专利名称：：水解的蛋白质-多糖复合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及水解的蛋白质-多糖复合物，并更具体地涉及通过蛋白质和多糖之间的复合物形成然后通过水解获得的那些水解的蛋白质-多糖复合物。得到的复合物具有良好的乳化和稳定化特性，并可以用于食品、美容产品或者药物产品。本发明进一步涉及生产此类复合物的方法。
背景技术：
：蛋白质-多糖复合物稳定乳剂和泡沫剂的能力是本领域熟知的。例如，US3，944，680描述了这些复合物在存储稳定的可搅拌乳剂中(storagestablewhippableemulsion)作为对单独的球状蛋白质的合适备选物。US6,197，319涉及这些复合物在美容组合物中作为避免当蛋白质或多糖单独地使用时获得的不稳定产物的方法的用途。欧洲专利号340035中描述了将微片段化的离子多糖/蛋白质复合物分散体作为脂肪替代物用于食物产品例如冰淇淋、沙拉酱、调味汁、涂食品的果酱和佐料。具有高乳化能力的乳化剂描述于WO2004/078334中。该乳化剂通过在pH2至pH5加热下，酸性多糖和蛋白质或者水解蛋白质之间的复合物形成产生。此外，Pilosof，A.M.R.等在FoodHydrocolloids,19，2005，361-369中讨论了泡沫剂中水解的向日葵蛋白质对与多糖相互作用的影响。蛋白质有限的水解似乎促进了其发泡特性并且也影响了蛋白质-多糖相互作用。W02004/028281公开了静电结合的蛋白质-多糖复合物作为表面活性剂和稳定剂在任一类型的乳剂或者泡沫剂中的用途。发明目的因此，本发明的目的是进一步改进蛋白质-多糖复合物的乳化特性和稳定特性。发明概述该目的通过独立权利要求解决。从属权利要求进一步发展了本发明的中心思想。因此，在第一方面，本发明涉及通过用酶水解蛋白质-多糖复合物获得的和/或可获得的水解蛋白质-多糖复合物。根据权利要求1至5中任一项的复合物作为乳化剂和/或稳定剂在食物产品、美容产品或者药物产品中的用途也构成本发明的一部分，食物产品优选地选自甜品、冷冻甜品、乳制品、宠物食品、烹饪制品、临床营养制品；美容产品优选地选自乳膏、泡沫剂、摩丝、凝胶、洗发剂、乳剂；药物产品优选地选自片剂、胶囊剂、糖浆剂。最后，本发明也涉及用于生产水解蛋白质-多糖复合物的方法，包括步骤a.将蛋白质溶液与多糖混合以诱导复合物的形成b.用酶水解形成的复合物，优选地在水解蛋白质-多糖复合物中达到至50%，更优选地2%至25%，甚至更优选地3.5%至20%的蛋白质水解程度，以获得所述水解的蛋白质-多糖复合物。附图本发明进一步通过附图进行说明，其中-图1显示通过A)Enzeco真菌蛋白酶浓缩物；B)酸性蛋白酶II；OEnzeco菠萝蛋白酶浓缩物在PH4.2的WPI(BiPRO)/阿拉伯树胶水解复合物或者WPI水解产物在C18柱上的RP-HPLC谱。在所有样品中，酶在RP-HPLC分析和去复合(de-complexation)前都进行了热失活。-图2显示(a，b)不用酶；或者用(c，d)Enzeco真菌蛋白酶；(e，f)Enzeco菠萝蛋白酶；和(g，h)酸性蛋白酶II水解()()·；()0.5Wt%或(__)LOwt^WPI或者WPI/阿拉伯树胶复合物制备的乳剂随时间测量的膏化层的高度(％)。-图3是概括通过OPA方法测量的在pH4.2获得的WPI和WPI/阿拉伯树胶复合物水解O小时)的DH值的表。发明详述本发明涉及水解的蛋白质-多糖复合物。