基于焦磷酸测序技术的p15INK4b启动子区甲基化程度定量检测的方法与流程

本发明属于生命科学与生物
技术领域：
，具体涉及一种抑癌基因即p15ink4b基因启动子特异性位点甲基化程度的定量检测。
背景技术：
：p15ink4b基因是一种重要的抑癌基因，其编码的蛋白是cdks(cyclinedependentkinase细胞周期依赖性激酶)家族中的重要成员，可以特异性抑制cdk4、cdk6激酶活性，阻止rb(retinoblastoma视网膜母细胞癌基因)的产物rb蛋白磷酸化。在细胞增殖过程中，磷酸化的rb会释放转录因子e2f从而启动dna聚合酶、腺苷激酶等细胞增殖基因的转录并最终导致细胞进入s期。由于p15ink4b基因转录的蛋白抑制rb磷酸化，转录因子无法释放并发挥作用，所以p15ink4b基因对细胞的生长增殖起到了负调控的作用。p15ink4b基因的失活会导致细胞的异常增殖，促进肿瘤的发生。研究显示，在肿瘤细胞中，约有80％的p15ink4b基因处于失活状态。p15ink4b基因编码序列全长约460kb，定位于9号染色体短臂上(9p21)，该基因含有两个外显子，基因启动子处(chr9:22008659-22009472)存在一个cpg岛(cpg91)。在正常细胞中，这一位于p15ink4b基因启动子处的cpg岛是不存在甲基化的，而在肿瘤细胞中，往往发现这一cpg岛处于高度甲基化状态，从而引起了p15ink4b基因的表达沉默。dna甲基化是一种重要的表观遗传学修饰，它的发生通常是由dna甲基转移酶的催化，s-腺苷蛋氨酸提供甲基基团，将dna中的胞嘧啶催化为5-甲基胞嘧啶(5-mc)。dna甲基化通常发生在cpg二核苷酸上。在基因组中，cpg倾向于成蔟存在，而这些富含cpg的位置即被称为cpg岛。启动子区域的cpg岛的甲基化程度与基因表达的活跃程度密切相关，这是由于甲基化的cpg岛会招募mecp2等甲基化结合蛋白，进而形成基因沉默复合物，占据在基因的启动子位置，阻止转录因子与之结合。目前，基因启动子区域的cpg岛甲基化已经被定义为除纯合子缺失和基因突变之外的第三种抑癌基因表达失活的机制。研究发现，肿瘤细胞中p15ink4b基因的失活主要由于其启动子区cpg岛处于高甲基化状态，这也使得p15ink4b基因启动子的甲基化程度可以为医生进行肿瘤的早期诊断和筛查提供指导。目前基因甲基化的检测手段主要有msp(甲基化特异性pcr)、medip(甲基化特异性免疫共沉淀)以及亚硫酸氢盐测序pcr(bsp)，其中msp方法因其操作相对简单对仪器条件要求较少而得到了最普遍的应用，但改方法仅可对甲基化程度进行定性的检测。而但另外两种方法不仅操作难度较大且均只能对特定位点的甲基化程度进行半定量分析。本发明采取的是焦磷酸测序的方法对p15ink4b基因启动子处cpg岛的甲基化程度进行分析，该方法可以准确定量的检测到目的片段中每一cpg位点的甲基化程度。目前，焦磷酸测序已被认为是甲基化检测的金标准。焦磷酸测序的核心原理是通过单一核苷酸与模板链结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应进而促使荧光素发光，机器通过捕捉荧光信号来判断模板链上的这一位置是哪一种核苷酸。而信号的强弱也直接对应了该位点的甲基化状态。这一方法准确高效，且适用于多样本的同时检测，是检测患者基因组中p15ink4b基因甲基化程度的理想手段。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测p15ink4b基因启动子cpg甲基化程度的方法，包括上游特异性扩增引物，下游特异性扩增引物，其中下游特异性扩增引物的5’端具有生物素标记，以及测序引物，其碱基序列如下所示：f：ggggagttagtaggtaaagaatttr：acattcccaaaatattaaccttaacts：gtttttttatttttttaggt本发明提供了一整套检测p15ink4b基因启动子cpg甲基化程度的流程，包括如下步骤：(1)提取样品基因组dna；(2)对提纯得到的基因组dna进行亚硫酸盐处理；(3)利用所述特异性扩增引物对纯化回收亚硫酸盐处理得到的dna进行扩增，扩增的程序为：激活：95℃15min；扩增：94℃30s，56℃30s，72℃30s，共进行47个循环；终延伸：72℃10min。