一种含K85突变的植物EPSPS突变体及其编码基因和应用的制作方法

文档序号：16591329发布日期：2019-01-14 19:08阅读：320来源：国知局

本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种含k85突变的植物epsps突变体及其编码基因和应用。

背景技术：

草甘膦是目前世界上使用的最为广泛的除草剂之一，至今已使用了近四十年。草甘膦抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)的活性。epsps在莽草酸途径中催化pep和shikimate-3-phosphate合成epsp，最终合成芳香族氨基酸色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。草甘膦导致芳香族胺基酸合成受阻，进而影响植物正常生长，终致死亡。

目前培育抗草甘膦品种的主要方法是应用基因工程手段将来自细菌的抗草甘膦基因导入农作物中，从而培育出转基因抗草甘膦作物新品种。1996年开始推广以来，种植面积迅速增加，至2015年，全球抗草甘膦转基因作物种植面积已达1.5亿公顷，占转基因作物种植总面积的83％，给农业生产和环境带来了巨大利益。

但是，目前农业上应用最广的抗草甘膦基因是来源于农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)cp4菌株的cp4epsps。虽然先后从微生物中发现了许多能抗草甘膦的epsps基因，但这些基因在农作物中尚未得到广泛应用。这些微生物抗草甘膦基因在农作物中的应用是将这些基因如cp4epsps，用转基因的方法在农作物中表达。由此而产生的转基因作物虽然有相当大的推广面积，但由于反转基因浪潮，转基因作物在全世界的接受程度任然较低，即使在转基因作物种植面积最大的美洲，转基因也主要局限于玉米、大豆、棉花等几个作物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种植物epsps突变体(即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶突变体)，其来自于植物，经突变后，具有了草甘膦抗性。

本发明的另一目的在于提供一种编码基因，其可编码上述的植物epsps突变体。

本发明的另一目的在于提供含有上述的编码基因的载体。

本发明的另一目的在于提供含有上述载体的细胞。

本发明的另一目的在于提供上述植物epsps突变体的应用。

本发明是这样实现的：

一种植物epsps突变体，其与大肠杆菌epsps相比，所述植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps的第85位的位点具有突变。

一种编码基因，其编码上述植物epsps突变体。

含有上述编码基因的载体。

含有上述载体的重组细胞。

上述植物epsps突变体在培育抗草甘膦植物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的植物epsps突变体，其与大肠杆菌epsps相比，该植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps的第85位的位点具有突变例如突变为t或i。该突变位点对应为水稻epsps的第100位、玉米epsps的第94位和大豆epsps的第98位的氨基酸残基。该位点突变明显提高了多种植物的epsps的不同突变体对草甘膦的抗性，同时保持了自身的生物酶催化活性。转化本发明提供的植物epsps突变体的植株或重组菌均能够在草甘膦存在的条件下正常生长，该植物epsps突变体不仅转基因作物培育外，也可应用于培育抗草甘膦非转基因植物例如水稻、烟草、大豆、玉米、小麦、棉花和高粱等，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例5中的转化实施例1和实施例2提供的水稻epsps突变体编码基因的大肠杆菌在含不同草甘膦浓度的培养基上的生长结果图；

图2为本发明实施例6中的转化实施例3提供的玉米epsps突变体编码基因的大肠杆菌在含不同草甘膦浓度的培养基上的生长结果图；

图3为本发明实施例7中的转化实施例4提供的大豆epsps突变体编码基因的大肠杆菌在含不同草甘膦浓度的培养基上的生长结果图；

图4为本发明实施例5中的padv5载体的结构示意图；

图5为本发明实施例2中的大肠杆菌epsps、水稻epsps突变体ii以及野生型水稻epsps三者的氨基酸序列比对的部分结果；

图6为本发明实施例3中的大肠杆菌epsps、玉米epsps突变体以及野生型玉米epsps三者的氨基酸序列比对的部分结果；

图7为本发明实施例4中的大肠杆菌epsps、大豆epsps突变体以及野生型大豆epsps三者的氨基酸序列比对的部分结果。

图8为本发明实验例8提供的pgvp1-epsps载体的结构示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明提供的一种含k85t和k85i突变的植物epsps突变体及其编码基因和应用进行具体说明。

一方面，本发明提供了一种植物epsps突变体(即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的突变体)，其与大肠杆菌epsps相比，所述植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps的第85位的位点具有突变。该位点的突变可以明显提高植物epsps突变体的草甘膦抗性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中所述植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps的第85位的位点k突变为t或者i；即k>t或者k>i。

或者可理解为：将植物epsps突变体的氨基酸序列与大肠杆菌epsps的氨基酸序列进行比对，植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps的第85位的位置的氨基酸残基由k突变为t(简写为k85t)，或者是有k突变为i(简写为k85i)。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，大肠杆菌epsps的氨基酸序列如seqidno:25所示。

也就是说，将植物epsps突变体的氨基酸序列与如seqidno:25所示的大肠杆菌epsps的氨基酸序列进行比对，植物epsps突变体的氨基酸序列对应于seqidno:25所示的第85位的位置的氨基酸残基由k突变为t，或者是有k突变为i。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps还具有以下突变中的一种或多种的组合：g96a、p101s以及k194r。

突变g96a可理解为：将植物epsps突变体的氨基酸序列与大肠杆菌epsps的氨基酸序列进行比对，植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps的第96位的位置的氨基酸残基由g突变为a；