在本发明的上下文中，术语“水解的蛋白质-多糖复合物”描述了蛋白质和多糖之间的复合物，其在完整蛋白质和多糖之间复合物形成后已经进行了水解。术语“复合物”意为蛋白质和多糖之间的任一形式的结合。此种结合可以包括疏水相互作用、范德华相互作用、静电相互作用、氢键结合、共价相互作用或者偶极-偶极诱导的相互作用。本发明的复合物优选地是静电结合的复合物。因此，蛋白质优选地具有与多糖的总静电荷相反的总静电荷。然而，本申请也涵盖了通过蛋白质电荷修补(chargepatch)，即在蛋白质和多糖具有相似的静电荷的情况下形成的静电复合物。在本发明的上下文中，术语“水解”指在与多糖结合的情况下，蛋白质的水解。水解优选地使用酶实施。选择酶以使其可以在蛋白质-多糖复合物中的蛋白质上作用。此种酶可以选自内切蛋白酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶，来自猪胰脏、牛胰脏、猪胃粘膜(porcinestomachmucosa)、猪胃粘膜(porcinegastricmucosa)、猪胃内层、枯草芽抱杆茵(Bacillussubtilis)、芽抱杆菌属(Bacillusspp.)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、酱油曲霉(Aspergillussojae)、曲霉属(Aspergillusspp.)、雪白*艮霉(Rhizopusniveus)、番木瓜、菠萝、凤梨科(Bromeliceae)、无花果属物种的内切蛋白酶，来自米曲霉、酱油曲霉、曲霉属、番木瓜的外切蛋白酶。优选地，该酶是内切蛋白酶。可以在本发明中使用的酶是从Novozymes例如在Alcalase,Neutrase,Protamex,Flavourzyme商标下购买的。用酶水解蛋白质-多糖复合物中蛋白质的程度已经显示出要比当蛋白质游离的时候用相同的酶水解的程度低(参见图幻。预计这种结果是因为多糖的存在稍微妨碍了蛋白质上剪切位点的接近。然而，在蛋白质-多糖复合物中得到的较低程度的水解对复合物作为稳定剂的性能没有影响。事实上，已经发现，为了实现本发明的有利作用，至50%，优选地2%至25%，更优选地3.5%至20%的水解程度是合适的。在水解之前的蛋白质-多糖复合物的蛋白质优选地选自乳蛋白质、大豆蛋白质、卵蛋白质、肉蛋白质、鱼蛋白质或者植物蛋白质的一种或多种。优选地，它是乳蛋白质例如乳清蛋白或者酪蛋白，更优选地牛乳蛋白质。甚至更优选地，它是牛乳清蛋白。本发明中使用的多糖可以是能与蛋白质分子间结合的任一多糖。因此，优选地是阴离子或者阳离子多糖。本发明的多糖可以选自树胶、水胶体、微生物胞外多糖或者真菌胞外多糖。优选地选自阿拉伯树胶、果胶、角叉菜胶、哺乳动物明胶例如猪明胶、鱼明胶、阿拉伯半乳聚糖、黑麦阿拉伯木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、藻酸盐、丙二醇藻酸酯、羧甲基纤维素、脱壳聚糖、黄原胶、琼脂、来自乳酸茵的胞外多糖的一种或者多种。最优选地，多糖选自阿拉伯树胶和/或壳聚糖。在本发明的复合物中，蛋白质的水解程度可以在1%至50%之间变化。优选地，其为2%至25%，更优选地为3.5%至20%。从复合物中的蛋白质水解得到的肽谱可以通过将蛋白质部分从多糖中去复合来测定。“去复合”意为蛋白质-多糖复合物的解离。去复合可以通过例如PH改变和多糖在乙腈中沉淀来实现。