本发明涉及微生物遗传领域，具体涉及一种功能蛋白tp06128及其编码基因与应用。
背景技术：
：：能源是社会经济发展的重要因素，促进经济增长。化石燃料，尤其是石油和天然气，在一定程度上是有限的，并且大量化石燃料的使用对环境、人类的健康造成严重的危害。生物燃料乙醇具有对环境友好，可再生等优点，成为未来能源发展的主流。丝状真菌可以将木质纤维素类及淀粉类物质转化为微生物可发酵的糖,进一步通过工业发酵生产可增值的生物液体燃料和生物基化学品。木质纤维素类物质是世界上含量最多,分布最广泛的可再生生物资源(kuhadrcetal.microorganismsandenzymesinvolvedinthedegradationofplantfibercellwalls[m].biotechnologyinthepulpandpaperindustry.springerberlinheidelberg1997,45-125),一直被认为是最合适的解决能源危机的原料。目前，我国主要通过玉米陈化粮和木薯淀粉为原料生产燃料乙醇，中国是木薯淀粉的生产大国，在木薯淀粉生产燃料乙醇上占有绝对优势。目前，在燃料乙醇生产过程中面临的主要问题是丝状真菌中生物质降解酶的产量低、成本高。基于对淀粉酶及纤维素酶生产的调控机理的研究，通过遗传工程技术提高丝状真菌的生物质降解酶的产量具有重大意义和应用价值。淀粉酶是降解淀粉的酶的统称，按照对淀粉的降解方式不同分为4类：α-淀粉酶(α-amylase,ec3.2.1.1)、淀粉糖化酶(glucoamylase,ec3.2.1.3)、脱支酶和转移酶。其中α-淀粉酶和淀粉糖化酶在淀粉水解过程中发挥主要作用。α-淀粉酶随机切断淀粉内部的α-1,4-糖苷键，形成不同长度的寡糖；淀粉糖化酶从淀粉的非还原端开始往里切割，每次切下1个葡萄糖分子(vandermaarelmjecetal.propertiesandapplicationsofstarch-convertingenzymesofthealpha-amylasefamily[j].journalofbiotechnology2002,94(2):137-155)。纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，包括内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-d-glucanase，ec3.2.1.4)，外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-d-glucanase，ec3.2.1.91)，β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，ec3.2.1.21)。内切葡聚糖酶在纤维素多糖链内部随机切割，产生长度不等的纤维素多糖链及其还原性末端。外切葡聚糖酶作用于纤维素多糖链的还原性或非还原性末端，产生纤维寡糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维寡糖和纤维二糖，产生葡萄糖。这三种酶通过协同作用将纤维素水解成葡萄糖(wangjpetal.directinsituobservationofsynergismbetweencellulolyticenzymesduringthebiodegradationofcrystallinecellulosefibers[j].langmuir2013,29:14997-15005)。目前，对淀粉酶基因和纤维素酶基因的表达调控研究不多，且主要集中在曲霉、木霉和青霉。因此，鉴定嗜松蓝状菌(talaromycespinophilus)中淀粉酶和纤维素酶基因的新的关键调控因子具有潜在的应用价值。技术实现要素：本发明的目的是提供一种功能蛋白tp06128及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，获自嗜松蓝状菌(talaromycespinophilus)，命名为tp06128蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质。序列1由658个氨基酸残基组成，自n端的第240-317位氨基酸残基为rfx-dna结合功能域，该功能域与dna结合有关。为了使(a1)中的tp06128蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述(a2)中的tp06128蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的tp06128蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述tp06128蛋白的基因(tp06128基因)也属于本发明的保护范围。所述基因具体可为如下(1)-(4)中任一所述的dna分子：(1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；(2)序列表的序列3所示的dna分子；(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的dna序列杂交且编码所述tp06128蛋白的dna分子；(4)与(1)或(2)或(3)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码所述tp06128蛋白的dna分子。序列表中序列2是tp06128基因的cdna序列，由2586个碱基组成。序列表中序列3是tp06128基因的dna核苷酸序列，自5′端的第47-102位为tp06128基因的第一个内含子，第796-852位为tp06128基因的第二个内含子，第1172-1227位为tp06128基因的第三个内含子。上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。含有所述tp06128基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。