一种植物多糖及用于猪繁殖的用途的制作方法

本发明属于畜牧领域，涉及一种植物多糖及用于猪繁殖的用途。
背景技术：
水菖蒲acoruscalamus为天南星科araceae多年水生草本植物，别名菖蒲，臭菖蒲，白菖蒲等。以根茎入药，具有开窍，化痰，健胃，益智，散风，活血等功效。生于海拔2600m以下的水边、沼泽湿地或湖泊浮岛上，在南北两半球的温带、亚热带，与我国各省均有分布。卵母细胞体外成熟是胚胎体外生产过程的关键环节，因为它决定卵母细胞的质量，影响胚胎的发育。通过在培养液中添加激素、细胞因子或生长因子等促进卵母细胞成熟已取得一定进展，但是体外成熟的卵母细胞的发育能力仍然不及体内成熟的卵母细胞，这说明卵母细胞的体外成熟体系还不完善，仍需要进一步优化。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种植物多糖及用于猪繁殖的用途。本发明上述目的通过如下技术方案实现：一种多糖，通过如下方法制备得到：s1、粗多糖的提取将干燥的水菖蒲acoruscalamus根茎粉碎，热水沸腾提取，提取液过滤，滤液浓缩至1/5体积，以sevag法除蛋白，离心去除中间有机相与水相交界处乳化层，合并上清液，加入无水乙醇沉淀多糖，静置，离心收集沉淀，用蒸馏水复溶、冷冻干燥得粗多糖；s2、粗多糖的初步纯化准确称取100mg上述麦胚粗多糖冻干粉充分溶解于10ml无菌水中，将配好的粗多糖溶液全部滴加上样至deae-sepharosefastflow(3.6cm×20cm)纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9mol/l的nacl溶液分别洗脱10个柱体积，洗脱的流速为1.2ml/min，收集0.9mol/l的nacl溶液洗脱液，冷冻干燥得到初步纯化多糖；s3、初步纯化多糖的进一步纯化称取0.9mol/lnacl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5ml超纯水溶解，然后上样至sephacryls-200hr凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4ml/min，收集第5～6个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖。优选地，步骤s1固液比为1:5。优选地，步骤s1提取3次，每次2h。优选地，步骤s1以sevag法除蛋白，3000r/min离心10min去除中间有机相与水相交界处乳化层。优选地，步骤s1加入4倍体积无水乙醇沉淀多糖。优选地，步骤s1加无水乙醇后于4℃静置24h。优选地，步骤s1加无水乙醇静置后以3000r/min离心10min收集沉淀。上述多糖用于促进猪卵母细胞体外成熟的用途。有益效果：本发明提供的纯化多糖a、b、d、e、f均一性较好，经hpgpc检测均只含一个主要的色谱峰，峰型对称且较窄；纯化多糖a、b、d、e、f对体外培养的猪卵母细胞具有显著的促进成熟作用，可以用于体外诱导猪卵母细胞成熟。附图说明图1为纯化多糖a的hpgpc图；图2为纯化多糖b的hpgpc图；图3为纯化多糖c的hpgpc图；图4为纯化多糖d的hpgpc图；图5为纯化多糖e的hpgpc图；图6为纯化多糖f的hpgpc图；图7为各组卵母细胞核成熟率(％)。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容。实施例1：多糖的制备一、实验材料干燥的水菖蒲acoruscalamus根茎购自亳州中药材市场。二、实验方法和结果1、粗多糖的提取将干燥的水菖蒲acoruscalamus根茎粉碎，热水沸腾提取，固液比为1:5，提取3次，每次2h；合并提取液，过滤，滤液浓缩至1/5体积，以sevag法除蛋白，3000r/min离心10min去除中间有机相与水相交界处乳化层，合并上清液，加入4倍体积的无水乙醇沉淀多糖，4℃条件下静置24h，3000r/min离心10min离心收集沉淀，用蒸馏水复溶、冷冻干燥得粗多糖。2、粗多糖的初步纯化准确称取100mg上述麦胚粗多糖冻干粉充分溶解于10ml无菌水中，将配好的粗多糖溶液全部滴加上样至deae-sepharosefastflow(3.6cm×20cm)纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0，0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9mol/l的nacl溶液分别洗脱10个柱体积，洗脱的流速为1.2ml/min，分别收集0.1，0.2，0.3，0.5，0.7，0.9mol/l的nacl溶液洗脱液，分别冷冻干燥得到不同的初步纯化多糖。