专利名称：阿魏侧耳多糖及其组合物的医药用途和制备方法
技术领域：
本发明涉及从阿魏侧耳(Pleurotus ferulae Lanzi)中制备的具有医 药用途的阿魏侧耳多糖和含有阿魏侧耳多糖的药物组合物，以及它们的制备、医药用途和 分析方法。
背景技术：
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，新疆是我国宫颈癌的高发区，发病率和死 亡率都很高，并有逐年上升及年轻化的趋势。宫颈癌治疗手段由传统的局部治疗手术、放 疗，发展到全身治疗——化疗。然而多种治疗方法均能减弱抗肿瘤免疫反应。因此，在宫颈 癌的治疗过程中，提高机体免疫功能在消灭肿瘤细胞的过程中起着重要的作用。目前已有大量临床研究证实中草药可改善肿瘤患者生存质量，抑制肿瘤，减轻症 状，甚至使患者带瘤延年。作为一种珍稀的药食两用资源，阿魏侧耳的抗肿瘤方面的研究 已有一些报道。本实验选用了文献中阿魏侧耳多糖的最适剂量500mg/kg，结果表明，阿魏 侧耳多糖对小鼠宫颈癌U14移植瘤有一定的抑制效果，抑瘤率达到39%，临床常用的宫颈 癌化疗一线药顺钼对其的抑瘤率为46. 5%，阿魏侧耳多糖与顺钼共同作用时，抑瘤率达到 65. 1%，说明阿魏侧耳多糖可以提高顺钼的抗癌疗效。同时此多糖对小鼠肝癌H22移植 瘤也有一定的抑制效果，抑瘤率达到54%。按照肿瘤研究规程规定，中草药的抑瘤率大于 30%时，认为对肿瘤有一定疗效，阿魏侧耳多糖已超过这一标准，因此有很好的开发前景。阿魏侧耳的抗癌机制可能是通过其免疫激活作用实现的。它可激活机体免疫系统 的细胞和体液免疫应答而发挥抗肿瘤作用，尤其是细胞免疫的激活及其产生的细胞因子具 有重要的作用。巨噬细胞是参与杀伤肿瘤的一种十分活跃的免疫效应细胞，ΜΦ主要通过内吞和 分泌一些效应分子杀伤肿瘤细胞，同时活化的ΜΦ能在摄入肿瘤后出现“呼吸爆发”迅速产 生一系列02_、Η202、0Η_等活性氧自由基和活性氮，这些活性基团在机体免疫治疗中介导细胞 免疫和细胞毒反应，参与杀伤肿瘤细胞；NK细胞是一类对多种靶细胞有自发性细胞毒活性 的效应细胞，NK细胞不经致敏可直接杀伤敏感的肿瘤细胞，如Κ562，YAC-I等，在抗新生瘤、 已形成瘤及肿瘤转移方面也有重要作用。T细胞在机体的细胞免疫和体液免疫诱导中均有重要作用。其作为免疫效应细胞， 主要有两方面功能即作为TDHT介导迟发型超敏反应和作为Tc细胞直接杀伤靶细胞。B细 胞通过分泌的抗体行使其免疫功能。另外，活化的B细胞还具有加工和提呈抗原给T细胞 的作用。B细胞分泌的抗体可执行多种免疫功能。淋巴细胞转化实验可以了解机体的细胞免疫功能。本实验通过对上述免疫细胞功 能测定，发现阿魏侧耳多糖可显著促进荷瘤小鼠ΡΜΦ的吞噬功能，增强脾中NK细胞杀伤 靶细胞Κ562的作用，提高Τ、B淋巴细胞的活性，表明其可通过促进荷瘤小鼠的细胞免疫功 能抑制移植性肿瘤U14的生长。T细胞亚群的检测是观察机体细胞免疫功能的重要方法之 一，⑶47⑶8+比值可直接反映宿主T淋巴细胞亚群的状态，且在一定程度上可间接了解机 体细胞免疫功能情况。因而测定CD4+和CD8+细胞百分比，或是两种细胞的比值，成了一种十分便捷的初步评估机体免疫状态的指标，只有当两者比例适当，才能发挥正常的抗肿瘤作用。Thl型细胞因子(TNF- α，IFN- γ )具有激活机体的抗肿瘤细胞免疫反应的能力， 其中TNF-α是一种有效的肿瘤细胞杀伤因子，也是机体炎症反应和免疫应答的重要调节 因子。TNF-α可与细胞表面特异性受体结合形成复合物，触发溶酶体的释放，引起肿瘤细 胞溶解；在体内，TNF-α对肿瘤血管内皮细胞有直接的毒性作用，可增加内皮细胞与中性 粒细胞的黏附，诱发机体凝血机制，经一系列连锁反应，产生血栓并阻塞血管，肿瘤组织因 缺氧而发生坏死。IFN-Y由活化的T细胞产生，可增强宿主T细胞受体依赖和HLA限制性 T细胞的细胞毒作用，具有增加表面MHC抗原和肿瘤坏死因子表达，抗肿瘤血管生成等多种 抗肿瘤作用。IFN-Y还可以通过调控肿瘤细胞的Fas/FasL表达以及增强肿瘤细胞对Fas 所介导凋亡途径的敏感性，使肿瘤细胞逃避免疫系统攻击的能力降低，从而抑制肿瘤细胞 的恶性增殖。因此TNF-α，IFN-γ在机体抗肿瘤免疫中具有重要的地位和作用。体内实验结果显示，阿魏侧耳多糖可明显促进荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功 能、脾中NK细胞的免疫活性，增加脾指数，提高脾脏Τ、B淋巴细胞转化率，促使CD3/CD8比 值恢复正常，提高细胞因子TNF-α、IFN-Y水平，并且与顺钼联用时可改善顺钼对荷瘤鼠 免疫功能抑制的影响。结果表明阿魏侧耳多糖可通过促进小鼠机体免疫功能抑制小鼠宫 颈癌U14移植瘤的增殖。同时，因为阿魏侧耳多糖能够促进机体免疫功能，因此有望在抑制肿瘤细胞生 长、增强人体免疫力、抗凝血、保护胃粘膜、抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、改善心脑 血管供血不足、去腻醒酒、护肤美容以及活血脉、抗衰老、降血脂、降胆固醇、降甘油三脂、改 善血液粘稠度和微循环、扩张血管、清除自由基、抗肿瘤、抗癌药物、功能食品和食品中得到 广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种从阿魏侧耳(Pleurotus ferulae Lanzi)中制备的 具有医药用途的阿魏侧耳多糖，该多糖不含有蛋白质，并且其HPLC-ELSD色谱具有如图1所 示的特征图谱。