激发子已成为国内外科学家关注的焦点。

灰霉菌(botrytiscinerea)，又称灰葡萄孢菌，是一种广寄主性的、能够引起多种植物幼苗、果实及储藏器官的猝倒、落叶、花腐、烂果及烂窖。潮湿时病部表层产生大量的灰色霉层(分生孢子梗和分生孢子)，称为灰霉病。其在空气中广泛分布，不仅能够侵染田间作物，同样会给植物的采后阶段造成巨大损失。日常生活中遇到的果蔬放一段时间会长毛，多数就可能是受到了灰霉菌的侵染。灰霉菌在侵染植物过程中分泌产生的激发子能激活植物的免疫系统，诱导植物的防御反应，最终使植物产生系统抗性。

目前，国内外从灰霉菌中分离鉴定到能够引起植物抗病性的活性成分并不多。2010年，cuestaarenasy.等人从灰霉菌中分离到两个蛋白激发子bcnep1和bcnep2，这两个激发子能诱导植物防御反应(cuestaarenasy.等，生理学和分子植物病理学,灰葡萄孢属植物毒性海王星样蛋白的功能分析及作用模式.2010,74:376–386)；2011年，friasm等人从灰霉菌中分离得到了一种激发子bcspl1，该激发子是一种小分子蛋白，研究证明能诱导植物过敏反应，氧爆发和抗病相关蛋白的积累，促进水杨酸的合成，提升植物基础抗性(friasm.等，新植物学家，bcspl1是一种角脂蛋白家族蛋白，可引起灰霉病菌毒性反应，引起过敏反应寄主上2011，192:483–495)。后期实验进一步证明，2017年zhu等人分离得到的蛋白激发子bcxyg1有效地诱导烟草系统抗病性(wenjunzhu,等，植物病理学，bcxyg1是灰霉病菌分泌的一种木糖醛酸酶，触发细胞死亡和植物免疫反应,2017，175pp.438–456)。

所有已公开发表的文献表明，灰霉菌可以产生引起植物的防御反应、提高植物抗性的蛋白激发子。因此，寻找新的蛋白激发子，不仅对揭示灰霉菌与植物互作机理提供理论依据，更重要的是能为开发提高植物免疫抗性的蛋白质生物农药提供有效的蛋白资源。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种灰霉菌分泌型蛋白激发子bcxyl1及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种灰霉菌(botrytiscinerea)分泌型蛋白激发子bcxyl1，其氨基酸序列如seqidno:2所示。

本发明所述的蛋白激发子bcxyl1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用。

本发明所述的蛋白激发子bcxyl1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用，其中，所述植物为烟草和番茄。

本发明所述的蛋白激发子bcxyl1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用，其中，当用于诱导减少烟草花叶病、灰霉病和番茄灰霉病时，所述bcxyl1的诱导浓度为1μm。

一种bcxyl1基因，其中，其核苷酸序列为下列所述之一：

(1)编码如seqidno:2所示蛋白质的多核苷酸序列；

(2)与上述多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。

本发明所述的bcxyl1基因，其中，其多核苷酸序列如seqidno:1所示。也可以是编码如seqidno:2所示蛋白质的氨基酸的密码子的其他组合形式。

bcxyl1基因可用于基因工程菌株的表达，表达载体优选ppiczαa，重组载体可用毕赤酵母(pichiapastoriskm71h)表达。得到分子量约35kd的融合表达蛋白(bcxyl1)，可以诱导烟草对灰霉病，烟草花叶病和番茄灰霉病的抗性反应，提高植物抗性。

本发明所述的蛋白激发子可以通过基因工程手段表达获得重组蛋白。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

该蛋白激发子可以明显的提高植物的抗病性，浓度低，起效快，作用时间长。bcxyl1为提高植物抗病性、减轻病害发生提供了新的途径，因而在现在农业绿色发展上具有广阔的应用前景。

微生物保藏信息

编号cgmccno.7057，命名botrytiscinerea，菌株bc-98，2013年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话010-64807355。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的灰霉菌分泌型蛋白激发子bcxyl1及其应用作进一步说明。