本发明还保护所述tp06128蛋白或tp06128基因的应用，为如下(b1)-(b13)中的至少一种：(b1)调控微生物淀粉酶产量；(b2)调控微生物纤维素酶产量；(b3)调控微生物羧甲基纤维素酶产量；(b4)调控微生物外切纤维素酶产量；(b5)调控微生物β-葡萄糖苷酶产量；(b6)调控微生物淀粉酶基因的表达量；(b7)调控微生物α-淀粉酶基因的表达量；(b8)调控微生物淀粉糖化酶基因的表达量；(b9)调控微生物α-葡萄糖苷酶基因的表达量；(b10)调控微生物纤维素酶基因的表达量；(b11)调控微生物内切-1,4-β-d-葡聚糖酶基因的表达量；(b12)调控微生物纤维二糖水解酶基因的表达量；(b13)调控微生物β-葡萄糖苷酶基因的表达量。所述(b1)-(b5)中，所述调控为正向调控。所述淀粉酶基因具体可为tp04013、tp04014、tp09288、tp09267、tp00293、tp01354或tp05120。所述α-淀粉酶基因具体可为tp04014或tp09288。所述淀粉糖化酶基因具体可为tp09267。所述α-葡萄糖苷酶基因具体可为tp00293、tp04013、tp01354或tp05120。所述纤维素酶基因具体可为tp05820、tp08514或tp09412。所述纤维二糖水解酶基因具体可为tp09412。所述内切-1,4-β-d-葡聚糖酶基因具体可为tp08514。所述β-葡萄糖苷酶基因具体可为tp05820。本发明还保护一种抑制微生物生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力的方法，包括如下步骤：抑制所述微生物中tp06128基因的表达，得到生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力降低的微生物。本发明还保护一种抑制微生物生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力的方法，包括如下步骤：降低tp06128蛋白的表达量和/或活性，得到生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力降低的微生物。所述“抑制所述微生物中tp06128基因的表达”是通过向所述微生物中导入tp06128基因敲除盒实现的。本发明还保护一种制备重组微生物的方法，包括如下步骤：将抑制tp06128基因表达的物质导入出发微生物，得到生产纤维素酶和/或淀粉酶的能力低于所述出发微生物的重组微生物。所述抑制tp06128基因表达的物质具体可为tp06128基因敲除盒。所述抑制tp06128基因表达的物质还可为干扰载体；所述干扰载体为含有tp06128基因敲除盒的重组载体。以上任一所述tp06128基因敲除盒具体为序列表的序列4所示的dna分子。以上任一所述微生物或所述出发微生物可为蓝状菌属，具体可为嗜松蓝状菌，更具体可为嗜松蓝状菌1-95。以上任一所述微生物或所述出发微生物更具体可为以嗜松蓝状菌1-95为出发菌，敲除其tpku70基因得到的重组菌。以上任一所述微生物或所述出发微生物更具体可为嗜松蓝状菌突变体δtpku70。本发明还保护采用以上任一所述方法制备得到的重组微生物。本发明通过同源重组的方法敲除嗜松蓝状菌突变体δtpku70中tp06128基因(将所有敲除tp06128基因的重组菌均命名为突变株δtp06128)。突变株δtp06128具有如下特点：(1)在葡萄糖培养条件下，突变株δtp06128能够正常生长。(2)在淀粉诱导培养条件下，突变株δtp06128生长受到抑制。(3)在淀粉诱导培养条件下，相对于出发菌株δtpku70，突变株δtp06128的淀粉酶产量显著下降。(4)在麦麸加avicel诱导培养条件下，相对于出发菌株δtpku70，突变株δtp06128的滤纸酶产量、羧甲基纤维素酶产量、pnpg酶产量和pnpc酶产量均显著下降。(5)在淀粉诱导培养条件下，相对于出发菌株δtpku70，突变株δtp06128中淀粉酶基因的转录水平显著降低/升高。(6)在麦麸加avicel诱导培养条件下，相对于出发菌株δtpku70，突变株δtp06128中纤维素酶基因的转录水平显著降低/升高。本发明提供了一种嗜松蓝状菌的功能蛋白tp06128，通过实验证明功能蛋白tp06128在调控淀粉酶基因和纤维素酶基因的表达过程中起关键性作用，在提高淀粉酶产量和纤维素酶产量中具有应用潜力。附图说明图1为构建tp06128基因敲除盒的pcr产物电泳图。图2为tp06128基因敲除盒的元件示意图。图3为突变株δtp06128的pcr验证电泳图。图4为突变株δtp06128的southern杂交验证图。图5为基因tp06128回补表达盒的元件示意图。图6为回补株ctp06128的pcr验证电泳图。图7为突变株δtpku70和δtp06128在葡萄糖培养条件下的生物量检测结果。图8为突变株δtpku70和δtp06128在可溶性玉米淀粉培养条件下的生物量检测结果。图9为突变株δtpku70,δtp06128和ctp06128的淀粉酶产量检测结果。图10为突变株δtpku70,δtp06128和ctp06128的滤纸酶产量检测结果。图11为突变株δtpku70,δtp06128和ctp06128的羧甲基纤维素酶活力检测结果。图12为突变株δtpku70,δtp06128和ctp06128的外切葡聚糖酶活力检测结果。图13为突变株δtpku70,δtp06128和ctp06128的β-葡萄糖苷酶活力检测结果。图14为δtp06128相对δtpku70在淀粉诱导条件下淀粉酶基因的rt-qpcr检测结果。图15为δtp06128相对δtpku70在麦麸加avicel诱导条件下纤维素酶基因的rt-qpcr检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。嗜松蓝状菌(talaromycespinophilus)菌株1-95：参考文献：xianl,etal.purificationandcharacterizationofahighlyefficientcalcium-independentα-amylasefromtalaromycespinophilus1-95[j].plosone,2015,10(3):e0121531.