本发明还提供含有本发明阿魏侧耳多糖的药物组合物。本发明的药物组合物，以本发明阿魏侧耳多糖为活性成分，可以根据需要制备成 任何可服用的药物剂型如含片，片剂，胶囊，颗粒，口服液，注射剂，代泡茶，饮料等。在使用 时根据病人的情况，确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如1-20袋或粒或片，每剂 lmg-1000mg。在制备成药物制剂时，根据需要，可以加入药物或食用载体。本发明还包括本发明阿魏侧耳多糖的制备方法，该方法包括提取，除蛋白，纯化。 除蛋白采用以下方法，(1)溶剂萃取法；(2)离子交换树脂法；(3)酶法；(4)凝胶色谱法。纯 化采用以下方法，⑴溶剂萃取法；⑵乙醇沉淀法；⑶液_液逆流分配色谱法；⑷凝胶 色谱法。优选的本发明的制备方法，其中提取步骤如下阿魏侧耳粉碎，加水提取，离心或者过滤除去残渣，回收水提取液，得阿魏侧耳浓 缩液。其特征为1)阿魏侧耳为新鲜或者经过水充分浸润；2)水提取可以加热提取，并且通过粉碎、破碎，可以使提取时间大为缩短，最佳可至10-60分钟；3)为了提高离心或者过滤 除去残渣过程中效率，同时兼顾提取效率，破碎粒度控制在10-300目范围，其中以30-60目 为最佳。优选的本发明的制备方法，其中除蛋白方法选自(1)溶剂萃取法，其特征为阿魏侧耳浓缩液中先加入正丁醇 (100 1-100 20)，振摇，再加入三氯甲烷(100 1-100 50)，振摇，离心，蛋白质变成 不溶状态，存留在有机溶剂与水的界面，1-100次。最优为阿魏侧耳浓缩液中先加入正丁 醇((25 1)，振摇20min，再加入三氯甲烷(25 4)，振摇20min，离心，4000r/min离心 15min，反复6-8次。其特征为因为阿魏侧耳浓缩液地特殊性，用常规的正丁醇-三氯甲烷 混合液一起溶剂萃取的方法，难以达到除去蛋白质的目的，一定要先加入正丁醇振摇，再加 入三氯甲烷振摇。(2)离子交换树脂法，其特征为a)阴离子交换树脂200g，蒸馏水浸泡10h，lmol/L盐酸冲10个柱体积，蒸馏水冲 洗至中性，Imol/LNaOH冲10个柱体积，蒸馏水冲洗至中性，阿魏侧耳浓缩液5_500ml (相当 于原料5-500mg)用NaOH调节pH值为8_14，上样，蒸馏水洗脱，浓缩得到多糖提取物；继用 0. Imol/LNaOH洗脱，除去柱上的蛋白质。其中用NaOH调节pH值最优为8_11，上样量为阿 魏侧耳浓缩液50-100ml (相当于原料50-100mg)。b)阳离子交换树脂1000g，蒸馏水浸泡10h，Imol/LNaOH冲柱10个柱体积，蒸馏 水冲洗至中性，lmol/L盐酸冲10个柱体积，蒸馏水冲至中性，阿魏侧耳浓缩液5-500ml (相 当于原料5-500mg)用盐酸调节pH值为1-6，上样，蒸馏水冲柱，浓缩得到多糖提取物；继用 lmol/L盐酸洗脱，除去柱上的蛋白质。其中用盐酸调节pH值最优为3-5，上样量为阿魏侧 耳浓缩液50-100ml (相当于原料50-100mg)。(3)酶法，其特征为a)阿魏侧耳浓缩液5_500ml (相当于原料5_500mg)加入木瓜蛋白酶0. 6g，调 PH1-9，30-80°C水浴，放至室温，离心，取上清液，即可除去蛋白质。最优为阿魏侧耳浓缩液 50-100ml (相当于原料50-100mg)加入木瓜蛋白酶0. 6g，调PH5-6，60°C水浴1. 5h，放至室 温，3000r/min离心5min，取上清液，即可除去蛋白质。b)阿魏侧耳浓缩液5_500ml (相当于原料5_500mg)加入胃蛋白酶0. 05g，调PH 0-4. 5，30-45°C水浴，放至室温，加NaOH调至中性，加乙醇至含醇量50-95%，振荡后放置， 离心，取沉淀，即可除去蛋白质。最优为阿魏侧耳浓缩液50-100ml (相当于原料50-100mg) 加入胃蛋白酶0. 05g，调PH1. 5-2. 5，37°C水浴，放至室温，加NaOH调至中性，加乙醇至含醇 量85%，振荡后放置，3000r/min离心5min，取沉淀，即可除去蛋白质。(4)凝胶色谱法，其特征为取葡聚糖凝胶5g粉末，用蒸馏水浸泡在烧杯中溶涨，装柱。用滴管将阿魏侧耳浓 缩液5-500ml (相当于原料5-500mg)均勻加入到凝胶柱中，蒸馏水洗脱。每个流份经UV 200-500nm全波长扫描，检查蛋白质峰。并每个流份用硫酸-苯酚法反应后在490nm处检测 多糖。合并含有多糖，并不含有蛋白质的流份，即得。葡聚糖凝胶最优为sephadex G-100 和s印hadex G-50,阿魏侧耳浓缩液l_10ml (相当于原料1-lOmg)。优选的本发明的制备方法，其中纯化方法选自