附图说明

图1为蛋白激发子bcxyl1的sds-gage检测图；

图2为不同浓度下蛋白激发子bcxyl1在烟草叶片的过敏性反应检测；

图3为蛋白激发子bcxyl1诱导烟草叶片和番茄叶片ros反应；

图4为蛋白激发子bcxyl1诱导抗病相关基因的表达；

图5为蛋白激发子bcxyl1诱导烟草抗灰霉病的效果图；

图6为蛋白激发子bcxyl1诱导烟草抗花叶病的效果图；

图7为蛋白激发子bcxyl1诱导番茄抗灰霉病的效果图。

具体实施方式

实施例1bcxyl1蛋白的真核表达和纯化

(1)bcxyl1蛋白激发子的分离鉴定

木聚糖酶广泛的存在于植物病原菌的分泌物中，且已被验证可以作为蛋白激发子激活植物免疫反应(barakrotblat等人，植物杂志，eix蛋白激发子激发活性位点的一个重要组成部分的鉴定，(2002)32,1049–1055)。基于灰霉菌基因组已经完成测序，以及灰霉菌蛋白分泌组学数据，结合对蛋白激发子的筛选体系，在ncbi数据库中的cdd功能对灰霉菌分泌组中的木聚糖酶进行保守序列比对和系统发育进化树分析，确定了8个候选蛋白。将8个候选蛋白的编码序列分别构建到瞬时表达载体pyba1132中，转化农杆菌并注射烟草叶片，三天后观察是否有过敏性反应出现，并用westernblot检测候选蛋白是否在烟草中表达。根据植物过敏性反应有无及强弱，最终确定bcxyl1作为潜在的灰霉菌蛋白激发子。

(2)表达载体的构建

设计蛋白激发子基因bcxyl1的特异性引物，引入带有保护碱基的酶切位点，正向引物：5’-cgggatccgatatttcccaatgtaaatcc-3’(下划线为bamhi的酶切序列)，反向引物：5’-cggaattcgcataaaagtaattatccgaggtagt-3’(下划线为ecori的酶切序列)，扩增全长bcxyl1基因(94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，35cycles；72℃5min)。先将bcxyl11基因目的片段克隆到pmd18-tsimple载体，测序验证获得正确的质粒，然后利用ecori和xbai酶切后，将bcxyl1片段克隆到ppiczαa载体(invitrogen)的ecori/xbai位点。将重组载体ppiczαa-bcxyl1转化到大肠杆菌transt1菌株中，进行大量培养，提取质粒获得高浓度重组载体。

(3)诱导表达

利用内切酶pmei线性化构建好的重组载体ppiczαa-bcxyl1，电激转化到毕赤酵母(pichiapastoriskm71h)，然后利用博来霉素抗生素压力进行转化子的筛选，挑取阳性克隆进行诱导表达。接种阳性克隆子到10mlypd(1％yeastextract(酵母提取物)，2％peptone(蛋白胨)，2％dextrose(葡萄糖)培养基中，30℃，200rpm培养过夜，将10ml种子培养液接种于1lbmg(100mm，ph6.0磷酸缓冲液，1.34％ynb，1％甘油)培养基中，30℃，250rpm培养24h至od600＝6.0，离心发酵液，收集菌体，换用100mlbhh(100mm，ph6.0磷酸缓冲液，1.34％ynb，0.5％甲醇)培养基重悬菌体，30℃，250rpm继续培养，每24h添加终浓度为0.5％的甲醇。3天后，12000rpm离心收集上清液，取20μl上清液，加入4μl6×sds上样缓冲液(变性)，沸水浴中加热10min，后进行sds-page检测，考马斯亮兰r250染色，观察表达情况。

结果：经过sds-page检测，获得一个分子量约35kd的融合表达蛋白(bcxyl1)，与预测分子量大小一致(如图1)。

(4)重组蛋白的纯化

利用explorer10蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化。选用histraphppre-packed柱进行亲和层析，先用清洗缓冲液平衡亲和柱；取步骤(2)离心后的粗蛋白液5ml进样，流速为1ml/min，淋洗至基线后，洗脱缓冲液进行洗脱；收集洗脱峰，利用超滤管对洗脱峰组分进行除盐，然后进行sds-page电泳检测蛋白纯度。

结果：获得纯化的融合表达蛋白(bcxyl1)。

实施例2bcxyl1诱导植物防御反应

(1)bcxyl1诱导烟草过敏性反应(hr)

经测定浓度后的bcxyl1蛋白,调整浓度到4μm，3μm，2μm，1μm，800nm和500nm。选取生长旺盛的5～6叶期的烟草中部叶片，用1ml不带针头的注射器，将约20ul指定浓度的重组蛋白，从叶片背面注入不同的烟草叶片中。同时，处理后的叶片拍照后，进行台盼蓝染色，观察染色情况。