突变p101s可理解为：将植物epsps突变体的氨基酸序列与大肠杆菌epsps的氨基酸序列进行比对，植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps的第101位的位置的氨基酸残基由p突变为s。

突变k194r可理解为：将植物epsps突变体的氨基酸序列与大肠杆菌epsps的氨基酸序列进行比对，植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps的第194位的位置的氨基酸残基由k突变为r。

g96a、p101s以及k194r中的一种或几种突变的组合与第85位的突变结合例如k85t或k85i突变的结合，可以加强植物epsps突变体的草甘膦抗性，且可保持植物epsps突变体的生物酶活性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述植物epsps突变体来自于包括但不限于以下植物：小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、甘薯、马铃薯、棉花、大豆、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、花椰菜、芥蓝、黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜、甜瓜、番茄、茄子、辣椒、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甜菜、甘蔗、烟草、苜蓿、牧草、草坪草、茶和木薯。

也就是说，本发明提供的植物epsps突变体由来自于水稻、烟草、大豆、玉米、小麦、棉花、油菜和高粱等植物的野生型epsps经上述突变后得到，其保留了植物来源特性。可将编码该植物epsps突变体的编码基因应用于培育抗草甘膦的农作物品种，例如可采用转基因或基因修饰的方法实现培育目的。现对于现有的转化来自微生物的抗草甘膦的基因的方式，直接用植物来源的抗草甘膦基因转化或以此为模板进行编辑基因组，具有更可靠的生物安全性，有利于抗草甘膦新品种的推广和应用，提高公众接受程度。

优选地，在本发明的一些实施方案中，所述植物epsps突变体来自水稻(oryzasativa)，所述植物epsps突变体的氨基酸序列如seqidno:4所示。seqidno:4所示的植物epsps突变体，为水稻epsps突变体i。相对于seqidno:2所示的野生型水稻epsps的氨基酸序列而言，该水稻epsps突变体i具有k100(85)i一个突变。

k100(85)i突变可理解为：相对于野生型水稻epsps而言，该水稻epsps突变体于seqidno:2中的第100位氨基酸残基由k突变为i，该位点对应于大肠杆菌epsps的第85位。

优选地，在本发明的一些实施方案中，所述植物epsps突变体来自水稻，所述植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps具有以下突变：k85i、g96a和p101s。

进一步优选地，在本发明的一些实施方案中，所述植物epsps突变体的氨基酸序列如seqidno:8所示。

seqidno:8所示的植物epsps突变体，为水稻epsps突变体ii。相对于seqidno:2所示的野生型水稻epsps的氨基酸序列而言，该水稻epsps突变体ii具有k100(85)i、g111(96)a和p116(101)s三个突变。

g111(96)a突变可理解为：相对于野生型水稻epsps而言，水稻epsps突变体ii于seqidno:2中的第111位氨基酸残基由g突变为a，该位点对应于大肠杆菌epsps的第96位；

p116(101)s突变可理解为：相对于野生型水稻epsps而言，水稻epsps突变体ii于seqidno:2中的第116位氨基酸残基由p突变为s，该位点对应于大肠杆菌epsps的第101位。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述植物epsps突变体来自玉米(zeamays)，所述植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps具有以下突变：k85i、g96a、p101s以及k194r。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述植物epsps突变体的氨基酸序列如seqidno:16所示。

seqidno:16所示的植物epsps突变体，为玉米epsps突变体。相对于seqidno:10所示的野生型玉米epsps的氨基酸序列而言，该玉米epsps突变体具有k94(85)i、g105(96)a、p110(101)s以及k207(194)r四个突变。

k94(85)i突变可理解为：相对于野生型玉米epsps而言，玉米epsps突变体于seqidno:10中的第94位氨基酸残基由k突变为i，该位点在对应于大肠杆菌epsps的第85位；

g105(96)a突变可理解为：相对于野生型玉米epsps而言，玉米epsps突变体于seqidno:10中的第105位氨基酸残基由g突变为a，该位点对应于大肠杆菌epsps的第96位；

p110(101)s突变可理解为：相对于野生型玉米epsps而言，玉米epsps突变体于seqidno:10中的第110位氨基酸残基由p突变为s，该位点对应于大肠杆菌epsps的第101位；

k207(194)r突变可理解为：相对于野生型玉米epsps而言，玉米epsps突变体于seqidno:10中的第207位氨基酸残基由k突变为r，该位点对应于大肠杆菌epsps的第194位。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述植物epsps突变体来自大豆(glycinemax(linn.)merr.)，所述植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps还具有以下突变：k85t和p101s。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述植物epsps突变体的氨基酸序列如seqidno:24所示。

seqidno:24所示的植物epsps突变体，为大豆epsps突变体。相对于seqidno:24所示的野生型大豆epsps的氨基酸序列而言，该小麦epsps突变体具有k98(85)t和p114(101)s两个突变。

k98(85)t突变可理解为：相对于野生型大豆epsps而言，大豆epsps突变体于seqidno:18中的第98位氨基酸残基由k突变为t，该位点对应于大肠杆菌epsps的第85位；

p114(101)s突变可理解为：相对于野生型大豆epsps而言，大豆epsps突变体于seqidno:18中的第114位氨基酸残基由p突变为s，该位点对应于大肠杆菌epsps的第101位。