基于去复合，蛋白质谱可以例如通过C18RP-HPLC分析。这是本领域已知的用于肽谱表征的方法。发现该蛋白质谱与用相同的酶但是不存在与多糖形成复合物的情况下水解的蛋白质的蛋白质谱不同。这图解于图1(A、B和C)中，其显示与以前并没有与多糖结合的蛋白质比较，在以复合物形式与多糖结合的蛋白质中的相同位点没有发生用三种不同的酶对蛋白质的水解。因此，可以发现，通过水解蛋白质-多糖复合物水解得到的复合物与由水解的蛋白质和多糖结合形成的复合物比较，结构是不同的。此外，显示本发明的复合物与非水解的复合物、仅非水解的蛋白质或者水解的蛋白质比较，提供了随时间增强的乳化稳定性。这图解于图2中，其显示了已经通过真菌蛋白酶、菠萝蛋白酶或者酸性蛋白酶水解的复合物随时间的最佳膏化稳定性。通过用酸性蛋白酶水解复合物得到的水解的蛋白质-多糖复合物显示出在膏化稳定性方面特别好的结果。在图解于图2的实例中，真菌蛋白酶和菠萝蛋白酶是EnzymeDevelopment公司市售的。它们包含分别来自米曲霉的内切蛋白酶和来自凤梨科的内切蛋白酶。酸性蛋白酶II是从Amano购买的，并包含来自雪白根霉的内切蛋白酶。因此，本发明的复合物可以用作为食品、美容产品或者药物产品中的乳化剂和/或稳定剂。包含本发明复合物的食物产品优选地选自甜品、冷冻甜品、乳制品、宠物食品、烹饪制品、临床营养制品等。具体而言，它们可以包括调味汁、汤类、蛋黄酱、沙拉酱、奶油、冰淇淋、巧克力、奶油冻、奶等。本发明的复合物可以用于美容产品例如乳膏、泡沫剂、摩丝、凝胶剂、洗发剂、乳剂等。可以添加本发明复合物的药物产品包括片剂、胶囊剂、糖浆剂等。当用作为乳剂和/或稳定剂时，该复合物优选地以所述产品的0.Olwt%至IOwt%，优选地0.Iwt%，最优选地0.Iwt%-0.5wt%的量存在于所述产品中。实际上已经发现，乳化特性和稳定特性在低浓度下是最佳的。因此，本发明的产品提供了它们是高度有效的乳化剂和/或稳定剂的优点。本发明进一步涉及生产这些水解的蛋白质-多糖复合物的方法。方法中的第一步包括混合蛋白质溶液和多糖以诱导复合物的形成。在本发明方法中使用的蛋白质在与多糖混合前，优选地还没有进行任何水解步骤。蛋白质可以选自乳蛋白质、大豆蛋白质、卵蛋白质、肉蛋白质、鱼蛋白质或者植物蛋白质的一种或多种。优选地，它是乳蛋白质例如乳清蛋白或者酪蛋白，更优选地牛乳蛋白质。甚至更优选地，它是牛乳清蛋白。在本发明中使用的多糖可以是能与蛋白质分子间结合的任一多糖。因此，它优选地是阴离子或者阳离子多糖。本发明的多糖可以选自树胶、水胶体、微生物或真菌外泌多糖。它优选地选自阿拉伯树胶、果胶、角叉菜胶、哺乳动物明胶例如猪明胶、鱼明胶、阿拉伯半乳聚糖、黑麦阿拉伯木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、藻酸盐、丙二醇藻酸酯、羧甲基纤维素、壳聚糖、黄原胶、琼脂、来自乳酸菌的外泌多糖的一种或者多种。多糖最优选地选自阿拉伯树胶和/或壳聚糖。用于诱导复合物形成的条件，特别是用于诱导静电结合的复合物形成的条件取决于所使用的蛋白质和多糖的来源。蛋白质和多糖可以以201至120的蛋白质多糖重量比混合。优选地，蛋白质和多糖以51至15，更优选地21至12的蛋白质多糖重量比混合。最优选地，蛋白质和多糖以21的蛋白质多糖重量比混合。溶液中多糖的量优选地为0.至10%，更优选地为0.4%至5%。在本发明中，已经发现，可以调整溶液的pH以诱导蛋白质与多糖的静电结合。