(4)取出5μl扩增产物进行琼脂糖电泳检测，根据产物条带是否肉眼可见并且是否位于200与300bp的标记条带之间来判断扩增是否成功，并根据100bp标记条带之下是否有条带来判断是否有引物二聚体；(5)对于扩增成功且无明显引物二聚体的样品，利用测序引物对剩余扩增产物进行焦磷酸测序；(6)根据软件分析获得p15ink4b基因cpg岛(cpg91)中所检测的cg位点的甲基化程度。本发明针对位于chr9:22008659-22009472位置的p15ink4b基因cpg岛(cpg91)中如附图1所示的目的片段设计了扩增引物，扩增片段长度为256bp，并设计了配套的焦磷酸检测引物。本发明设计了一款用于检测p15ink4b基因启动子甲基化程度的试剂盒，其中包括了热启动聚合酶(hotstarttaq)、dntps、pcr缓冲液(tris-hcl)、ddh2o、mgcl2以及检测p15ink4b基因启动子甲基化程度的扩增引物和检测引物。附图说明：图1为本次焦磷酸检测实验所检测的目的片段。图2为使用扩增引物对目的片段进行pcr扩增所得产物的凝胶电泳图。图3为使用焦磷酸测序仪时输入的待测序列信息。图4为焦磷酸测序的结果图。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明。实施中未做特殊说明的条件和方法，可按照所述领域实验人员的常规操作方法，或按照制造厂商建议的步骤和条件。实例1：检测病人血液中p15ink4b基因启动子cpg岛(cpg91)甲基化程度的引物和方法收集病人血液200μl，利用柱纯化法提取其中基因组dna，所用试剂盒为biomeddl101-01，提出的基因组dna通过分光光度计检测，其纯度od260/od280为1.7～1.9判定为合格。所提出的基因组dna经过重亚硫酸氢钠转化，所用基因组dna量为2μg。转化所得dna其中2μl作为模板，利用本发明所述的试剂盒进行pcr扩增，扩增体系如下表所示：hotstart12.5μlpcr缓冲液(tris-hcl)(100mm)7μldntps0.5μlprimerf1μlprimerr1μlddh2o1μltemplatedna2μltotalvolume25μl其中扩增引物的碱基序列如下：f：ggggagttagtaggtaaagaatttr：acattcccaaaatattaaccttaact其中下游特异性扩增引物5`端有生物素标记。扩增程序为激活：95℃15min；扩增：94℃30s，56℃30s，72℃30s，共进行47个循环；终延伸：72℃10min。取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，胶浓度为1.5％，电压为120v，时间为30min，琼脂糖凝胶在紫外照胶仪下检测，检测结果应如附图2所示条带清晰且位置正确，无明显引物二聚体。剩余扩增产物与焦磷酸测序引物混合，根据pyromarkq96操作手册进行焦磷酸测序。测序引物碱基序列如下：s：gtttttttatttttttaggt如附图3所示，在pyromarkq96对应软件中输入待测序列为：如附图4所示，测序过程结束后，机器产生检测报告，对待测位点的甲基化程度进行数据收集和分析。实例2：检测细胞中p15ink4b基因启动子cpg岛(cpg91)甲基化程度的引物和方法以25cm2培养瓶培养a549细胞为例，待细胞长至90％以上时倒掉培养基，用2mlpbs洗去剩余培养基，加1ml胰酶消化，37℃，4min。加1ml培养基中和消化过程并将细胞从培养瓶上吹打至液体中，1000g离心5min收集细胞沉淀。所得细胞沉淀根据tianampgenomicdnakit(tiangen)说明书操作，提取出基因组dna通过分光光度计检测，其纯度od260/od280为1.7～1.9判定为合格。其余步骤同实例1。当前第1页12