；公众可以从广西大学获得。质粒plpmbn：参考文献:zhangt,zhaos,liaols,etal.deletionoftpku70facilitatesgenetargetingintalaromycespinophilusandidentificationoftpamyrinvolvementinamylaseproduction[j].worldjournalofmicrobiology&biotechnology,2017,33(9):171.公众可以从广西大学获得。质粒ppicz.a：invitrogen,http://www.biofeng.com/zaiti/jiaomu/ppicza.html。dna纯化试剂盒：天根生化科技有限公司，货号：dp214。溶菌酶：索莱宝公司，货号：l8120。蜗牛酶：索莱宝公司，货号：s8280。裂解酶：sigma公司，货号：l1412-5g。pda培养基：bd公司，货号：5056836。再生培养基：酸水解酪蛋白1.0g、酵母提取物1.0g、蔗糖342.0g、琼脂17.0g，蒸馏水定容至1l，115℃灭菌20分钟。基本培养基：kh2po44.0g、(nh4)2so44.0g、mgso4·7h2o0.6g、cacl20.6g、feso4·7h2o0.005g、mnso40.0016g、zncl20.0017g、cocl20.002g、tween801.0g，蒸馏水定容至1l，ph5.5；115℃灭菌20分钟。葡萄糖液体培养基：在基本培养基中加入葡萄糖，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/l。可溶性淀粉液体培养基：5g蛋白胨、3gkh2po4、2.5g(nh4)2so4、0.2gmgso4·7h2o、0.13gcacl2、0.0255gfeso4·7h2o、玉米可溶性淀粉10g，蒸馏水定容至1l，ph5.0。麦麸加avicel液体诱导培养基：5g蛋白胨、3gkh2po4、2.5g(nh4)2so4、0.2gmgso4·7h2o、0.13gcacl2、0.0255gfeso4·7h2o、麦麸10g、avicel10g，，蒸馏水定容至1l，ph5.0。cm培养基：20×硝酸盐50ml、微量元素混合液1ml、葡萄糖10.0g、蛋白胨2.0g、酵母提取物1.0g、酸水解酪蛋白1.0g，调ph至6.5；115℃灭菌20分钟。20×硝酸盐：nano3120g、kcl10.4g、mgso4·7h2o10.4g、kh2po430.4g，蒸馏水定容至1l；高压灭菌后室温保存。微量元素混合液：znso4·7h2o2.2g、h3bo31.1g、mncl2·4h2o0.5g、feso4·7h2o0.5g、cocl2·6h2o0.17g、cuso4·5h2o0.16g、na2moo4·2h2o0.15g、na4edta5.0g，蒸馏水定容至100ml。酶解液：溶菌酶0.2g、蜗牛酶0.3g、裂解酶0.3g，溶于50mlom溶液中；28℃，180rpm震荡30分钟后离心，将上清液过滤除菌，得到酶解液。om溶液：mgso4·7h2o73.92g、nah2po40.3g，溶于400ml去离子水；用1mna2hpo4水溶液调节ph至5.8，蒸馏水定容至500ml。trappingbuffer溶液:山梨醇36.4g、tris6.05g，溶于400ml去离子水中，用稀hcl溶液调节ph至7.0，蒸馏水定容至500ml。stc溶液：山梨醇91g、tris6g、cacl25.55g，溶于400ml去离子水中，用稀hcl溶液调节ph至8.0，蒸馏水定容至500ml。ptc溶液：聚乙二醇335040g、tris3g、cacl22.25g，溶于200ml去离子水中，用稀hcl溶液调节ph至8.0，蒸馏水定容至250ml。0.1％吐温80溶液:由吐温80和水组成，吐温80的体积百分含量为0.1％。蛋白提取液：10mlpbs缓冲液中含有5mmedta和5mmpmsf、1个completeultraproteaseinhibitorcocktailtablet(roche,cat.no.05892791001),ph7.4。southern杂交验证使用罗氏(roche)公司的dighighprimednalabelinganddetectionstarterkitii试剂盒，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。所使用的试剂配置方法如下：脱嘌呤液：取11～15ml浓盐酸加ddh2o定容至1l(0.125mhcl)。变性液：称取naoh20g，nacl87.66g，定容至1l。中和液：称取tris-base60.5g，nacl87.66g，加ddh2o至900ml，再用6mhcl调ph至7.5，补水至1l。柠檬酸钠缓冲液20×ssc：称量nacl175.32g，c6h5na3o7·2h2o88.23g，加ddh2o至900ml，再用浓盐酸调ph至7～8之间，定容至1l。20％sds：20gsds，定容至100ml。10mnaoh：20gnaoh，定容至50ml。洗膜液i：取10ml20×ssc，0.5ml20％sds，定容至100ml，现配现用，常温放置。洗膜液ii：取2.5ml20×ssc，0.5ml20％sds，定容至100ml，现配现用，需放在杂交炉中预热30min以上。马来酸缓冲液：称量nacl8.775g，c4h4o411.607g，定容至900ml，再用10mnaoh调ph至7.5，补水至1l。洗脱缓冲液(washingbuffer)：在马来酸缓冲液中加入终浓度为0.3％吐温-20。封闭缓冲液(blockingbuffer)：使用马来酸缓冲液将10×封闭缓冲液母液稀释成1×封闭缓冲液工作液。抗体溶液(antibodysolution)：20ml封闭缓冲液加1.5μl的抗体4-anti-digoxigenin-ap。