另一方面，本发明提供了一种编码基因，其编码上述的植物epsps突变体。

根据密码子的简并性，在上述植物epsps突变体的氨基酸序列基础上能够很容易地得到该epsps突变体的核苷酸编码序列。只要是能够编码出上述植物epsps突变体的编码基因即属于本发明的保护范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述编码基因如seqidno:3、7、15或23所示。

seqidno:3所示的为水稻epsps突变体i编码基因，编码seqidno:4所示的水稻epsps突变体i。

seqidno:7所示的序列为水稻epsps突变体ii编码基因，编码seqidno:8所示的水稻epsps突变体ii；

seqidno:15所示的序列为玉米epsps突变体编码基因，编码seqidno:16所示的玉米epsps突变体；

玉米epsps突变体玉米epsps突变体seqidno:23所示的序列为大豆epsps突变体编码基因，编码seqidno:24所示的大豆epsps突变体。

本领域技术人员，根据密码子的简并性，容易在上述编码基因的序列基础进行一个或多个核苷酸的替换，得到相应的衍生序列，以使编码出本发明提供的植物epsps突变体。因此，在上述编码基因的序列基础进行一个或多个核苷酸的替换，得到相应的编码出本发明提供的植物epsps突变体的衍生序列也属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供了含有上述编码基因的载体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，进一步地，在本发明的一些实施方案中，表达载体可以是原核表达载体例如padv5载体，也可以是真核表达载体。进一步地，在本发明的一些实施方案中，真核表达载体是植物表达载体例如pbi121载体。

容易理解，本领域技术人员根据需要，可以选择合适的载体，作为运载上述编码基因的工具，其均属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供了含有上述载体的重组菌或重组细胞。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，重组菌可以是球菌、杆菌例如大肠杆菌或者是螺旋菌；也可以是自氧菌或者是异氧菌。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，重组细胞可以原核细胞也可以是真核细胞；进一步地，在本发明的一些实施方案中，真核细胞可以是动物细胞，也可以是植物细胞；进一步地，在本发明的一些实施方案中，植物细胞可以是双子叶植物细胞，也可以是单子叶植物细胞。

容易理解，本领域技术人员根据需要，可以选择合适的细菌或细胞，作为上述编码基因的宿主，其均属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供了上述植物epsps突变体在培育抗草甘膦植物中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述应用包括：将载体转化目的植物，所述载体含有编码所述植物epsps突变体的编码基因。

例如，将含有seqidno:7所示的水稻epsps编码基因的载体转化例如水稻愈伤组织，培养使其分化形成完整水稻植株，即可培育出转基因抗草甘膦水稻。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述应用包括：修饰目的植物的内源epsps基因，使其编码所述植物epsps突变体。

例如，以seqidno:7所示的水稻epsps编码基因的部分或全部为模板，对水稻基因组的内源epsps基因进行修饰，进而可培育出非转基因水稻。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述应用包括：诱变植物细胞、组织、个体或群体，使其编码所述植物epsps突变体。

例如，以seqidno:7所示的为水稻epsps编码基因为指导，对水稻材料进行诱变，如化学、辐射诱变等，进而可培育出内源epsps基因突变的水稻。例如还可以通过crispr/cas9技术将内源epsps基因的编码序列修饰为该编码基因的碱基序列(seqidno:7)，在目的植物中编码出与本发明提供的水稻epsps突变体(seqidno:8)一样的蛋白，使得目的植物具有草甘膦抗性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，目的植物为水稻、烟草、大豆、玉米、小麦、棉花、油菜和高粱等植物中的任意一种。

容易理解，本领域技术人员根据需要，可以选择需要培育的农作物品种，只要是应用了本发明提供的植物epsps突变体和/或其编码基因即属于本发明的保护范围。

需要说明的是，本发明所涉及的蛋白序列比对所使用的比对方式为clustal在线比对，其网站地址为：http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/。采用其他的序列比对工具(例如dnaman，相关参数设置按默认设置)所得到结果与clustal在线比对得到的结果基本一致。

综上，本发明提供的植物epsps突变体，其与大肠杆菌epsps相比，该植物epsps突变体的氨基酸序列对应于大肠杆菌epsps的第85位具有突变例如k>t或k>i。该突变位点的位置对应于野生型水稻epsps(seqidno:2)的第100位；对应于野生型玉米epsps(seqidno:10)的第94位；对应于野生型大豆epsps(seqidno:18)的第98位。该位点突变可明显提高多种植物的epsps的不同突变体对草甘膦的抗性，同时保持突变体自身的生物酶催化活性。转化该植物epsps突变体的植株或重组菌均能够正常生长，该植物epsps突变体不仅转基因作物培育外，也可应用于培育抗草甘膦非转基因植物例如水稻、烟草、大豆、玉米、小麦、棉花和高粱等，具有广阔的应用前景。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种植物epsps突变体，其来源于水稻，为水稻epsps突变体i，其由野生型水稻epsps(氨基酸序列如seqidno:2所示)经突变后得到，其氨基酸序列如seqidno:4所示。

相对于seqidno:2所示的野生型水稻epsps的氨基酸序列而言，本实施例提供的水稻epsps突变体i具有k100(85)i一个突变。

即，相对于野生型水稻epsps而言，水稻epsps突变体i的第100位氨基酸残基由g突变为a，该位点对应于大肠杆菌epsps的第85位。

本实施例还提供了编码上述水稻epsps突变体i的水稻epsps突变体i编码基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。