结果：在重组蛋白bcxyl1处理的叶片部位有明显的过敏性反应出现，台盼蓝染色后，过敏反应部位被染成蓝色(如图2)。

(2)bcxyl1诱导烟草和番茄叶片ros反应

经测定浓度后的bcxyl1蛋白，将其浓度调整到1μm。选取生长旺盛的5～6叶期的烟草和番茄中部叶片，用1ml不带针头的注射器，将约20ul重组蛋白bcxyl1，从叶片背面注入不同的叶片中。同时以相同浓度的pevc(表达空载体蛋白)为对照，注射24h后，取处理的叶片用蒸馏水洗净后将其置于500ml烧杯中，加入适量dab(3，3’-diaminbenzidine)(sigma)染液(1mg/ml，ph3.8)，真空将染色液抽入叶片，室温避光处理2小时后去除染色液，加入无水乙醇进行脱色，待叶片的绿色完全脱去后，将叶片取出，放置平整观察并拍照。

结果：在重组蛋白bcxyl1处理的叶片部位有明显的褐色沉积物质出现(如图3)。

(3)bcxyl1诱导抗性相关基因转录水平显著升高

为了进一步明确bcxyl1激发植物免疫的作用，采用实时荧光定量pcr方法对烟草抗性相关基因的表达量进行分析。选取重组蛋白bcxyl1和c^130-155(bcxyl1的功能域)处理样品以及对照蛋白pevc处理的样品液氮研磨成粉，利用transgen公司的植物rna提取试剂盒提取rna，去除基因组dna，获得高纯度的rna。第一链cdna的合成，采用transgen公司的transscripttwo-steprt-pcrkit。取500ng总rna，按照试剂盒说明书，用transscriptrt/rienzymemix，以anchoredoligo(dt)18为引物，42℃孵育30min，85℃加热5min使酶失活。取2ul反转录产物作为模板，β-actin为内参基因，检测抗性相关基因的表达量。相应的引物如下：

pr1-a：

f:5′-cgttgagatgtgggtcgatg-3′，如seqidno:5所示；r:5′-cctagcacatccaacacgaa-3′，如seqidno:6所示；

pr5：

f:5′-ctcatgctgccacttttgac-3′，如seqidno:7所示；r:5′-ctccaagattggcctgagtc-3′，如seqidno:8所示；

npr1:

f:5′-gatacacggtgctgcatgtt-3′，如seqidno:9所示；r:5′-aagcctagtgagcctcttgg-3′，如seqidno:10所示；

pal:

f:5′-attgctggtttgctcactgg-3′，如seqidno:11所示；r:5′-tccttaggctgcaactcgaa-3′，如seqidno:12所示；

coi1：

f:5′-aactggtcgggatctcttgg-3′，如seqidno:13所示；r:5′-taggcaagtatatgggcggg-3′，如seqidno:14所示。

结果：荧光定量pcr结果表明bcxyl1在处理烟草叶片后24小时导致抗病相关基因的表达量显著升高(如图4)。

实施例3bcxyl1诱导烟草和番茄抗病性

(1)诱导烟草对灰葡萄孢菌的抗性

50ul纯化后的bcxyl1(1μm)从叶子背面注入不同的烟草叶片中。以相同浓度的pevc作为对照，每处理20株，重复3次。诱导72h后点接种灰葡萄孢菌孢子悬浮液(10⁵个/ml)，保湿24h，第3d进行病斑大小测量。

对照叶片病斑面积＝40.09mm²

处理叶片病斑面积＝23.94mm²

结果：激发子蛋白bcxyl1可诱导烟草对灰霉菌的抗性(如图5)，且病斑面积减少约40.28％。

(2)诱导烟草对烟草花叶病毒(tmv)的抗性

50ul纯化后的bcxyl1溶液(500nm)从叶子背面注入不同的烟草叶片中，以相同浓度的pevc作为对照，每处理20株，重复3次。诱导72h后，在接种叶片的上三片叶片摩擦接种等量的tmv-gfp(添加了gfp标签的tmv，在紫外灯下可发出绿色荧光)。接种3d后统计侵染点数。

表1：bcxyl1诱导烟草抑制tmv侵染实验

表中不同字母表示在ρ＜0.01水平时的差异显著性。

结果：激发子蛋白bcxyl1可诱导烟草花叶病的抗性(如图6)，且减少病害55.6％。

(3)诱导番茄灰霉病的抗性

50ul纯化后的bcxyl1(1μm)从叶子背面注入不同的番茄叶片中。以相同浓度的pevc作为对照，每处理20株，重复3次。诱导72h后点接种灰葡萄孢菌孢子悬浮液(10⁵个/ml)，保湿24h，第3d进行病斑大小测量。