检测缓冲液(detectionbuffer)：称量nacl0.585g，tris-base1.21g，定容至90ml，再用稀盐酸调ph至9.5，补水至100ml。实施例1、嗜松蓝状菌功能蛋白tp06128及其编码基因的发现通过对嗜松蓝状菌(talaromycespinophilus)1-95的基因组及其在不同碳源培养条件下的转录组进行大量的分析和功能验证，发现了一个新蛋白tp06128及其编码基因。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为tp06128，由861个氨基酸残基组成。将编码tp06128的基因命名为tp06128基因，tp06128基因的开放阅读框(orf)如序列表的序列2所示。tp06128基因的基因组dna如序列表的序列3所示。实施例2、嗜松蓝状菌tp06128基因敲除盒的构建1.提取嗜松蓝状菌1-95的基因组dna。2.以步骤1得到的基因组dna为模板，采用引物tp06128_left-arm-f和引物tp06128_left-arm-r组成的引物对进行pcr扩增，得到tp06128基因orf上游的1956bp片段(电泳结果见图1的泳道3)，称为tp06128左臂。tp06128_left-arm-f：5’-tcgtgtcatcttccagggtt-3’；tp06128_left-arm-r：5’-gtccctggaaaatcaactactccattccagaggtcgagtgagta-3’。3.以步骤1得到的基因组dna为模板，采用引物tp06128_right-arm-f和引物tp06128_right-arm-r组成的引物对进行pcr扩增，得到tp06128基因orf下游的2661bp片段(电泳结果见图1的泳道1)，称为tp06128右臂。tp06128_right-arm-f：5’-gatcccccggggatccacaactatctgtttgaatatttgag-3’；tp06128_right-arm-r：5’-ccaagaagcgaaacagc-3’。4.以含有苯菌灵抗性基因的质粒plpmbn为模板，采用引物对bena-f/bena-r进行pcr扩增，得到苯菌灵抗性基因bena的编码序列(2828bp)(电泳结果见图1的泳道2)。bena-f：5’-ggagtagttgattttccagggac-3’；bena-r：5’-ggatccccgggggatc-3’。5.将步骤2、步骤3和步骤4得到的tp06128左臂、tp06128右臂和bena抗性基因片段经dna纯化试剂盒纯化，按照摩尔比1:1:2混合后，进行融合pcr扩增，得到pcr融合产物。融合pcr反应条件：预变性98℃3min；98℃15s，58℃15s，72℃3min，进行20个循环反应；72℃10min。6.以步骤5得到的pcr产物为模板，采用引物tp06128_nest-f和引物tp06128_nest-r组成的引物对进行pcr扩增，得到5190bp的pcr产物(电泳结果见图1中泳道4)。tp06128_nest-f：5’-tcactggtaaacagggaacg-3’；tp06128_nest-r：5’-tggcgaacagaacaaacag-3’。经测序，得到的pcr产物如序列表的序列4所示。将序列表的序列4所示的dna分子命名为tp06128基因敲除盒。序列4中，自5’端第1-1937位核苷酸为tp06128左臂区段，第1938-4765位核苷酸为苯菌灵抗性基因bena区段，第4766-7110位核苷酸为tp06128右臂区段。tp06128基因敲除盒的元件示意图见图2。实际应用中，也可以直接人工合成序列4所示dna分子。实施例3、嗜松蓝状菌tp06128基因缺失突变株δtp06128的构建与验证1、以嗜松蓝状菌1-95为出发菌，敲除其tpku70基因，得到嗜松蓝状菌突变体δtpku70。记载嗜松蓝状菌突变体δtpku70，以及敲除tpku70基因具体步骤的文献如下：zhangt，etal.deletionoftpku70facilitatesgenetargetingintalaromycespinophilusandidentificationoftpamyrinvolvementinamylaseproduction[j].worldjournalofmicrobiology&biotechnology,2017,33(9):171。嗜松蓝状菌突变体δtpku70在文献中的名称为“talaromycespinophilusmutantδtpku70”。2、嗜松蓝状菌突变株δtpku70的原生质体的制备(1)将步骤1得到的嗜松蓝状菌突变体δtpku70接种于pda培养基平板上，28℃静置培养6天后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/ml)。(2)取2ml步骤(1)的孢子悬浮液，接种至200mlcm培养基中，28℃、180rpm振荡培养10-12小时。(3)完成步骤(2)后，4℃、3500rpm离心10min，弃上清，收集菌丝体沉淀，用灭菌水溶液洗涤2次，然后4℃、3500rpm离心15min，弃上清，收集菌丝体沉淀。(4)取(3)得到的菌丝体，用酶解液重悬，28℃、180rpm振荡反应2-3小时以进行酶解；用显微镜观察到大部分菌丝形成原生质体后，按每管12.5ml分装到50ml离心管中,加入2倍体积的trappingbuffer溶液，4℃、3500rpm离心30分钟，观察到明显的分层现象。(5)用巴氏吸管小心地吸出步骤(4)中间层的原生质体至新的50ml离心管中，加入2倍体积1m山梨醇水溶液漂洗2次，4℃、3500rpm离心15分钟，再使用20mlstc溶液漂洗2次后离心，弃上清，得到原生质体,放入-80℃冰箱中保存备用。3、嗜松蓝状菌突变株δtp06128的构建及验证(1)将4体积份的stc溶液和1体积份的ptc溶液混合，得到混合液，用混合液重悬步骤2得到的原生质体，得到原生质体溶液(调整浓度为1×107个/ml)。