(1)溶剂萃取法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、石油醚、汽油等有机溶剂，或以上溶剂的混 合溶剂，与水液液萃取除去蛋白质的阿魏侧耳提取液，水相中即为纯化的阿魏侧耳多糖。(2)乙醇沉淀法除去蛋白质的阿魏侧耳提取液，加入乙醇至乙醇浓度为50-95%，振荡后放置，离 心，取沉淀，可反复2-10次，即为纯化的阿魏侧耳多糖。其最优工艺为除去蛋白质的阿魏 侧耳提取液，加入乙醇至乙醇浓度为85%，振荡后放置，3000r/min离心5min，沉淀加水溶 解后再加乙醇离心，反复3次。(3)液_液逆流分配色谱法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、石油醚、汽油等有机溶剂，或以上溶剂的混 合溶剂，与水液_液逆流分配色谱法，除去蛋白质的阿魏侧耳提取液经分离，选取阿魏侧耳 多糖流出部分，即为纯化的阿魏侧耳多糖。(4)凝胶色谱法。取葡聚糖凝胶5g粉末，用蒸馏水浸泡在烧杯中溶涨，装柱。用滴管将除去蛋白质 的阿魏侧耳提取液5-500ml (相当于原料5-500mg)均勻加入到凝胶柱中，蒸馏水洗脱。每 个流份经硫酸_苯酚法反应后在490nm处检测多糖。合并含有多糖部分，即得纯化的阿魏 侧耳多糖。葡聚糖凝胶最优为s印hadex G-100和s印hadex G_50，除去蛋白质的阿魏侧耳 提取液I-IOml (相当于原料I-IOmg)。特别优选的本发明的制备方法如下取阿魏侧耳，切成小块，加水用榨汁机榨汁， 超声，煮沸，冷却，离心取上清液，滤纸抽滤，沉淀加水超声，煮沸，冷却，离心，取上清，滤纸 抽滤，合并上清液，浓缩，得浓缩液，浓缩液加入木瓜蛋白酶，调PH5-6，水浴加热，放至室温， 离心，取上清液，加乙醇放置，离心，取沉淀，即得。本发明还包括通过研究发现桑枝、桑叶、桑椹及其提取物、阿卡波糖等，可以通过 抑制胃肠道代谢酶，抑制阿魏侧耳多糖在胃肠道内的降解，从而提供了 口服给药系统(片 剂等制剂)和口含给药系统(含片等制剂)。本发明还包括本发明的阿魏侧耳多糖及其药物组合物在制备抑制肿瘤细胞生长、 增强人体免疫力、抗凝血、保护胃粘膜、抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、改善心脑血 管供血不足、去腻醒酒、护肤美容以及活血脉、抗衰老、降血脂、降胆固醇、降甘油三脂、改善 血液粘稠度和微循环、扩张血管、清除自由基的药物或功能食品和食品中的应用。本发明还包括阿魏侧耳多糖的检测方法，包括分光光度法和色谱法。其中分光光度法的方法如下a)标准曲线的制备称取烘干至恒重的无水葡萄糖0. IOllg溶于IOOml蒸馏水中，配成1. 011mg/ml的 标准溶液。然后分别取标准溶液0. 2,0. 3,0. 4,0. 6,0. 8ml置5只试管中，加蒸馏水1. Oml, 加入硫酸_苯酚显色液，沸水浴30min，放至室温，在490nm处，测其吸光度A。用同样处理 的蒸馏水做空白对照。以吸光度为纵坐标，糖浓度为横坐标绘制标准曲线。b)硫酸-苯酚配制苯酚5g，用少量水溶解，转移至IOOml容量瓶中，定容至刻度， 配成苯酚溶液。c)测定法IOmg样品溶解在IOml蒸馏水中，加Iml苯酚溶液，5ml硫酸，沸水浴30min，冷却至室温，490nm处测A，利用标准曲线法，计算，即得。其中色谱法的方法如下利用TOSOH TSKgel G4000PWXL (7. 8 X 30cm)凝胶柱，ELSD 检测器检测，进行 HPLC 分析的多糖含量测定方法。最优条件TOSOH TSKgel G4000PWXL(7. 8X 30cm)凝胶柱，ELSD 检测器检测，水为流动相，流速lml/min。(色谱图见图1)以下为本发明阿魏侧耳多糖的功效测定实验试验表明，本发明阿魏侧耳多糖提取物在制备抑制肿瘤细胞生长、增强人体免疫 力、抗凝血、保护胃粘膜、抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、改善心脑血管供血不足、去 腻醒酒、护肤美容以及活血脉、抗衰老、降血脂、降胆固醇、降甘油三脂、改善血液粘稠度和 微循环、扩张血管、清除自由基、抗肿瘤、抗癌药物、功能食品和食品中的应用。以下实验用于说明本发明提取物比现有类似物更加优越。1毒性试验药品本发明实施例2方法制备的阿魏侧耳多糖提取物本发明的小鼠口服一次给与最大给药浓度15g/Kg体重，均未见毒副反应，血液生 化指标均正常，研究结果本发明本发明实施例2方法制备的阿魏侧耳多糖提取物的小鼠口服一 次给与最大给药浓度15g/Kg体重，解剖尸体见肝脏红肿，肝功能异常。性c
因此说明本发明阿魏侧耳多糖提取物无3 2药效试验
药品本发明实施例2方法制备的阿魏侧耳多糖提取物 2. 1阿魏侧耳多糖对荷瘤鼠生长的影响 2. 1. 1阿魏侧耳多糖对U14荷瘤鼠生长的影响
表1结果显示，500mg/kg的阿魏侧耳多糖抑瘤率达到39%，表明其具有很强的抑 制小鼠宫颈癌U14移植瘤生长的作用；临床抗宫颈癌药顺钼的抑瘤率为46. 5% ；阿魏侧耳 且与临床抗宫颈癌药顺钼共同作用时，抑瘤率达到65. 1%，说明阿魏侧耳多糖可以提高顺 钼的抗癌疗效。 表1阿魏侧耳多糖对U14荷瘤鼠生长的影响
组别
剂量 (mg/kg)
荷瘤小鼠平均体重(g)
开始
结束
平均瘤重(g)
抑瘤率 (%)
NS
19.43 士 1.13 29.43±2.23
.30±0.09
DDP P.ferulae P.ferulae+DD P
319.75±0.96 25.00士 1.83 0.69土 0.24
500 18.8±0.83 30.60±2.61 0.79±0.11*
500+3
18.8±0.84 25.75士2.06 0,48士 0.12
46.5 39