含有蛋白质和多糖的溶液的PH可以从3.0至8.0，优选地从3.0至7.0变化。在一个优选的实施方案中，PH可以从3.0至5.0变化。在另一个实施方案中，pH可以从6.0至7.0变化。例如，当乳清蛋白与阴离子多糖例如阿拉伯树胶混合时，优选的pH是在3.0至5.0之间，更优选地是大约4.2。当乳清蛋白与阳离子多糖例如壳聚糖混合时，优选的pH是在6.0至7.0之间，更优选地是大约6.5。可以通过使用常规的酸例如盐酸、磷酸、柠檬酸、乙酸、甲酸或者碱例如氢氧化钠、氢氧化钾进行PH调整。混合溶液达到诱导蛋白质和多糖之间的复合物形成所需的时间量。该时间可以从1秒至30秒变化。复合物形成可以是瞬时的。复合物形成可以通过技术人员已知的方法例如浊度测量、光散射测量或者电导测量证实。然后将完整的蛋白质-多糖复合物例如用酶水解。选择酶以使其可以在蛋白质-多糖复合物中的蛋白质上作用。此种酶可以选自内切蛋白酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶，来自猪胰脏、来自牛胰脏、猪胃粘膜、牛胃粘膜、猪胃内层、枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌属、米曲霉、酱油曲霉、曲霉属、雪白根霉、番木瓜、菠萝、凤梨科、无花果属物种的内切蛋白酶，来自米曲霉、酱油曲霉、曲霉属、番木瓜的外切蛋白酶。优选地，该酶是内切蛋白酶。可以在本发明中使用的酶是从Novozymes例如在Alcalase,Neutrase,Protamex,Flavourzyme商标下购买的。在溶液中，蛋白质与酶比率是15至11000，优选地110至1100，更优选地150。水解可以在30°C至70°C的温度下进行。最佳的温度取决于酶的选择。优选地，进行水解作用的温度是40V至50°C之间。水解可以进行10分钟至3小时，优选地大约2小时。蛋白质-多糖复合物优选地水解至1%至50%，更优选地2%至25%，甚至更优选地3.5%至20%的水解程度。水解程度通过本领域技术人员已知的OPA(邻苯二醛)方法测定用于随后的蛋白质水解。得到的水解蛋白质-多糖复合物在添加了它的组合物中作为乳化剂和/或稳定剂具有高度有效的优点。此外，它包含了仅天然成分以至于它比由化学修饰或者合成产物组成的常规乳化剂更有吸引力。同时，就可能含有它们的产品来说，本发明的复合物是多用途的。例如，通过调整蛋白质和多糖的选择，它们在宽PH范围起着乳化剂和/或稳定剂的作用。例如，它们可以在具有大约2.5的pH的酸性产品例如蛋黄酱中以及在具有6.5以上的PH产品例如乳中使用。水解后，失活酶是有利的。酶失活可以通过热处理、压力处理或者添加对酶特异的抑制物完成。优选地，通过热处理含有水解蛋白质-多糖复合物和酶的溶液来实施。热处理优选地在80°C至100°C的温度实施5-30分钟。此外，可以将水解后，并任选地酶失活后的溶液进行超滤。这具有将本发明的复合物与由于水解步骤产生的游离肽分离的优点。在一个优选的实施方案中，然后将溶液通过本领域已知的任一方法例如喷雾干燥、冷冻干燥或者真空干燥来进行干燥。因此，本发明的复合物可以为溶液、凝胶或者干粉的形式。在另外的实施方案中，水解蛋白质-多糖复合物可以在存在另外的成分的情况下干燥。备选地，干燥的水解蛋白质-多糖复合物可以与其他干燥成分混合。得到的产物可以是例如包含本发明复合物的奶粉或者脱水汤粉。本发明通过以下非限制性实施例进行进一步的说明。