(2)用实施例2得到的tp06128基因敲除盒dna转化δtpku70原生质体(方法参照文献：churchillacletal.transformationofthefungalpathogencryphonectriaparasiticawithavarietyofheterologousplasmids[j].currentgenetics1990,17:25-31)，具体步骤如下：①将5μgtp06128敲除盒dna和3μl100mm亚精胺溶液混合后加入到100μl步骤(1)制备的原生质体溶液中，混合均匀，冰上反应30分钟；②反应结束后向溶液中加入1mlptc溶液，混合均匀，室温放置25min；③向混合液中加入2mlstc溶液混合均匀，将混合液加入到30ml预热的再生培养基中，混合均匀，将上述混合液倒入到无菌培养皿中(按每个培养皿分别倒入2-5ml)；待完全凝固后，室温放置30分钟，加入40ml含有g418(800μg/ml)与潮霉素(250μg/ml)的pda培养基，覆盖在再生培养基的表面，完全凝固后28℃倒置培养6天。④将步骤③的转化双层板的孢子用0.1％吐温80溶液冲洗，放入到新离心管中，用无菌水梯度稀释孢子悬浮液，将每个稀释梯度的孢子悬浮液涂在含有苯菌灵抗生素(20μg/ml)的pda平板上，28℃培养4-5天，挑选单菌落，随机选取三个候选突变株(δtp06128-2、δtp06128-3和δtp06128-4)，提取各候选突变株基因组dna，用引物对tp06128-f/tp06128-r、引物对tp06128_left-arm-f/bena交叉验证下游引物、引物对bena交叉验证上游引物/tp06128_right-arm-r进行pcr验证。tp06128-f：5’-ctgatgcttcctgccgttat-3’；tp06128-r：5’-caagcgtcaagcggtgta-3’；bena交叉验证上游引物：5’-tcattccactcaacattcaggc-3’；bena交叉验证下游引物：5’-acacacaggaaaacattgaccg-3’。结果如图3所示。图3中，泳道m为1kbdnamarker，泳道1为δtpku70的阳性对照，泳道2为ddh2o阴性对照，泳道3为δtp06128-2的鉴定结果，泳道4为δtp06128-2的鉴定结果，泳道5为δtp06128-4的鉴定结果。图3a为用引物对tp06128-f/tp06128-r检测tp06128基因是否被敲除；图3b为用引物对tp06128_left-arm-f/bena交叉验证下游引物的pcr产物；图3c为用引物对bena交叉验证上游引物/tp06128_right-arm-r的pcr产物。结果表明，δtp06128-2、δtp06128-3和δtp06128-4不能扩增出tp06128基因片段，而突变体δtpku70可以扩增出tp06128基因片段(图3a)。同时，δtp06128-2、δtp06128-3和δtp06128-4都扩增出左臂dna片段(图3b)和右臂dna片段(图3c)，而突变体δtpku70没有抗性基因bena存在，不能扩增出左臂和右臂基因片段(图3b-c)。这些结果表明菌株δtp06128-2、δtp06128-3和δtp06128-4中tp06128基因已被敲除。。⑤提取三个候选突变株(δtp06128-2、δtp06128-3和δtp06128-4)和突变体δtpku70的基因组dna，将基因组dna采用sacⅰ酶切后进行southern杂交分析，结果如图4所示。图4中，泳道m为1kbdnamarker，泳道1为突变体δtpku70作为对照，泳道2为δtp06128-2的鉴定结果，泳道3为δtp06128-3的鉴定结果，泳道4为δtp06128-4的鉴定结果。结果表明，δtp06128-2、δtp06128-3和δtp06128-4均得到大小为2315bp的杂交带，突变体δtpku70得到4348bp的杂交带，与预计结果一致。以上结果表明，将tp06128基因敲除盒导入嗜松蓝状菌突变体δtpku70得到的三个转化子(δtp06128-2、δtp06128-3和δtp06128-4)均为tp06128基因被敲除的突变菌株。将敲除tp06128基因的突变株δtp06128-4命名为突变株δtp06128并对其做进一步实验和检测。实施例4、嗜松蓝状菌缺失突变株δtp06128的回补菌株ctp06128的构建1、以嗜松蓝状菌突变体δtpku70的总dna为模板，使用引物对ctp06128-l-f/ctp06128-r进行pcr扩增得到tp06128左臂和tp06128编码框片段；用引物对tp06064ter-f/tp06064ter-r扩增得到tp06064终止子片段。所用引物序列如下：ctp06128-l-f：5’-tcaaatcaaagcgtccaac-3’；ctp06128-r：5’-cgaccgttatatagtcaagcaatcaggcgacaacaaccacg-3’；tp06064ter-f：5’-ttgcttgactatataacggtcg-3’；tp06064ter-r：5’-cgtcgtagaagcggtggt-3’。2、以嗜松蓝状菌突变体δtpku70的总dna为模板，用引物对ctp06128-r-f/ctp06128-r-r扩增得到tp06128右臂序列。所用引物序列如下：ctp06128-r-f：5’-aaggctttaatttgcaagctacaactatctgtttgaatatttgag-3’；ctp06128-r-r：5’-caccacgtcaccctgatc-3’。3、以含有博莱霉素抗性基因(ble)的质粒ppicz.a为模板，用引物对ble-f/ble-r扩增出ble序列。所用引物序列如下：ble-f：5’-accaccgcttctacgacgcccacacaccatagcttca-3’；ble-r：5’-agcttgcaaattaaagcctt-3’。4、将步骤2和步骤4得到的tp06064终止子片段和ble序列纯化后按照摩尔比1:1混合后，进行融合pcr扩增，得到pcr融合产物。融合pcr反应条件：预变性98℃3min；98℃15s，58℃15s，72℃3min，进行20个循环反应；72℃10min。