本发明实施例提供的水稻epsps突变体i编码基因和水稻epsps突变体i均可通过化学合成的方法获得。

实施例2

本实施例提供一种植物epsps突变体，其来源于水稻，为水稻epsps突变体ii，其由野生型水稻epsps(氨基酸序列如seqidno:2所示)经突变后得到，其氨基酸序列如seqidno:8所示。

相对于seqidno:2所示的野生型水稻epsps的氨基酸序列而言，该水稻epsps突变体ii具有k100(85)i、g111(96)a和p116(101)s三个突变。

即，如图5所示(图5显示了大肠杆菌epsps、水稻epsps突变体ii以及野生型水稻epsps三者的氨基酸序列比对的部分结果，图中：ec-epspswt代表大肠杆菌epsps；os-epspsm代表水稻epsps突变体ii；os-epspswt代表野生型水稻epsps)，相对于野生型水稻epsps而言，水稻epsps突变体ii的第100位氨基酸残基由k突变为i，该位点对应于大肠杆菌epsps(seqidno:25)的第85位；第111位氨基酸残基由g突变为a，该位点对应于大肠杆菌epsps的第96位；第116位氨基酸残基由p突变为s，该位点对应于大肠杆菌epsps的第101位(如图5中箭头所指位点)。

本实施例还提供编码上述水稻epsps突变体ii的水稻epsps突变体ii编码基因，其核苷酸序列如seqidno:7所示。

本发明实施例提供的水稻epsps突变体ii编码基因和水稻epsps突变体ii均可通过化学合成的方法获得。

实施例3

本实施例提供一种植物epsps突变体，其来源于玉米，为玉米epsps突变体，其由野生型玉米epsps(氨基酸序列如seqidno:10所示)经突变后得到，其氨基酸序列如seqidno:16所示。

相对于seqidno:10所示的野生型玉米epsps的氨基酸序列而言，本实施例提供的玉米epsps突变体具有k94(85)i、g105(96)a、p110(101)s以及k207(194)r四个突变。

即，如图6所示(图6显示了大肠杆菌epsps、玉米epsps突变体以及野生型玉米epsps三者的氨基酸序列比对的部分结果，图中：ec-epspswt代表大肠杆菌epsps；zm-epspsm代表玉米epsps突变体；zm-epspswt代表野生型玉米epsps)，相对于野生型玉米epsps而言，玉米epsps突变体第94位氨基酸残基由k突变为i，该位点对应于大肠杆菌epsps的第85位；第105位氨基酸残基由g突变为a，该位点对应于大肠杆菌epsps的第96位；第110位氨基酸残基由p突变为s，该位点对应于大肠杆菌epsps的第101位；第207位氨基酸残基由k突变为r，该位点对应于大肠杆菌epsps的第194位(如图6中箭头所指位点)。

本发明实施例还提供了编码上述玉米epsps突变体的玉米epsps突变体编码基因，其核苷酸序列如seqidno:15所示。

本发明实施例提供的玉米epsps突变体编码基因和玉米epsps突变体均可通过化学合成的方法获得。

实施例4

本实施例提供一种植物epsps突变体，其来源于大豆，为大豆epsps突变体，其由野生型大豆epsps(氨基酸序列如seqidno:18所示)经突变后得到，其氨基酸序列如seqidno:24所示。

相对于seqidno:18所示的野生型大豆epsps的氨基酸序列而言，该大豆epsps突变体具有k98(85)t和p114(101)s两个突变。

即，如图7所示(图7显示了大肠杆菌epsps、大豆epsps突变体以及野生型大豆epsps三者的氨基酸序列比对的部分结果，图中：ec-epspswt代表大肠杆菌epsps；gm-epspsm代表大豆epsps突变体；gm-epspswt代表野生型大豆epsps)，相对于野生型大豆epsps而言，大豆epsps突变体第98位氨基酸残基由k突变为t，该位点对应于大肠杆菌epsps(seqidno:25)的第85位；第114位氨基酸残基由p突变为s，该位点对应于大肠杆菌epsps的第101位(如图7中箭头所指位点)。

本发明实施例还提供了编码上述大豆epsps突变体的大豆epsps突变体编码基因，其核苷酸序列如seqidno:23所示。

本发明实施例提供的大豆epsps突变体编码基因和大豆epsps突变体均可通过化学合成的方法获得。

实施例5

以转化实施例1提供的水稻epsps突变体i编码基因(seqidno:3)的大肠杆菌为实验组1(仅具有k100(85)i突变)；

以转化不具有k100(85)i突变仅具有g111(96)a和p116(101)s突变的水稻epsps突变体的编码基因(核苷酸序列如seqidno:5所示，编码的水稻epsps突变体的氨基酸序列如seqidno:6所示)的大肠杆菌为实验组2；

以转化实施例2提供的水稻epsps突变体ii编码基因(seqidno:7)的大肠杆菌为实验组3(编码的的水稻epsps突变体ii具有k100(85)i、g111(96)a和p116(101)s三个突变)；

以转化野生型水稻epsps编码基因(seqidno:1，其编码seqidno:2所示的野生型水稻epsps)的大肠杆菌为对照组。

通过检测被转化的大肠杆菌在含不同草甘膦浓度(0mm、1mm、10mm、50mm)的培养基(以m9为基础培养基，再添加一定浓度的抗生素spec(spectinomycin、奇放线菌素)、gen(gentamycin、庆大霉素)、amp(ampicillin、氨苄青霉素)以及不同浓度的草甘膦得到的培养基)上的生长情况，验证水稻epsps突变体i编码基因及其编码的水稻epsps突变体i在大肠杆菌中的抗草甘膦能力，以及水稻epsps突变体ii编码基因及其编码的水稻epsps突变体ii在大肠杆菌中的抗草甘膦能力。