65.1*p < 0. 05VsNS2. 1. 2阿魏侧耳多糖对H22荷瘤鼠生长的影响从表2可以得出，与模型组相比，阿魏侧耳多糖高、中、低各剂量组对H22肉瘤细胞 的生长均具有抑制作用，并且随给药剂量的增加其抑制作用增强。与模型组瘤重相比，各剂量组的抑瘤率均达到30%以上。表2阿魏侧耳多糖对H22荷瘤小鼠瘤重和抑瘤率的影响
分组剂量瘤重(g)抑瘤率(％)(g/l^g)模荆对照组-1.056土 0.35-1.00.576土 0.24**53.88阿魏侧耳多糖0.50.577土 0.27**45.450.250.714 土 0.30*45.36环磷酰胺0.020.487±0.20**32.39*Ρ < 0. 05，**P < 0. Olvs 模型对照组2. 2阿魏侧耳多糖对荷瘤小鼠免疫器官的影响2. 2. 1阿魏侧耳多糖对U14荷瘤鼠免疫器官的影响表3结果表明，500mg/kg的阿魏侧耳多糖可显著提高U14荷瘤小鼠的脾指数 (Vs NS, _p< 0.001)，顺钼组荷瘤鼠脾指数与阿魏侧耳组相比明显降低(Vs DDP，###p <0. 001)，阿魏侧耳与顺钼共同作用时可改善顺钼对小鼠免疫器官抑制的影响。表3阿魏侧耳多糖对U14荷瘤鼠免疫器官的影响
M剂量(mg/kg)脾指数
NS-7.42 土 1.03
DDP36.62±0.83
P.ferulae50010.02士 2.37***###
P.ferulae+DDP500+37.96±0.82*****p < 0. OlVs NS ；***p < 0. OOlVs NS ；###p < 0. OOlVs DDP2. 2. 2阿魏侧耳多糖对H22荷瘤鼠免疫器官的影响从表4可以得出，阿魏侧耳多糖高、中剂量组可以显著增加H22荷瘤小鼠的胸腺指 数和脾指数，提示阿魏侧耳多糖可提高H22荷瘤小鼠的免疫力。表4阿魏侧耳多糖对H22荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数的影响
^jI胸腺指数
11(mg/kg)
模剛对照组-0.14土0.030.51±0.041.0000.26 士 0.03*0.72±0.03**阿魏侧耳多糖5000.31 土 0.04**0.70±0.06**2500.21 土 0.020.63 士 0.02环磷酰胺200.15±0.020.41 ±0.04*P < 0. 05，**P < 0. Olvs 模型对照组2. 3阿魏侧耳多糖对二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响实验结果表明，与空白对照组比较，阿魏侧耳多糖中、高剂量组的肿胀度均有显著 性差异，阿魏侧耳多糖各剂量均可增加小鼠的胸腺指数；阿魏侧耳多糖中剂量组可以增加 小鼠的脾指数，提示阿魏侧耳多糖可提高正常小鼠的细胞免疫功能。结果见表5。表5阿魏侧耳多糖对DNFB所致小鼠迟发型超敏反应(DTH)免疫功能的影响
组别剂量 (g/kg)肿胀度 (mg)胸腺指数脾指数空白对照組5.02 十 0.520.15 十 0.020.81 土 0.09阳性对照组0.0039.73 土 1.23*0.20 土 0.030.85 土 0.141.09.04 十.0.68*0.31 .七 0.29**1.10 十 0.13阿魏侧耳多糖0.59.60 十.1.62*0.35 十.0.05**1.54 十.0.19*0.256.25 土 0.750.31 十 0.03**1.29 土 0.13*P < 0. 05，**P < 0. Olvs 空白对照组(n=i0’ X 土2. 4阿魏侧耳多糖对荷瘤小鼠腹腔M 吞噬功能影响图2和图3结果显示，500mg/kg的阿魏侧耳多糖可明显提高荷瘤小鼠PM小的吞噬 功能，吞噬百分率和吞噬指数均高于NS对照组(_p < 0. OOlvs NS)，而顺钼组荷瘤鼠的吞 噬百分率和吞噬指数与模型对照组相比均下降，阿魏侧耳与顺钼共同作用时，可显著提高 受顺钼抑制的荷瘤小鼠PM小的吞噬功能(###p < 0. OOlvs DDP)。2. 5阿魏侧耳多糖对荷瘤小鼠脾中N K细胞杀伤活性的影响表6显示，与NS对照组相比，500mg/kg的阿魏侧耳多糖可明显增强脾中NK细胞的 杀伤活性，其杀伤率可达78. 29%广p<0.001)。而顺钼组荷瘤鼠的NK细胞的杀伤活性与 与阿魏侧耳组相比显著下降(AAP < 0. 05)。此剂量的阿魏侧耳多糖与顺钼共同作用时，脾 中NK细胞杀伤率比单独使用顺钼时，作用明显提高(#p < 0. 05)，说明其可恢复受顺钼抑制 的脾中NK细胞的活性。表6阿魏侧耳多糖对荷瘤鼠脾中NK细胞杀伤活性的影响
12 **p < 0. Olvs NS ;#p < 0. 05，ΔΔρ < 0. Olvs DDP2. 6阿魏侧耳多糖对荷瘤小鼠脾脏Τ、Β淋巴细胞的影响表7结果显示，经阿魏侧耳多糖处理的荷瘤小鼠Τ、Β淋巴细胞对ConA、LPS的增殖 活性都不同程度的增高ΓΡ < 0. 5)，而DDP不能够增强T、B淋巴细胞的活性甚至抑制免疫功 能，DDP单独作用荷瘤小鼠后，其显著T、B淋巴细胞的活性显著低于阿魏侧耳多糖组(ΔΔΡ < 0. 01)。表7阿魏侧耳多糖对荷瘤鼠脾脏Τ、B淋巴细胞的影响 *ρ < 0. 5vs NS ；ΔΔρ < 0. Olvs DDP2. 7阿魏侧耳多糖对荷瘤小鼠鼠细胞因子水平的影响表8结果表明，500mg/kg的阿魏侧耳多糖可提高荷瘤小鼠血清中细胞因子 TNF- α (**ρ < 0. Olvs NS)和 IFN- γ (*ρ < 0. Olvs NS)的水平。而顺钼组荷瘤鼠的 TNF-α (ΔΔρ < 0. OlvsDDP)和IFN-γ (Δρ < 0. 05vs DDP)水平与阿魏侧耳组相比显著下 降。当阿魏侧耳与顺钼共同作用时，可显著提高受顺钼抑制的荷瘤小鼠血清中TNF-α水平 (Δρ < 0. 05vs DDP)，但IFNi水平提高不显著。表8阿魏侧耳多糖对荷瘤鼠细胞因子水平的影响 **p < 0. 01，*p < 0. 05vs NS ；ΔΔρ < 0. 01，Δρ < 0. 05vs DDP2. 8阿魏侧耳多糖对荷瘤小鼠外周血T细胞亚型的影响表9结果表明，肿瘤模型组外周血⑶47⑶8+比值增大，应用顺钼后更为明显，而阿 魏侧耳多糖可以逆转这种状况，与肿瘤模型组和顺钼组比较，差异均有统计学意义。