实施例^MMι-7k解的阿白积扑$-将乳清蛋白分离物(WPI-来自DaviscoFoodshternational的BiPro)与阿拉伯树胶(来自ColloidesNaturelsInternational的速溶树胶)按21的蛋白质与多糖重量比、2wt%的总WPI浓度(基于蛋白质)混合，并且将PH调整至4.2。然后将Enzeco菠萝蛋白酶酶浓缩物以150的蛋白质与酶的比率加入到溶液中。2小时后，水解度为3.7%，并热处理(90°C，15分钟)水解复合物以失活酶并且超滤以除去由蛋白酶产生的未结合的肽。将得到的水解蛋白质-多糖复合物冷冻干燥以产生粉末。^mm2-ykmm^mm-在本实施例中，分别将壳聚糖和乳清蛋白用作为多糖和蛋白质。壳聚糖252(去乙酰化度>90%,MahtaniChitosanPVT有限公司)获自FranceChitine0乳清蛋白分离物从DaviscoFoodsInternational以BiPro商标获得。在与蛋白质混合前将壳聚糖的水分散体在50°C调整至pH5.9。然后将蛋白质(在水溶液中)加入壳聚糖分散体中并用乙酸将PH调整至6.5。混合物中乳清蛋白质浓度为0.9wt%。混合物中壳聚糖浓度为0.45wt%。混合20分钟后，加入0.018wt%浓度的来自枯草芽孢杆茵(COrOlase7089)的真菌蛋白酶。将混合物在50°C搅拌下保持2小时以获得12%的水解程度。然后使用具有IOOkDa(0.09m2)的MWCO的Pr印/^caleSpiralWoundTFFIModulePZHK在50°C超滤混合物。入口压力设置为0.75巴(泵的第6速)。首先将混合物浓缩至2X，然后通过添加1直径体积(diavolume)(SOOmL)的去离子水开始渗滤。为了使渗余物中的酶变性，应用了90°C的热处理15分钟。然后将滞留物冷冻干燥以得到根据本发明的产物。实施例3检测在实施例1中获得的水解阿拉伯树胶-乳清蛋白复合物在3种不同浓度(0.Iwt%、0·5wt%禾口Iwt%)下的乳化能力。使用向日葵油(MeritSelection商标)制备乳剂。将IOg油加入到90g的去离子水中。然后加入0.lwt%,0.5wt%和在实施例1中获得的并在蒸馏水中重构的水解复合物。最后，加入0.02wt%NaN3作为防腐剂。在乳化前用Ultra-Turrax(Janke-Kunke1，GmBH)预先勻化混合物30秒。在室温，使用Emulsifiex_C5勻化器(Avestin公司，加拿大)以两种通道即400巴(6000psi)和80巴(IlOOpsi)实施乳化。结果显示于图2中。可以看到，与非水解复合物(图2a)比较或者与仅水解的乳清蛋白(图2c、e、g)比较，在观天存储期间，本发明复合物(图2d、f、h)的膏化稳定性，即乳剂对经历相分离的抗性更好。此外，结果显示，低至0.的本发明水解复合物的浓度在稳定乳剂时特别有效。权利要求1.水解的蛋白质-多糖复合物，其可以通过酶水解蛋白质-多糖复合物获得。2.根据权利要求1的复合物，其中所述蛋白质-多糖复合物是静电结合的复合物。3.根据权利要求1或者2的复合物，其中所述蛋白质选自乳蛋白质、大豆蛋白质、卵蛋白质、肉蛋白质、鱼蛋白质或者植物蛋白质的一种或多种，优选地选自乳蛋白质例如乳清蛋白或者酪蛋白，更优选地牛乳蛋白质，甚至更优选地牛乳清蛋白。4.