对照叶片病斑面积＝60.09mm²

处理叶片病斑面积＝27.44mm²

结果：激发子蛋白bcxyl1可诱导番茄对灰霉菌的抗性(如图7)，且病斑面积减少约54.33％。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>灰霉菌分泌型蛋白激发子bcxyl1及其应用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>980

<212>dna

<213>灰霉菌(botrytiscinere)

<400>1

atgcattcccttctttatgctaacatatgcattagcattttgctgtcacattgatatttc60

ccaatgtaaatcctcgtgggtacaatagcacgggatccaatagtacgaaatccaataata120

gtacgaaatctgaacagagcctcagaattcaacctctcggtaactcgataactttcggct180

acttatctagtgatggaaatggctttcgccttggccttcgtaatctactcacatctgctg240

gaaacaccgttcaatatgtgggctcggttcgagcaggcaacatgagtgacaatttcaatg300

aaggccacccaggggccatcatctctgaaattgccgaatatgcgaagttatctcttcccg360

aggatccaaatctggttttgctcatggctggtaccaatgacatgaacaatttcaacaatg420

tcaccacagctccagatcgactcagcggactcatcgatgagatcacttctatggttccga480

atgttactgtcatagttgctcagcttacccccgcttcaaactctagcgtagatgccgcga540

tggtcgctttcaattctaagatccccgatatcgttgcgtctaaagtttccgctggtcaaa600

aagtttccacagtcaacatgatggactatgtcactgtgaatgacttagtagatggacttc660

atccaacagattatggatatcagcaaatggcaaaagcatggttcgctgggattcagcaag720

tacagaagaatgggtggatagaccccccaatttccaccaacgtcacgctggctcttcaga780

cggcggtcgcagctagtacagctacaagtactatcagcagttccagcgccagttccacta840

gtacccaaactaccagcacaactatcggcagcagcagtagcacggcctcttccaaatcag900

cttccgacagaaattttcgtagtacttcgattagcacagtatgtcttttagttttggcca960

gctacttcttgcacgcctga980

<210>2

<211>329

<212>prt

<213>灰霉菌(botrytiscinere)

<400>2

methisserleuleutyralaasnilecysileserileleuleuser

151015

cysthrasnalaleuilepheproasnvalasnproargglytyrasn

202530

serthrglyserasnserthrlysserasnasnserthrlysserglu

354045

glnserleuargileglnproleuglyasnserilethrpheglytyr

505560

leuserseraspglyasnglypheargleuglyleuargasnleuleu

65707580

thrseralaglyasnthrvalglntyrvalglyservalargalagly

859095

asnmetseraspasnpheasngluglyhisproglyalaileileser

100105110

gluilealaglutyralalysleuserleuprogluaspproasnleu

115120125

valleuleumetalaglythrasnaspmetasnasnpheasnasnval

130135140

thrthralaproaspargleuserglyleuileaspgluilethrser

145150155160

metvalproasnvalthrvalilevalalaglnleuthrproalaser

165170175

asnserservalaspalaalametvalalapheasnserlysilepro

180185190

aspilevalalaserlysvalseralaglyglnlysvalserthrval

195200205

asnmetmetasptyrvalthrvalasnaspleuvalaspglyleuhis

210215220

prothrasptyrglytyrglnglnmetalalysalatrpphealagly

225230235240

ileglnglnvalglnlysasnglytrpileaspproproileserthr

245250255

asnvalthrleualaleuglnthralavalalaalaserthralathr

260265270

serthrileserserserseralaserserthrserthrglnthrthr

275280285

serthrthrileglyserserserserthralaserserlysserala

290295300

seraspargasnpheargserthrserileserthrvalcysleuleu

305310315320

valleualasertyrpheleuhisala

325

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgggatccgatatttcccaatgtaaatcc29

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cggaattcgcataaaagtaattatccgaggtagt34

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgttgagatgtgggtcgatg20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cctagcacatccaacacgaa20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

ctcatgctgccacttttgac20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ctccaagattggcctgagtc20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

gatacacggtgctgcatgtt20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

aagcctagtgagcctcttgg20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

attgctggtttgctcactgg20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

tccttaggctgcaactcgaa20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

aactggtcgggatctcttgg20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

taggcaagtatatgggcggg20