表9阿魏侧耳多糖对荷瘤鼠外周血CD4+/⑶8+比值的影响
组别齐1J 量(mg/kg)CD4+/CD8+Normal_1.65 土 0.42NS_2.25 士 0.94DDP33.45 士 0.80**P. ferulae5001.85 士 0.42δδP.ferulae+DDP500+32.99±0.91**p < 0. Olvs NS ；ΔΔρ < 0. Olvs DDP同时，因为阿魏侧耳多糖能够促进机体免疫功能，因此有望在抑制肿瘤细胞生 长、增强人体免疫力、抗凝血、保护胃粘膜、抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、改善心脑 血管供血不足、去腻醒酒、护肤美容以及活血脉、抗衰老、降血脂、降胆固醇、降甘油三脂、改 善血液粘稠度和微循环、扩张血管、清除自由基、抗肿瘤、抗癌药物、功能食品和食品中得到 广泛应用。
图1 阿魏侧耳多糖HPLC-ELSD图谱，色谱条件(T0S0H TSKgel G4000PWXL (7. 8 X 30cm)凝胶柱，ELSD检测器检测，水为流动相，流速lml/min)图2阿魏侧耳多糖对荷瘤小鼠腹腔M Φ吞噬功能的影响图3阿魏侧耳多糖对荷瘤小鼠腹腔M Φ吞噬指数的影响
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1 阿魏侧耳多糖的提取制备阿魏侧耳(新鲜)20kg，切成小块，每IOOg加水400ml，用榨汁机榨汁lmin，超声 30min,煮沸3h，冷却，离心取上清液，滤纸抽滤。沉淀加6被量水超声30min，煮沸lh，冷却， 离心，取上清，滤纸抽滤，合并上清液，浓缩，得浓缩液9L。出膏率7. 825%。实施例2 阿魏侧耳多糖的纯化实施例1制备的阿魏侧耳浓缩液50ml (相当于原料50mg)加入木瓜蛋白酶0. 6g， 调PH5-6，60°C水浴1. 5h，放至室温，3000r/min离心5min，取上清液，加乙醇至含醇量85%， 振荡后放置，3000r/min离心5min，取沉淀，反复操作3次，即得纯化阿魏侧耳多糖。实施例3 木瓜蛋白酶酶解工艺考察1、最适酶用量的确定取7个具塞锥形瓶，每瓶加入阿魏侧耳提取液20ml (43. 5mg/ml)，分别加入木瓜蛋 白酶(酶与底物质量比)Omg/g、2mg/g、4mg/g、6mg/g、8mg/g、1 Omg/g、12mg/g，用 HCL 调 PH6， 50°C水浴2h后沸水浴IOmin使酶灭活，冷却至室温，3000r/min离心5min，取上清液加95% 乙醇至醇浓度80%，3000r/min离心IOmin取沉淀，同法洗涤沉淀三次，测多糖得率。最佳 酶底比为8mg/g。
2、最适酶解时间的确定取7个具塞锥形瓶，每瓶加入阿魏侧耳提取液20ml (43. 5mg/ml)，分别加入木瓜 蛋白酶 6. 96mg 用 HCL 调 PH6，分别 50°C 水浴 0min、30min、60min、90min、120min、150min、 180min后沸水浴lOmin使酶灭活，冷却至室温，3000r/min离心5min，取上清液加95%乙醇 至醇浓度80%，3000r/min离心lOmin取沉淀，同法洗涤沉淀三次，测多糖得率。最佳酶解 时间为:120min。
3、最适PH值的确定取3个具塞锥形瓶，每瓶加入阿魏侧耳提取液20ml (43. 5mg/ml)，分别加入木瓜蛋 白酶6. 96mg用HCL分别调PH为5、7、9，分别50°C水浴120min后沸水浴lOmin使酶灭活， 冷却至室温，3000r/min离心5min，取上清液加95 %乙醇至醇浓度80 %，3000r/min离心 lOmin取沉淀，同法洗涤沉淀三次，测多糖得率。最佳酶解PH值为5。
4、最适酶解温度的确定取7个具塞锥形瓶，每瓶加入阿魏侧耳提取液20ml (43. 5mg/ml)，分别加入木瓜蛋 白酶 6. 96mg 用 HCL 分别调 PH 为 5 左右，分别 30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C水浴 120min后沸水浴lOmin使酶灭活，冷却至室温，3000r/min离心5min，取上清液加95%乙醇 至醇浓度80%，3000r/min离心lOmin取沉淀，同法洗涤沉淀三次，测多糖得率。最佳酶解 温度为:60°C。