其中，m9基础培养基可参考如下方法配制：

5×m9盐溶液：称取6.78gna2hpo4，3.0gkh2po4，0.5gnacl，1.0gnh4cl，加ddh2o至200ml，高温高压灭菌处理；

20％葡萄糖：称取葡糖糖20g，加80mlddh2o溶解，定容至100ml，过滤灭菌处理；

1.0mmgso4：称取24.6gmgso4-7h2o，用80ml的ddh2o溶解，定容至100ml，灭菌处理；

1.0mcacl2：称取11.1gcacl2，用80ml的ddh2o溶解，定容至100ml，灭菌处理；

用200ml5×m9盐溶液，20ml20％葡萄糖，2ml1.0mmgso4和0.1ml1.0mcacl2，加ddh2o补足至1000ml，即配制成1000mlm9基础培养基。

其中，所用大肠杆菌为双敲除的大肠杆菌即epsps缺陷型大肠杆菌(敲除epsps基因和c-plyase基因后的大肠杆菌dh5α，命名为edce，其制备方法可参考申请号为2016103256926的中国发明专利)。

检测方法为本领域公知的方法，简要描述为：采用化学合成的方法合成水稻epsps突变体编码基因，两端引入酶切位点(pac1和sbf1)，酶切后，在连接酶的作用下连接至经相同酶切处理后的表达载体(例如padv5载体，其结构如图4所示)上，然后转化双敲除的大肠杆菌，经验证后，挑取阳性克隆，接种至含草甘膦的培养基上生长，观察生长情况。

结果如图1所示(图中：r0为对照组，r1为实验组1，r2为实验组2，r3为实验组3)。

在含0mm草甘膦的培养基上，对照组和实验组1-3的epsps缺陷型大肠杆菌均能生长，表明实验组和对照组的epsps蛋白(seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8)都具有正常epsps酶活力；

在含1mm草甘膦的培养基上，对照组(r0)生长缓慢，实验组1(r1)生长明显优于对照组(r0)，说明含k100(85)i的单突变的epsps突变体抗草甘膦的能力明显优于野生型epsps；

实验组2(r2)和实验组3(r3)均能在含10mm草甘膦的培养基上生长，但实验组3(r3)的生长明显优于实验组2(r2)，只有实验组3(r3)能在在含50mm草甘膦的培养基上，说明k100(85)i位点突变能够在g111(96)a和p116(101)s位点变异提供的草甘膦抗性基础上进一步大幅度提高草甘膦抗性。

上述结果表明，单突变k100(85)i能够赋予水稻epsps突变体草甘膦抗性，且其与g111(96)a和p116(101)s突变结合后，具有草甘膦抗性加强的特性。

实施例6

以转化野生型玉米epsps编码基因(seqidno:9，编码seqidno:10所示的野生型玉米epsps)的大肠杆菌为对照组；

以转化仅具有k94(85)i单突变的玉米epsps突变体i的编码基因(seqidno:11，其编码seqidno:12)的大肠杆菌为实验组1；

以转化不具有k94(85)i突变仅具有g105(96)a、p110(101)s以及k207(194)r三个突变的玉米epsps突变体的编码基因(核苷酸序列如seqidno:13所示，编码的三突变玉米epsps突变体的氨基酸序列如seqidno:14所示)的大肠杆菌为实验组2；

以转化实施例3提供的玉米epsps突变体(具有k94(85)i、g105(96)a、p110(101)s以及k207(194)r四个突变)的编码基因(seqidno:15)的大肠杆菌为实验组3。

检测转化的大肠杆菌在含不同草甘膦浓度(0、1、20、50mm)的培养基上的生长情况，验证玉米epsps突变体iii编码基因及其编码的玉米epsps突变体iii在大肠杆菌中的抗草甘膦能力。其中，所用大肠杆菌为双敲除的大肠杆菌(敲除epsps基因和c-plyase基因后的大肠杆菌dh5α，命名为edce，其制备方法可参考申请号为2016103256926的中国发明专利)。

结果如图2所示(图中：z0代表对照组，z1代表实验组1，z2代表实验组2，z3代表实验组3)：

在含0mm和1mm草甘膦的培养基上实验组和对照组均能正常生长，说明实验组和对照组的epsps蛋白具有正常的epsps酶活力；但实验组1(z1)的生长明显优于对照组(z0)，且实验组3(z3)的大肠杆菌生长明显优于实验组2(z2)，说明k94(85)i突变提供了更高的epsps酶活性。

在含1mm草甘膦的培养基上，对照组(z0)生长微弱，实验组1(z1)生长明显优于对照组(z0)，说明含k94(85)i的单突变epsps突变体iii抗草甘膦的能力明显优于野生型epsps；

实验组2(z2)和实验组3(z3)均能在含20mm草甘膦的培养基上生长，但实验组3(z3)的生长明显优于实验组2(z2)，只有实验组3(z3)能在在含50mm草甘膦的培养基上，说明k94(85)i位点突变能够在g105(96)a、p110(101)s以及k207(194)r位点变异提供的草甘膦抗性基础上进一步大幅度提高草甘膦抗性。