5、以步骤4得到的pcr融合产物为模板，用引物对tp06064ter-f/ble-r扩增得到tp06064终止子加ble的融合片段。6、将步骤1、步骤2和步骤5得到的tp06128左臂和tp06128编码框片段、tp06064终止子片段加ble融合序列和tp06128右臂序列经dna纯化试剂盒纯化，按照摩尔比1：2：1混合后，进行融合pcr扩增，得到pcr融合产物。融合pcr反应条件：预变性98℃3min；98℃15s，58℃15s，72℃3min，进行20个循环反应；72℃10min。7、以步骤6得到的pcr融合产物为模板，用引物对ctp06128-nf/ctp06128-nr扩增得到tp06128回补盒。所用引物序列如下：ctp06128-nf：5’-ggtttcactggtaaacaggga-3’；ctp06128-nr：5’-gaggcgcaaactagattctga-3’。经测序，tp06128回补盒如序列表的序列5所示。序列5中，自5’端第1-1941位核苷酸为tp06128左臂区段，第1942-4696位核苷酸为tp06128编码框片段，第4697-5531位核苷酸为tp06064终止子片段，第5532-6704位核苷酸为ble序列，第6705-8643位核苷酸为tp06128右臂序列。tp06128回补盒的元件示意图见图5。实际应用中，也可以直接人工合成序列5所示dna分子。6、采用实施例3中制备的δtp06128-4替代嗜松蓝状菌突变株δtpku70，按照实施例3的步骤2制备原生质体，然后将步骤4制备的tp06128回补盒按照实施例3的步骤3中的(1)和(2)中的①-④转化到δtp06128-4突变株的原生质体中，将其中的含有苯菌灵抗生素(20μg/ml)的pda平板替换为含250μg/ml的博莱霉素的pda平板。将pcr验证引物替换为引物对tp06128-f/tp06128-r、引物对ctp06128-l-f/tp06064ter-r和引物对tp06064ter-f/ctp06128-r-r。pcr验证结果见图6。图6中，泳道m为1kbdnamarker，泳道1-3为回补菌株3个转化子的鉴定结果，泳道4为δtpku70的阳性对照，泳道5为ddh2o阴性对照。使用引物对tp06128-f/tp06128-r验证tp06128目的基因，结果三个转化子均有目的基因条带出现(图6-a)；用引物对ctp06128-l-f/tp06064ter-r做左交叉pcr验证，用引物对tp06064ter-f/ctp06128-r-r做右交叉pcr验证，结果三个转化子均含有与理论大小一致的条带(图6-b和c)。表明δtp06128回补菌株(ctp06128)构建成功。所用引物序列如下：tp06128-f：5’-ctgatgcttcctgccgttat-3’；tp06128-r：5’-caagcgtcaagcggtgta-3’；ctp06128-l-f：5’-tcaaatcaaagcgtccaac-3’；tp06064ter-r：5’-cgtcgtagaagcggtggt-3’；tp06064ter-f：5’-ttgcttgactatataacggtcg-3’；ctp06128-r-r：5’-caccacgtcaccctgatc-3’。实施例5、嗜松蓝状菌缺失突变株δtp06128在葡萄糖液体培养基中生物量的测定待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体δtpku70和突变株δtp06128。1、将待测菌株接种于pda培养基平板上，28℃静置培养6天。2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/ml)。3、将1ml步骤2得到的孢子悬浮液接种至100ml葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养72小时。分别于培养的第24小时、36小时、48小时、60小时和72小时收集培养体系中的所有菌丝体，50℃烘干至恒重,测定生物量(菌丝体干重)。结果如图7所示。结果表明，突变株δtp06128在葡萄糖液体培养基中生物量与δtpku70的生物量无显著差异，表明基因tp06128的敲除在葡萄糖存在下不影响嗜松蓝状菌的正常生长。实施例6、嗜松蓝状菌缺失突变株δtp06128在可溶性淀粉液体培养基中生物量的测定待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体δtpku70和突变株δtp06128。1、将待测菌株接种于pda培养基平板上，28℃静置培养6天。2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/ml)。3、将1ml步骤2得到的孢子悬浮液接种至100ml可溶性淀粉液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养72小时。分别于培养的第24小时、36小时、48小时、60小时和72小时收集培养体系中的所有菌丝体，50℃烘干至恒重,测定生物量(菌丝体干重)。结果如图8所示。结果表明，δtp06128在可溶性淀粉液体培养基中生物量比δtpku70的生物量显著降低，表明基因tp06128的敲除在可溶性淀粉诱导下降低嗜松蓝状菌的生长。实施例7、嗜松蓝状菌缺失突变株δtp06128淀粉酶产量的测定待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体δtpku70、突变株δtp06128和回补菌株ctp06128。1、将待测菌株接种于pda培养基平板上，28℃静置培养6天。2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/ml)。3、将1ml步骤2得到的孢子悬浮液接种至100ml葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养24小时，离心收集菌体，用无菌水洗涤2-3次。4、取步骤3得到的菌体(湿重为0.5g)，转接到100ml可溶性淀粉液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养5天。