酶质量mg6. 976. 976. 946. 956. 976. 946. 97多糖得率34. 9%35. 5%35. 7%36. 1 %28. 2%25. 8%24. 0%实施例4 多糖提取条件优化正交试验，设计L9(33)正交试验，以多糖得率为指标，优选最佳工艺。为了提高统 计分析的可靠性，每一条件下都作了重复试验(η = 3)，测定结果取其平均值。因素水平 正交试验结果及分析 从R值来看，Rc > Ra > Rb,即影响阿魏侧耳多糖提取率的诸因素的主次关系依次 是料液比(C) >浸提温度(A) >浸提时间(B)，从kl、k2、k3来看，最佳组合为A1B2Cy即浸 提温度70°C，浸提时间3h，料液比1 40实施例5 阿魏侧耳多糖含片的制备处方该药物每5000片主要原辅料的配比如下
阿魏菇多糖1250g
桑叶提取物125g
可溶性淀粉淀粉625g
微晶纤维素125g
糊精250g
10%淀粉浆适量(2g-20ml)
滑石粉25g
甜蜜素5g
具体的制备方法包括以下步骤进行
1.阿魏菇多糖冷冻干遅I法干燥后，粉碎过100目筛。
2.精密称取处方量的甜蜜素，可溶性淀粉2克加入20
均勻，放在80_85°C水浴下加热搅拌至半透明状态，取出备用。3.精密称取处方量的阿魏菇多糖，可溶性淀粉，微晶纤维素，糊精充分搅拌混合均 勻。4.用滴管吸取10%淀粉浆加入3中，边加边搅至“握之成团，触之即散”，过16号 筛制成湿颗粒，50-60°C温度下烘干，过16号筛整粒，压片。
实施例6 阿魏侧耳多糖片的制备 处方
该药物每5000片中主要原辅料的配比
阿魏菇多糖 桑椹提取物 可溶性淀粉淀粉 微晶纤维素 糊精
二氧化硅 10%淀粉浆
1250g 50g 450g 125g 250g 25g
适量(2g-20ml) 硬脂酸镁12. 5g
具体的制备方法包括以下步骤进行 阿魏菇多糖冷冻干燥法干燥后，粉碎过100目筛。
精密称取可溶性淀粉2克加入20毫升纯净水充分搅拌，混合均勻，放在80-85 °C水 浴下加热搅拌至半透明状态，取出备用。精密称取处方量的阿魏菇多糖，可溶性淀粉，微晶纤维素，糊精充分搅拌混合均 勻。用滴管吸取10%淀粉浆加入3中，边加边搅至“握之成团，触之即散”，过16号筛 制成湿颗粒，50-60°C温度下烘干，过16号筛整粒，压片。阿魏菇多糖干燥方法有两种直接冷冻干燥法，按重量的0. 5% -90. 0%糊精或微 晶纤维素加入后再冷冻干燥。直接冷冻干燥不容易粉碎，加入糊精或微晶纤维素再干燥容 易粉碎。
1权利要求
一种从阿魏侧耳中提取的阿魏侧耳多糖，其特征为，不含有蛋白质，并且其HPLC ELSD色谱具有如图1所示的特征图谱。
2.权利要求1所述的阿魏侧耳多糖，其特征为，用以下方法制备而成，阿魏侧耳提取， 提取物除蛋白，除蛋白后的提取物纯化得到，其中所述提取步骤如下阿魏侧耳粉碎，加水提取，离心或者过滤除去残渣，回收水提取液，得阿魏侧耳浓缩液，其中所述除蛋白方法选 自(1)溶剂萃取法阿魏侧耳浓缩液中先加入正丁醇，振摇，再加入三氯甲烷，振摇，离 心，蛋白质变成不溶状态，存留在有机溶剂与水的界面，1-100次，最优为阿魏侧耳浓缩液 中先加入正丁醇，振摇20min，再加入三氯甲烷，振摇20min，离心，4000r/min离心15min，反 复6-8次，其特征为因为阿魏侧耳浓缩液地特殊性，用常规的正丁醇_三氯甲烷混合液一 起溶剂萃取的方法，难以达到除去蛋白质的目的，一定要先加入正丁醇振摇，再加入三氯甲 烷振摇，(2)离子交换树脂法a)阴离子交换树脂200g，蒸馏水浸泡10h，lmol/L盐酸冲10个柱体积，蒸馏水冲洗至 中性，Imol/LNaOH冲10个柱体积，蒸馏水冲洗至中性，阿魏侧耳浓缩液5_500ml用NaOH调 节PH值为8-14，上样，蒸馏水洗脱，浓缩得到多糖提取物；继用0. Imol/LNaOH洗脱，除去柱 上的蛋白质，其中用NaOH调节pH值最优为8-11，上样量为阿魏侧耳浓缩液50-100ml，b)阳离子交换树脂1000g，蒸馏水浸泡10h，Imol/LNaOH冲柱10个柱体积，蒸馏水冲洗 至中性，lmol/L盐酸冲10个柱体积，蒸馏水冲至中性，阿魏侧耳浓缩液5-500ml用盐酸调节 PH值为1-6，上样，蒸馏水冲柱，浓缩得到多糖提取物；继用lmol/L盐酸洗脱，除去柱上的蛋 白质，其中用盐酸调节PH值最优为3-5，上样量为阿魏侧耳浓缩液50-100ml，(3)酶法a)阿魏侧耳浓缩液5-500ml加入木瓜蛋白酶0.6g，调PH1-9，30_80°C水浴，放至室 温，离心，取上清液，即可除去蛋白质，最优为阿魏侧耳浓缩液50-100ml加入木瓜蛋白酶 0. 6g，调PH5-6，60°C水浴1. 5h，放至室温，3000r/min离心5min，取上清液，即可除去蛋白 质，b)阿魏侧耳浓缩液5-500ml加入胃蛋白酶0.05g，调PH0-4. 5，30-45 °C水浴，放至 室温，加NaOH调至中性，加乙醇至含醇量50-95 %，振荡后放置，离心，取沉淀，即可除去蛋 白质，最优为阿魏侧耳浓缩液50-100ml (相当于原料50-100mg)加入胃蛋白酶0. 05g, 调PH1. 5-2. 