上述结果进一步说明，单突变k94(85)i与g105(96)a、p110(101)s以及k207(194)r突变结合，具有草甘膦抗性加强的特性。

实施例7

以转化野生型大豆epsps编码基因(seqidno:17，编码seqidno:18所示的野生型大豆epsps)的大肠杆菌为对照组；

以转化仅具有k98(85)t突变，不具有p114(101)s突变的单突变大豆epsps突变体的编码基因(seqidno:19，其编码的单突变大豆epsps突变体的氨基酸序列如seqidno:20所示)的大肠杆菌为实验组1；

以转化不具有k98(85)t突变仅具有p114(101)s突变的单突变大豆epsps突变体的编码基因(核苷酸序列如seqidno:21所示，编码的单突变大豆epsps突变体的氨基酸序列如seqidno:22所示)的大肠杆菌为实验组2；

以转化实施例4提供的大豆epsps突变体(具有k98(85)t和p114(101)s两个突变)的编码基因(seqidno:23)的大肠杆菌为实验组3；

检测大肠杆菌在含不同草甘膦浓度(0、1、10mm)的培养基上的生长情况，验证大豆epsps突变体编码基因及其编码的大豆epsps突变体在大肠杆菌中的抗草甘膦能力。其中，所用大肠杆菌为双敲除的大肠杆菌(敲除epsps基因和c-plyase基因后的大肠杆菌dh5α，命名为edce，其制备方法可参考申请号为2016103256926的中国发明专利)。

结果如图3所示(图中：g0代表对照组，g1代表实验组1，g2代表实验组2，g3代表实验组3)：在含0mm草甘膦的培养基上实验组和对照组均能正常生长，表明实验组和对照组的epsps蛋白具有正常的epsps酶活力；

在含1mm草甘膦的培养基上，对照组(g0)基本不能生长，实验组(g1)生长明显优于对照组(g0，说明含k98(85)t单突变的大豆epsps突变体抗草甘膦的能力明显优于野生型大豆epsps；

实验组2(g2)和实验组3(g3)均能在含20mm草甘膦的培养基上生长，但实验组3(g3)的生长优于实验组2(g2)，说明k98(85)t位点突变能够在p114(101)s位点变异提供的草甘膦抗性基础上进一步提高草甘膦抗性。

该结果进一步说明，单突变k98(85)t具有草甘膦抗性，且其与p114(101)s突变结合后，具有草甘膦抗性加强的特性。

实验例8

检测实施例7提供的g1(seqidno:20)、g2(seqidno:22)和g3(seqidno:24)大豆epsps突变体，实施例5提供的r1水稻epsps突变体(seqidno:4)，和实施例6提供的z1玉米epsps突变体(seqidno:12)在转基因水稻中的草甘膦抗性，方法如下：

按常规方法提取实施例1-7中的padv5-epsps的单克隆抗性菌的质粒(含epsps突变基因基因)。将其用pac1和bsteii双酶切，回收小片段，然后用t4dna连接酶将小片段连接至经同样双酶切后的pgvp1载体上，得到pgvp1-epsps载体，其结构如图8所示。

将pgvp1-epsps载体转化eha105(根癌农杆菌、agrobactriumtumefaciens)感受态细胞，挑取单克隆进行菌落pcr检测，得到阳性菌株；再将阳性菌株接种到1ml的含50μg·ml^-1卡那霉素和50μg·ml^-1利福平的yep培养中扩繁，保存于-80℃，或用于后续实验。

水稻转化：

把-80℃保存的含目的基因载体的菌种400ul加进有yep+50μg/ml利福平+50μg/ml卡那的固体培养基的培养皿中，28℃暗中培养24小时，再将该菌加进浸染培养基，调该菌液到od＝0.2作为浸染液。

消毒和预培养:取成熟水稻(日本晴)种子，人工脱壳，挑选饱满无菌斑的种子，按以下步骤消毒：将种子放入50ml无菌离心管中，加入70％酒精消毒30秒,倒去酒精，使用无菌水清洗一次；加入10-20ml的2.6％次氯酸钠溶液，浸泡消毒20分。倒去次氯酸钠溶液，用无菌水浸泡清洗6-7次，每次3分。

诱导与继代培养:种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12颗；操作完毕用封口膜封好培养皿，在30℃暗中培养21-28天,将愈伤组织转接到新鲜培养基上,继续培养7-14天左右.,取1-2mm大小的球型愈伤组织,作为浸染受体。

浸染与共培养：

将愈伤组织接入离心管或培养杯中，加入调制好的农杆菌悬浮液浸染10分钟，期间摇动数次；倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液(30分钟左右)；将愈伤组织置于培养皿中无菌滤纸上，25℃暗中培养2-3天。

恢复培养：将共培养后的愈伤组织接种于恢复培养基上，30℃暗中培养5-7天。第一轮筛选：将愈伤转入筛选培养基1(s1),30℃暗中培养14天.