3、初步纯化多糖的进一步纯化称取0.1mol/lnacl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5ml超纯水溶解，然后上样至sephacryls-200hr凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4ml/min，收集第4～5个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖a；称取0.2mol/lnacl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5ml超纯水溶解，然后上样至sephacryls-200hr凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4ml/min，收集第6～7个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖b；称取0.3mol/lnacl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5ml超纯水溶解，然后上样至sephacryls-200hr凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4ml/min，收集第5～6个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖c；称取0.5mol/lnacl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5ml超纯水溶解，然后上样至sephacryls-200hr凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4ml/min，收集第7～8个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖d；称取0.7mol/lnacl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5ml超纯水溶解，然后上样至sephacryls-200hr凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4ml/min，收集第6～7个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖e；称取0.9mol/lnacl溶液洗脱得到的初步纯化多糖25mg，用5ml超纯水溶解，然后上样至sephacryls-200hr凝胶柱，凝胶柱内径为2cm，柱床高度为75cm，用蒸馏水洗脱，洗脱的流速为0.4ml/min，收集第5～6个柱体积洗脱液，冷冻干燥得到纯化多糖f。纯化多糖a～f经hpgpc检测均只含一个主要的色谱峰，峰型对称且较窄，表明纯化多糖a～f的均一性较好。纯化多糖a～f的hpgpc图如图1～6所示。实施例2：多糖的药效一、实验材料和实验方法从当地屠宰场搜集初情期前小母猪卵巢，然后用注射器抽取法采集卵巢表面直径2～6mm卵泡的卵母细胞，挑选那些带有2层以上卵丘细胞、胞质均匀的卵丘细胞-卵母细胞复合体(cocs)，并随机分配于各试验组中。成熟液为tcm-199与猪卵泡液按照体积比9:1混合而成(还含有1％双抗)，多糖实验组分别加入30mg/ml纯化多糖a～f，对照组不添加，做成100μl微滴，上盖矿物油，培养20～30枚卵母细胞。培养箱条件为：5％co2的空气、最大相对饱和湿度、38.5℃。cocs经44h成熟培养后，去除卵丘细胞，在50倍实体显微镜下检查第1极体排出情况。将排出第1极体的卵子判断为核成熟卵，并按照如下公式计算各组卵母细胞核成熟率(％)：卵母细胞核成熟率(％)＝核成熟卵数÷总检查卵数×100％。为避免单次实验的误差，每组均设置5个平行。实验结果数据以均值±标准差表示，组间比较采用spss17.0软件进行单因素方差分析和t检验，p＜0.05表示差异有显著统计学意义。二、实验结果各组卵母细胞体外成熟情况如表1和图7所示。纯化多糖a、b、d、e、f可以显著促进猪卵母细胞体外成熟，而纯化多糖c不具备明显的促进作用。表1各组卵母细胞体外成熟情况组别卵母细胞核成熟率(％)对照组16.8±5.3纯化多糖a组53.5±7.1纯化多糖b组48.3±8.8纯化多糖c组18.2±6.5纯化多糖d组55.7±6.9纯化多糖e组58.1±7.5纯化多糖f组50.4±6.2综上可见，本发明提供的纯化多糖a、b、d、e、f均一性较好，经hpgpc检测均只含一个主要的色谱峰，峰型对称且较窄；纯化多糖a、b、d、e、f对体外培养的猪卵母细胞具有显著的促进成熟作用，可以用于体外诱导猪卵母细胞成熟。上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。当前第1页12