5，37°C水浴，放至室温，加NaOH调至中性，加乙醇至含醇量85%，振荡后放置， 3000r/min离心5min，取沉淀，即可除去蛋白质，(4)凝胶色谱法取葡聚糖凝胶5g粉末，用蒸馏水浸泡在烧杯中溶涨，装柱，用滴管将阿魏侧耳浓缩液 5-500ml均勻加入到凝胶柱中，蒸馏水洗脱，每个流份经UV 200-500nm全波长扫描，检查蛋 白质峰，并每个流份用硫酸-苯酚法反应后在490nm处检测多糖，合并含有多糖，并不含有 蛋白质的流份，即得，葡聚糖凝胶最优为s印hadex G-100和s印hadex G_50，阿魏侧耳浓缩 液 l-10ml,其中所述纯化方法选自(1)溶剂萃取法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、石油醚、汽油等有机溶剂，或以上溶剂的混合溶剂，与水液液萃取除去蛋白质的阿魏侧耳提取液，水相中即为纯化的阿魏 侧耳多糖，(2)乙醇沉淀法除去蛋白质的阿魏侧耳提取液，加入乙醇至乙醇浓度为50-95%，振 荡后放置，离心，取沉淀，可反复2-10次，即为纯化的阿魏侧耳多糖，其最优工艺为除去蛋 白质的阿魏侧耳提取液，加入乙醇至乙醇浓度为85%，振荡后放置，3000r/min离心5min， 沉淀加水溶解后再加乙醇离心，反复3次，(3)液-液逆流分配色谱法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、石油醚、汽油等有机 溶剂，或以上溶剂的混合溶剂，与水液_液逆流分配色谱法，除去蛋白质的阿魏侧耳提取液 经分离，选取阿魏侧耳多糖流出部分，即为纯化的阿魏侧耳多糖，(4)凝胶色谱法取葡聚糖凝胶5g粉末，用蒸馏水浸泡在烧杯中溶涨，装柱，用滴管 将除去蛋白质的阿魏侧耳提取液5-500ml均勻加入到凝胶柱中，蒸馏水洗脱，每个流份经 硫酸_苯酚法反应后在490nm处检测多糖，合并含有多糖部分，即得纯化的阿魏侧耳多 糖，葡聚糖凝胶最优为si^phadex G-100和s印hadex G_50，除去蛋白质的阿魏侧耳提取液 I-IOml。
3.权利要求1所述的阿魏侧耳多糖，其特征为，用以下方法制备而成，阿魏侧耳，切成小块，加水用榨汁机榨汁，超声，煮沸，冷却，离心取上清液，滤纸抽滤， 沉淀加水超声，煮沸，冷却，离心，取上清，滤纸抽滤，合并上清液，浓缩，得浓缩液，浓缩液加 入木瓜蛋白酶，调PH5-6，水浴加热，放至室温，离心，取上清液，加乙醇放置，离心，取沉淀， 即得。
4.权利要求1所述的阿魏侧耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤如下提取，除蛋白， 纯化，其中除蛋白方法选自(1)溶剂萃取法；(2)离子交换树脂法；(3)酶法；(4)凝胶色谱 法，其中纯化方法选自(1)溶剂萃取法；(2)乙醇沉淀法；(3)液-液逆流分配色谱法；(4) 凝胶色谱法。
5.按权利要求4的制备方法，其特征在于其中所述提取方法，步骤如下阿魏侧耳粉 碎，加水提取，离心或者过滤除去残渣，回收水提取液，得阿魏侧耳浓缩液，其中1)阿魏侧 耳为新鲜或者经过水充分浸润；2)水提取可以加热提取，并且通过粉碎、破碎，可以使提取 时间大为缩短，最佳可至10-60分钟；3)为了提高离心或者过滤除去残渣过程中效率，同时 兼顾提取效率，破碎粒度控制在10-300目范围，其中以30-60目为最佳。
6.按权利要求4的制备方法，其特征在于其中所述除蛋白方法选自(3)溶剂萃取法，其特征为阿魏侧耳浓缩液中先加入正丁醇(100 1-100 20)，振 摇，再加入三氯甲烷(100 1-100 50)，振摇，离心，蛋白质变成不溶状态，存留在有机溶 剂与水的界面，1-100次，最优为阿魏侧耳浓缩液中先加入正丁醇((25 1)，振摇20min， 再加入三氯甲烷(25 4)，振摇20min，离心，4000r/min离心15min，反复6-8次，其特征 为因为阿魏侧耳浓缩液地特殊性，用常规的正丁醇_三氯甲烷混合液一起溶剂萃取的方 法，难以达到除去蛋白质的目的，一定要先加入正丁醇振摇，再加入三氯甲烷振摇，(4)离子交换树脂法，其特征为a)阴离子交换树脂200g，蒸馏水浸泡10h，lmol/L盐酸冲10个柱体积，蒸馏水冲洗至 中性，Imol/LNaOH冲10个柱体积，蒸馏水冲洗至中性，阿魏侧耳浓缩液5_500ml (相当于 原料5-500mg)用NaOH调节pH值为8_14，上样，蒸馏水洗脱，浓缩得到多糖提取物；继用0. Imol/LNaOH洗脱，除去柱上的蛋白质，其中用NaOH调节pH值最优为8-11，上样量为阿魏 侧耳浓缩液50-100ml (相当于原料50-100mg)，b)阳离子交换树脂lOOOg，蒸馏水浸泡10h，Imol/LNaOH冲柱10个柱体积，蒸馏水冲洗 至中性，lmol/L盐酸冲10个柱体积，蒸馏水冲至中性，阿魏侧耳浓缩液5-500ml (相当于原 料5-500mg)用盐酸调节pH值为1_6，上样，蒸馏水冲柱，浓缩得到多糖提取物；继用lmol/ L盐酸洗脱，除去柱上的蛋白质，其中用盐酸调节pH值最优为3-5，上样量为阿魏侧耳浓缩 液 50-100ml (相当于原料 50-100mg)，(3)酶法，其特征为a)阿魏侧耳浓缩液5-500ml(相当于原料5-500mg)加入木瓜蛋白酶0. 6g，调PH1-9， 30-80°C水浴，放至室温，离心，取上清液，即可除去蛋白质，最优为阿魏侧耳浓缩液 50-100ml (相当于原料50-100mg)加入木瓜蛋白酶0. 6g，调PH5-6，60°C水浴1. 5h，放至室 温，3000r/min离心5min，取上清液，即可除去蛋白质，b)阿魏侧耳浓缩液5-500ml(相当于原料5-500mg)加入胃蛋白酶0. 05g，调PH 0-4.5， 30-45°C水浴，放至室温，加NaOH调至中性，加乙醇至含醇量50-95%，振荡后放置，离心，取 沉淀，即可除去蛋白质，最优为阿魏侧耳浓缩液50-100ml (相当于原料50-100mg)加入胃 蛋白酶0. 05g，调PHl. 5-2. 5，37°C水浴，放至室温，加NaOH调至中性，加乙醇至含醇量85%， 振荡后放置，3000r/min离心5min，取沉淀，即可除去蛋白质，(4)凝胶色谱法，其特征为取葡聚糖凝胶5g粉末，用蒸馏水浸泡在烧杯中溶涨，装柱，用滴管将阿魏侧耳浓缩 液5-500ml (相当于原料5-500mg)均勻加入到凝胶柱中，蒸馏水洗脱，每个流份经UV 200-500nm全波长扫描，检查蛋白质峰，并每个流份用硫酸_苯酚法反应后在490nm处检测 多糖，合并含有多糖，并不含有蛋白质的流份，即得，葡聚糖凝胶最优为sephadex G-100和 sephadex G-50，阿魏侧耳浓缩液Ι-lOml (相当于原料Ι-lOmg)。