第二轮筛选：然后将愈伤转到筛选培养基2(s2),30℃暗中培养14天。

第一轮分化：将经过筛选后的抗性愈伤组织转接到分化培养基上，30℃光照19小时，培养21天左右。第二轮分化：挑选新生的幼小嫩芽移至新的分化培养基，继续培养21天左右。

待新生幼苗长至2cm左右时，移至生根培养基中，30℃光照(16/8h)培养3～4周，待诱导出根并且幼苗长至7～10cm时，从培养基中取出，洗净根部沾染的培养基，移至育秧盘中，继续培养10d左右后移入温室或大田。

培养基配方：

诱导培养基：nbbasalmedium【n6大量+ms铁盐溶液+b5微量及有机】+水解酪蛋白0.3g/l+l-proline+2.787g/l+蔗糖30g/l+2,4-d4mg/l+琼脂8g/l，ph5.8。

浸染培养基：nbbasalmedium【n6大量+ms铁盐溶液+b5微量及有机】+l-proline0.7g/l+蔗糖68.4g/l+葡萄糖36g/l+2,4-d2mg/lph5.2(小锅115℃)，as20mg/l现用现加。

共培养培养基：nbbasalmedium【n6大量+ms铁盐溶液+b5微量及有机】+水解酪蛋白0.3g/l+l-proline2.787g/l+蔗糖30g/l+2,4-d1mg/lph5.2，as20mg/l现用现加。

恢复培养基：nbbasalmedium【n6大量+ms铁盐溶液+b5微量及有机】+谷氨酰胺0.2g/l+l-proline2.787g/l+蔗糖30g/l+2,4-d4mg/l+琼脂8g/l，ph5.8。灭菌后加cefotaxime(头孢100mg/l)+timentin(特美汀)100mg/l+vancomycin(万古霉素)50mg/l。

筛选培养基1(s1)：nbbasalmedium【n6大量+ms铁盐溶液+b5微量及有机】+谷氨酰胺0.2g/l+l-proline2.787g/l+蔗糖30g/l+2,4-d2mg/l+琼脂8g/l，ph5.8。灭菌后加cefotaxime(头孢)100mg/l+timentin(特美汀)100mg/l+vancomycin(万古霉素)50mg/l。加筛选剂(glyphosate400mg/l,orhygromycin50mg/l)。

筛选培养基2(s2)：nbbasalmedium【n6大量+ms铁盐溶液+b5微量及有机】+谷氨酰胺0.2g/l+l-proline2.787g/l+蔗糖30g/l+2,4-d2mg/l+琼脂8g/l，ph5.8。灭菌后加cefotaxime(头孢)100mg/l+timentin(特美汀)100mg/l+vancomycin(万古霉素)50mg/l。加筛选剂(glyphosate50-400mg/l,orhygromycin30mg/l)。

分化培养基(f)：msbasalmedium【ms大量、铁盐溶液、微量及有机】+谷氨酰胺0.2g/l+蔗糖30g/l+山梨醇30g/l+琼脂8g/lph5.8。灭菌后加cefotaxime(头孢)200mg/l+kt2mg/l+naa0.02mg/l+glyphosate1-5mg/l.

加筛选剂(glyphosate1-5mg/l,orhygromycin20mg/l)。

生根培养基：1/2msbasalmedium【ms大量、铁盐溶液、微量及有机】+肌醇0.1g/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l,ph5.8。灭菌后加cefotaxime(头孢)100mg/l,naa0.2mg/l

转基因植株的检测：

采用pcr法检测出转epsps突变体基因的水稻植株，根据pgvp1-epsps载体序列和水稻内参基因设计正反向检测引物，序列如下：

针对载体部分序列：

camv15:5’-ggtggctcctacaaatgccatc-3’；

cts3：5’-gagccaattaacgtcatcccac-3’；扩增片段大小为452bp；

针对水稻内参基因：

osf:5’-gcttctgaccagcccattattctgc-3’；

osr：5’-ccctcaagggtaagctcatctctcttc-3’；扩增片段大小为629bp。

分别提取转pgvp1-epsps基因的水稻植株的基因组dna，均一化至100ng/μl。

pcr检测体系：10μl2×tsingke，2μl引物混合物(10μmol/l的osf、osr、camv15、cts3，各0.5μl)，1μl基因组dna模板(100ng/μl)，7μlddh2o。

pcr检测程序：94℃，3min；94℃，30s；62℃，30s；72℃，45s；30个循环；72℃，10min；12℃保持。

pcr扩增产物1.5％琼脂糖凝胶电泳，在452bp位置和629bp位置有条带的则为转基因阳性烟草植株。

本实施例验证epsps突变体在水稻转基因植株中的草甘膦抗性。实验方法如下：

将移栽后的转基因水稻苗均匀地排放在同一实验区域(避免叶片重叠)。计算实验组和对照组的占地区域面积，根据区域面积，按1060克/公顷(0.106g/m2)为1x剂量来喷施草甘膦。2x剂量为2120克/公顷，5x剂量为5300克/公顷，20x剂量为21200克/公顷。

用市售的41％草甘膦铵盐农达，根据上述的喷洒浓度，取相应体积的草甘膦铵盐农达，然后用20倍体积水稀释后，均匀喷施在实验组和对照组的植株上。待叶面干燥后，将植株移入温室或室外培养。

草甘膦抗性的统计标准为：如果植株没有任何的草甘膦损伤现象，生长正常，为高草甘膦抗性植株，用“+++”表示；如果植株的叶片颜色有些发黄，生长略为缓慢，为中草甘膦抗性植株，用“++”表示；如果植株的部分叶片枯萎，生长非常缓慢，为低草甘膦抗性植株，用“+”表示；如果植株枯萎、死亡，为非草甘膦抗性植株(不具有草甘膦抗性)，用“-”表示。