分别于培养第3天、第4天、第5天收集培养体系，12000rpm离心10min，收集上清液，即为粗酶液；收集固体菌丝体，提取胞内蛋白。5.检测步骤4得到粗酶液的淀粉酶产量，检测方法参考文献：zhangt,etal.deletionoftpku70facilitatesgenetargetingintalaromycespinophilusandidentificationoftpamyrinvolvementinamylaseproduction[j].worldjournalofmicrobiology&biotechnology,2017,33(9):171.6.6、提取步骤4得到菌丝体中的胞内蛋白。方法参照以下步骤：①将步骤4得到固体菌丝体放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末。②将步骤①得到的粉末转移到50ml离心管中，加入10ml蛋白提取液，再加入5g直径为0.25mm以及1g直径为3mm的玻璃珠。③将步骤②的混合液在旋涡振荡器上振荡1min，再放置冰上30s。重复8-10次。④将步骤③得到的混合液在7000rpm，4℃，离心20min，收集上清液，即为菌体胞内蛋白。胞内蛋白浓度检测方法参照文献：zort,etal.linearizationofthebradfordproteinassayincreaseitssensitivity:theoreticalandexperimentalstudies[j].analyticalbiochemistry1996,(236):302-308。嗜松蓝状菌待测菌株的淀粉酶产量(u/g胞内蛋白)＝步骤5(u/l)/步骤4(g/l)。结果如图9所示。结果表明，与δtpku70相比，突变株δtp06128的淀粉酶产量显著降低，而回补菌株的淀粉酶产量恢复到出发菌株水平，说明tp06128为淀粉酶产量的正调控基因。实施例8、嗜松蓝状菌缺失突变株δtp06128纤维素酶活力的测定待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体δtpku70、突变株δtp06128和回补菌株ctp06128。1、将待测菌株接种于pda培养基平板上，28℃静置培养6天。2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/ml)。3、将1ml步骤2得到的孢子悬浮液接种至100ml葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养24小时，离心收集菌体，用无菌水洗涤2-3次。4、取步骤3得到的菌体(湿重为0.5g)，转接到100ml麦麸加avicel液体诱导培养基中，28℃、180rpm振荡培养5天。分别于培养第3天、第4天、第5天收集反应体系，12000rpm离心10min，收集上清液，即为粗酶液。5.检测步骤4得到粗酶液的如下各项酶产量：滤纸酶产量、羧甲基纤维素酶产量(cmcase产量)、外切纤维素酶产量(pnpcase产量)、β-葡萄糖苷酶产量(pnpgase产量)。检测方法参照文献：ghosetk.measurementofcellulaseactivities[j].pureandappliedchemistry1959,(59):257-268；gokhaleetal.productionofcellulolyticenzymesbymutantsofaspergillusnigerncim1207[j].enzymeandmicrobialtechnology1988,(10):442-445。结果如图10-13所示。结果表明，与δtpku70相比，突变株δtp06128的滤纸酶产量(图10)、羧甲基纤维素酶产量(图11)、外切纤维素酶产量(图12)、β-葡萄糖苷酶产量(图13)均显著降低，而回补菌株的上述4种酶产量均恢复到出发菌株水平，说明tp06128为纤维素酶的产量的正调控基因。实施例9、tp06128基因的缺失对嗜松蓝状菌淀粉酶基因转录水平的影响待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体δtpku70和突变株δtp06128。1、将待测菌株接种于无菌pda培养基上，28℃恒温培养6天。2、用0.1％吐温80溶液将pda平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液并将浓度调整到1×108个/ml。3、将1ml步骤2得到的孢子悬浮液接种至100ml葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm培养24小时，收集菌丝体；将菌丝体转接至100ml可溶性淀粉液体培养基中，28℃、180rpm培养。分别收集诱导培养第12小时、第24小时和第48小时的培养体系，灭菌纱布过滤收集菌丝，提取总rna并反转录为cdna，以cdna为模板，进行定量rt-pcr检测。选择了与淀粉降解相关的7个基因，包括2个α-淀粉酶基因tp04014和tp09288，1个淀粉糖化酶基因tp09267，以及4个α-葡萄糖苷酶基因tp00293、tp04013、tp01354和tp05120。所用rt-qpcr引物序列如下：rt-tp05120-f5’-agttctggttacgcaagggc-3’rt-tp05120-r5’-atctgggaagtctgacggct-3’rt-tp00293-f5’-tgccacaagcacggaatg-3’rt-tp00293-r5’-cgccagaaataccaatcgc-3’rt-tp01354-f5’-accattcgtcttgactcgca-3’rt-tp01354-r5’-ccaccaatgtcgtgtccgt-3’rt-tp04013-f5’-aatgttcagacagggcacga-3’rt-tp04013-r5’-gaccgataataaatggacgctt-3’rt-tp09288-f5’-cttgtcggacggtatccccatt-3’rt-tp09288-r5’-ccaaacggcttcacggttatta-3’rt-tp04014-f5’-ggacagatttgcccgaacag-3’rt-tp04014-r5’-tccaaacagcagtgaatccca-3’rt-tp09267-f5’-gtgtcgttattgccagtccca-3’rt-tp09267-r5’-ctcagcaagacccaaaccactc-3’rt-tpactin-f5’-tcgctcttcctcacgctattt-3’rt-tpactin-r5’-gatgtcacggacgatttcacg-3’结果如图14所示。