根据前述权利要求任一项的复合物，其中所述多糖选自树胶、水胶体、微生物或者真菌外泌多糖的一种或多种，优选地选自阿拉伯树胶、果胶、角叉菜胶、哺乳动物明胶例如猪明胶、鱼明胶、阿拉伯半乳聚糖、黑麦阿拉伯木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、藻酸盐、丙二醇藻酸酯、羧甲基纤维素、壳聚糖、黄原胶、琼脂、来自乳酸菌的外泌多糖的一种或者多种，最优选地选自阿拉伯树胶和/或壳聚糖。5.根据前述权利要求任一项的复合物，其中水解的蛋白质-多糖复合物中蛋白质的水解程度是1%至50%，优选地2%至25%，更优选地3.5%至20%。6.根据权利要求1至5中任一项的复合物的用途，用作优选地选自甜品、冷冻甜品、乳制品、宠物食品、烹饪制品、临床营养制品的食物产品；优选地选自乳膏、泡沫剂、摩丝、凝胶剂、洗发剂、乳剂的美容产品；或者优选地选自片剂、胶囊剂、糖浆剂的药物产品中的乳化剂和/或稳定剂。7.根据权利要求6的用途，以所述产品的0.01衬％至10wt%，优选地0.1衬％至5wt%，更优选地0.Iwt%至0.5wt%的量。8.生产水解的蛋白质-多糖复合物的方法，所述方法包括a.将蛋白质溶液与多糖混合以诱导复合物的形成，b.用酶水解形成的复合物，优选地在水解蛋白质-多糖复合物中达到1%至50%，更优选地2%至25%，甚至更优选地3.5%至20%的蛋白质水解程度，以获得所述水解的蛋白质-多糖复合物。9.根据权利要求8的方法，其中所述混合在诱导蛋白质和多糖之间的静电复合物形成的PH下进行。10.根据权利要求8或者9的方法，其中所述溶液的PH是3.0至8.0，优选地3.0至7.0，更优选地3.0至5.0或者6.0至7.0。11.根据权利要求8至10的方法，其中蛋白质与多糖的重量比是201至120，优选地51至15，更优选地21至12，最优选地21。12.根据权利要求8至11中任一项的方法，其中所述酶选自内切蛋白酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶，来自猪胰脏、牛胰脏、猪胃粘膜、猪胃粘膜、猪胃内层、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、酱油曲霉(Aspergillussojae)、曲霉属(Aspergillusspp.)、雪白根霉(lihizopusniveus)、番木瓜、菠萝、凤梨科、无花果属物种的内切蛋白酶，来自米曲霉、酱油曲霉、曲霉属、番木瓜的外切蛋白酶，优选地内切蛋白酶。13.根据权利要求8至12任一项的方法，其中所述酶在水解步骤后被失活，优选地通过热处理、压力处理或者添加酶特异的抑制物，更优选地通过在80°C至100°C的温度下热处理5-30分钟进行失活。14.根据权利要求8至13任一项的方法，其中所述水解步骤之后是所获得的混合物的超滤。15.根据权利要求8至14任一项的方法，其中所述水解步骤之后是干燥步骤。全文摘要本发明涉及水解的蛋白质-多糖复合物，并更具体地涉及通过蛋白质和多糖之间的复合物形成然后通过水解获得的那些水解的蛋白质-多糖复合物。得到的复合物具有良好的乳化和稳定化特性，并可以用于食品、美容产品或者药物产品。本发明进一步涉及生产此类复合物的方法。文档编号B01F17/00GK102227170SQ200980147598公开日2011年10月26日申请日期2009年11月30日优先权日2008年12月4日发明者C·J·E·施密特,巴列斯特尔S·I·拉内维勒,S·特金,S·高蒂尔申请人:雀巢产品技术援助有限公司