7.按权利要求4的制备方法，其特征在于其中纯化方法选自(4)溶剂萃取法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、石油醚、汽油等有机溶剂，或以上溶剂的混合溶 剂，与水液液萃取除去蛋白质的阿魏侧耳提取液，水相中即为纯化的阿魏侧耳多糖，(5)乙醇沉淀法除去蛋白质的阿魏侧耳提取液，加入乙醇至乙醇浓度为50-95%，振荡后放置，离心，取 沉淀，可反复2-10次，即为纯化的阿魏侧耳多糖，其最优工艺为除去蛋白质的阿魏侧耳提 取液，加入乙醇至乙醇浓度为85%，振荡后放置，3000r/min离心5min，沉淀加水溶解后再 加乙醇离心，反复3次，(6)液-液逆流分配色谱法采用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、石油醚、汽油等有机溶剂，或以上溶剂的混合溶 剂，与水液_液逆流分配色谱法，除去蛋白质的阿魏侧耳提取液经分离，选取阿魏侧耳多糖 流出部分，即为纯化的阿魏侧耳多糖，(4)凝胶色谱法，取葡聚糖凝胶5g粉末，用蒸馏水浸泡在烧杯中溶涨，装柱，用滴管将除去蛋白质的阿 魏侧耳提取液5-500ml (相当于原料5-500mg)均勻加入到凝胶柱中，蒸馏水洗脱，每个流份经硫酸_苯酚法反应后在490nm处检测多糖，合并含有多糖部分，即得纯化的阿魏侧耳多 糖，葡聚糖凝胶最优为s印hadex G-100和s印hadex G_50，除去蛋白质的阿魏侧耳提取液 l-10ml (相当于原料l-10mg)。
8.权利要求1所述的阿魏侧耳多糖在制备抑制肿瘤细胞生长、增强人体免疫力、抗凝 血、保护胃粘膜、抗疲劳、延缓衰老、调节中枢神经系统、改善心脑血管供血不足、去腻醒酒、 护肤美容以及活血脉、抗衰老、降血脂、降胆固醇、降甘油三脂、改善血液粘稠度和微循环、 扩张血管、清除自由基的药物、功能食品以及食品中的应用。
9.含有权利要求1的阿魏侧耳多糖的组合物，其特征在于，含有阿魏侧耳多糖以及药 物或食品可接受的载体，并且/或者含有桑枝、桑叶、桑椹及其提取物、阿卡波糖等糖苷酶 抑制剂，制备成任何可服用的药物剂型如含片，片剂，胶囊，颗粒，口服液，注射剂，代泡茶， 饮料等，在使用时根据病人的情况，确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如1-20袋 或粒或片，每剂lmg-1000mg。其中，糖苷酶抑制剂包括桑枝、桑叶、桑椹及其提取物、阿卡波 糖等糖苷酶抑制剂，我们发现加入它们的作用是可以通过抑制胃肠道代谢酶，抑制阿魏侧 耳多糖在胃肠道内的降解，从而提供了 口服给药系统(片剂等制剂)和口含给药系统(含 片等制剂)。
10.权利要求1所述的阿魏侧耳多糖的检测方法，其特征为包括分光光度法和色谱法，其中分光光度法的方法如下a)标准曲线的制备称取烘干至恒重的无水葡萄糖0. lOllg溶于100ml蒸馏水中，配成1. 011mg/ml的标准 溶液，然后分别取标准溶液0. 2,0. 3,0. 4,0. 6,0. 8ml置5只试管中，加蒸馏水1. 0ml，加入硫 酸_苯酚显色液，沸水浴30min，放至室温，在490nm处，测其吸光度A，用同样处理的蒸馏水 做空白对照，以吸光度为纵坐标，糖浓度为横坐标绘制标准曲线，b)硫酸-苯酚配制苯酚5g，用少量水溶解，转移至100ml容量瓶中，定容至刻度，配成 苯酚溶液，c)测定法10mg样品溶解在10ml蒸馏水中，加1ml苯酚溶液，5ml硫酸，沸水浴30min， 冷却至室温，490nm处测A，利用标准曲线法，计算，即得，其中色谱法的方法如下利用T0S0H TSKgel G4000PWXL (7. 8 X 30cm)凝胶柱，ELSD检测器检测，进行HPLC分析 的多糖含量测定方法，最优条件T0S0H TSKgel G4000PWXL (7. 8 X 30cm)凝胶柱，ELSD检测 器检测，水为流动相，流速lml/min。
全文摘要
本发明涉及从阿魏侧耳中制备的阿魏侧耳多糖及其组合物的医药用途和制备方法，本发明的制备方法，包括提取，除蛋白，纯化，除蛋白采用以下方法，(1)溶剂萃取法；(2)离子交换树脂法；(3)酶法；(4)凝胶色谱法，纯化采用以下方法，(1)溶剂萃取法；(2)乙醇沉淀法；(3)液-液逆流分配色谱法；(4)凝胶色谱法。
文档编号A61K47/46GK101914168SQ20101027298
公开日2010年12月15日 申请日期2010年9月6日 优先权日2010年9月6日
发明者卢立娜, 巩平, 张翠, 李国玉, 杨琳, 王莹, 王金辉, 秦颖, 魏秀岩, 黄健 申请人:石河子大学