结果表明，在淀粉诱导12小时时，3个基因tp09288、tp09267和tp00293分别显著上调149.0％、278.0％和44.4％；2个基因tp01354和tp05120分别显著下调64.0％和81.4％；其余2个基因tp04014和tp04013无显著变化。在淀粉诱导24小时时，7个基因均上调，上调幅度在35.0％–469.1％之间。在淀粉诱导48小时时，除了基因tp01354外，其余基因均显著下调，下调幅度在62.6％–93.7％之间。以上结果表明,调控基因tp06128在淀粉诱导条件下,对嗜松蓝状菌关键淀粉酶基因的表达起关键调控作用。实施例10、tp06128基因的缺失对嗜松蓝状菌纤维素酶基因转录水平的影响待测菌株为：嗜松蓝状菌突变体δtpku70和突变株δtp06128。1、将待测菌株接种于无菌pda培养基上，28℃恒温培养6天。2、用0.1％吐温80溶液将pda平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液并将浓度调整到1×108个/ml。3、将1ml步骤2得到的孢子悬浮液接种至100ml葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm培养24小时，收集菌丝体；将菌丝体转接至100ml麦麸加avicel诱导培养基，28℃、180rpm培养。分别收集诱导培养第12小时、第24小时、第48小时的培养体系，灭菌纱布过滤收集菌丝，提取总rna并反转录为cdna，以cdna为模板，进行定量rt-pcr检测。测定了三个关键的纤维素酶基因tp09412、tp08514和tp05820，其中tp09412为外切纤维素酶基因cbh1，tp08514为内切1,4-β-葡聚糖酶基因eg1，tp05820为β-葡萄糖苷酶基因bgl1。所用引物序列如下：rt-tpactin-f5’-tcgctcttcctcacgctattt-3’rt-tpactin-r5’-gatgtcacggacgatttcacg-3’rt-tp08514-f5’-cggggctctttatctctctga-3’rt-tp08514-r5’-gttgcctcgccatttgct-3’rt-tp09412-f5’-ataacacccactaccaaatcttcg-3’rt-tp09412-r5’-gcaccgttcaaaccgcaa-3’rt-tp05820-f5’-tacgcaatgtcctcaaactcg-3’rt-tp05820-r5’-caatagactcagcagcggcac-3’结果见图15。结果表明，与出发菌株δtpku70相比，缺失突变株δtp06128中，在诱导12小时时，基因tp09412和tp08514分别显著下调80.3％和96.5％；tp05820显著上调267.2％。在诱导24小时时，3个基因均显著下调，下调幅度在73.6％–90.5％之间。在诱导48小时时，3个基因在缺失突变株δtp06128中的转录水平和在出发菌株δtpku70中的转录水平接近。以上结果表明,调控基因tp06128在麦麸加avicel诱导条件下,对嗜松蓝状菌关键纤维素酶基因的表达起关键调控作用。序列表<110>广西大学<120>功能蛋白tp06128及其编码基因与应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>861<212>prt<213>嗜松蓝状菌(talaromycespinophilus)<400>1metproprogluvalglyasphistrpgluprohispheprometasn151015argalahisserglnglysermetmetserhisthrglnproleuser202530argproglythralaaspproleuargserargserasnthralaile354045serargalahisargargproargserargglyserthralaserile505560hisserserthrthrglnglnthrglnaspglnhismetglyaspgly65707580pheserprophemetproserglnglnalaproprohisglyvalphe859095asnproasnprogluglumetmetmetargpheasnglnglnmetala100105110hisserasnserglnglyserleuaspvalsermethisglualahis115120125glyalavalmetglnargprogluaspphehisglyleuproasnser130135140metseraspmetvalproalahisglyileproserileprovalser145150155160histyrglyhisiletyraspglyserglymetaspproglnmetpro165170175aspargthrglyaspaspasnaspasnserglualaglyglyarglys180185190lysargglyserserserthrilealaasnaspasngluleuarglys195200205leuleuargglntyrgluglytyrthrleulysglnmetalathrglu2102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