喷洒1x草甘膦后，于第10天观察、记录各组植株的生长状况，并对存活的植株喷洒2x草甘膦。再过10天观察、记录各组植株的生长状况，并对存活的植株喷洒5x草甘膦。再过10天观察、记录各组植株的生长状况，并对存活的植株喷洒20x草甘膦。再过10天观察、记录各组植株的生长状况，结果见表一，其中-、+、++和+++为相应的植株数，“％++&+++”为中、高抗草甘膦植株占观察植株总数的百分比。结果见表1。

表1

根据表1的结果可看出：

在喷施1x草甘膦后，转化野生型大豆epspsg0的水稻全部无抗性，均死亡，但转化大豆epsps突变体g1的水稻苗的草甘膦抗性明显优于g0，有6.4％为中抗或高抗，在2x草甘膦剂量下g1的水稻苗仍有存活，说明含k98(85)t的大豆epsps单突变体抗草甘膦的能力明显优于野生型；

转化大豆epsps突变体g2、大豆epsps突变体g3的水稻均对1x草甘膦有一定抗性，但在2x剂量下，含大豆epsps突变体g2的水稻苗全部死亡，而含大豆epsps突变体g3的水稻苗有19.4％为中抗，说明k98(85)t位点的大豆epsps突变能够在p114(101)s位点突变提供的草甘膦抗性基础上很明显地进一步提高草甘膦抗性。

在喷施1x草甘膦后，转化野生型水稻epspsr0的水稻全部无抗性，除一株严重受损外，其余全部死亡，但转化水稻epsps突变体r1的水稻苗的草甘膦抗性明显优于r0，有88.9为中抗或高抗，即使在2x和5x草甘膦剂量下r1仍有27.8％和11.1％为中抗或高抗，说明含k100(85)i的水稻epsps单突变体抗草甘膦的能力明显优于野生型；

在喷施1x草甘膦后，转化野生型玉米epspsz0的水稻苗虽有少数存活，但严重受损，没有中、高抗的植株，但转化玉米epsps突变体z1的水稻苗的草甘膦抗性明显优于z0，有10.5％为中抗或高抗，在2x和5x草甘膦剂量下，转化野生型玉米epspsz0的水稻没有一株存活，但转化玉米epsps突变体z1的水稻苗均有存活，说明含k94(85)i的玉米epsps单突变体抗草甘膦的能力明显优于野生型；

以上结果充分说明，与大肠杆菌epsps序列相比，植物epsps突变体的氨基酸序列在对应于大肠杆菌epsps的第85位具有突变k85i可以赋予或提高植物epsps突变体在植物中的草甘膦抗性。

综上，相较于野生型植物epsps例如水稻野生型epsps、玉米野生型epsps、大豆野生型epsps，本发明提供的植物epsps突变体(seqidno:3所示的单突变水稻epsps突变体、seqidno:12所示的单突变玉米epsps突变体、seqidno:20所示的单突变大豆epsps突变体以及seqidno:8所示的多突变水稻epsps突变体、seqidno:16所示的多突变玉米epsps突变体、seqidno:24所示的多突变大豆epsps突变体)及其编码基因具有更高的草甘膦抗性和完整的生物酶活性；

此外，本发明提供的植物epsps突变体及其编码基因来源于水稻、玉米、大豆品种本身而不是微生物，其可适于转化各种植物品种例如水稻、烟草、大豆、玉米、棉花、高粱、小麦等植物，其具有更广阔的适用范围。同时，根据本发明提供的植物epsps突变体编码基因的序列，可以将其用于培育新的抗草甘膦的水稻品种中(非转基因方法)，获得抗草甘膦的非转基因常规品种，提高新品种的公众接受程度。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>四川天豫兴禾生物科技有限公司

<120>一种含k85突变的植物epsps突变体及其编码基因和应用

<160>25

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1365

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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ctcctctccgccctctccgagggcacaacagtggtggacaacttgctgaacagtgaggat180

gttcactacatgcttgaggccctgaaagccctcgggctctctgtggaagcagataaagtt240

gcaaaaagagctgtagtcgttggctgtggtggcaagtttcctgttgagaaggatgcgaaa300

gaggaagtgcaactcttcttggggaacgctggaactgcaatgcgaccattgacagcagcc360

gtgactgctgctggtggaaatgcaacttatgtgcttgatggagtgccacgaatgagggag420

agaccgattggtgacttggttgtcgggttgaaacaacttggtgcggatgtcgactgtttc480

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thrthrvalvalaspasnleuleuasnsergluaspvalhistyrmet

505560

leuglualaleulysalaleuglyleuservalglualaasplysval

65707580

alalysargalavalvalvalglycysglyglylyspheprovalglu

859095

lysaspalalysglugluvalglnleupheleuglyasnalaglythr

100105110

alametargproleuthralaalavalthralaalaglyglyasnala

115120125

thrtyrvalleuaspglyvalproargmetarggluargproilegly

130135140

aspleuvalvalglyleulysglnleuglyalaaspvalaspcysphe

145150155160

leuglythrglucysproprovalargvallysglyileglyglyleu

165170175

proglyglylysvallysleuserglyserileserserglntyrleu

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seralaleuleumetalaalaproleualaleuglyaspvalgluile

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290295300

alalysvalthrtrpthraspthrservalthrvalthrglypropro

305310315320

arggluprotyrglylyslyshisleulysalavalaspvalasnmet

325330335

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