一种检测细胞迁徙数量的方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种检测细胞迁徙数量的方法。

背景技术：

细胞治疗有可能为包括癌症在内的许多疾病提供新的治疗方式，干细胞特别是间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)已经被实验用于递送治疗性转基因。然而，相互矛盾的报道一方面发现人类mscs可以促进转移，另一方面其他研究表明mscs可以阻止转移灶的生长。

众所周知，肿瘤细胞与基质之间的相互作用对于肿瘤的生长和侵袭具有重要意义，且肿瘤细胞所处的微环境在肿瘤生长和转移中发挥着重要作用。肿瘤微环境中的肿瘤细胞、基质细胞和可溶性因子协调组成网状结构，各组分之间有显著的相互作用：肿瘤细胞可以改变肿瘤微环境的性质；同时，肿瘤微环境也可导致肿瘤细胞在癌症恶化过程中产生不同的生物学行为，进而影响肿瘤的生长与扩散。间充质干细胞是微环境的重要组成部分，广泛存在于成体结缔组织和器官间质中，也可从相应的胎儿组织中获得。

msc易于分离培养，纯化的msc在体外可以大量扩增且能向多种类型细胞分化，遗传背景稳定。msc可向损伤的组织和器官(包括被称为“不愈合伤口”的肿瘤)归巢，参与肿瘤微环境的构成，在肿瘤发生发展各个阶段中均具有重要作用，是影响肿瘤产生及转移至其他组织过程中的关键因素。msc通过改造肿瘤微环境、调节血管生成、抑制肿瘤免疫应答等影响肿瘤的发生发展。如何快速、有效地检测癌细胞迁徙数量，对研究细胞治疗癌症具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测细胞迁徙数量的方法，其具有快速有效、节约成本、结果准确的优点，为以后临床使用奠定了基础，应用前景广阔。

本发明所采取的技术方案是：一种检测细胞迁徙数量的方法，其包括如下步骤：

间充质干细胞与癌细胞共培养，将间充质干细胞接种于transwell板下室，癌细胞接种于小室内，37℃孵育24h；

擦去未迁移细胞，0.4％台盼蓝染色穿膜细胞，显微镜观察拍照；

采用spss19.0统计软件进行统计分析并计算迁移细胞数。

作为上述方案的进一步改进，所述统计分析的计量资料以表示，组间比较采用t检验，以p<0.05为差异有统计学意义。

作为上述方案的进一步改进，所述0.4％台盼蓝染色穿膜细胞前进行倒置风干10min。

作为上述方案的进一步改进，所述间充质干细胞与癌细胞共培养前的预处理方法为：在间充质干细胞达到80～90％汇合时弃去细胞培养液，pbs洗涤，用含有edta的胰蛋白酶消化解离细胞，待细胞回缩变圆并从培养皿上开始脱落时用含有10％胎牛血清的完全培养基终止消化，反复吹打混合液形成细胞悬液，1200rpm离心5min，弃去液体后加入培养基，取30μl细胞液，与同等剂量的0.4％台盼蓝染色液混匀。

本发明的有益效果是：本发明可通过对不同间充质干细胞培养过的癌细胞迁徙数量进行对比，作为判定哪一种更合适针对该癌细胞进行细胞治疗的理论依据，其避免了细胞实验复杂的操作步骤，且具有可提前准备、操作方便快捷、检测结果准确有效、可大批量使用等优点。

附图说明

图1是实施例1中未染色前traswell板膜上的hela癌细胞形态(其中图1a是羊水间充质干细胞与hela癌细胞共培养组；图1b是脐带间充质干细胞与hela癌细胞共培养组；图1c是胎盘间充质干细胞与hela癌细胞共培养组)；

图2是实施例2染色后traswell板膜上的hela细胞形态(其中图2a是羊水间充质干细胞与hela癌细胞共培养组；图2b是脐带间充质干细胞与hela癌细胞共培养组；图2c是胎盘间充质干细胞与hela癌细胞共培养组)；

图3是实施例3计算出的各组迁徙的hela癌细胞数量(*p<0.05为差异显著)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。本发明实施例中所述血清购于hyclone公司；所述的transwell板购置于corning公司；所述的胰酶购于gibco公司。

实施例1：三种间充质干细胞对hela癌细胞的共培养

(1)羊水间充质干细胞

当羊水间充质干细胞达到80～90％汇合时，弃去细胞培养液；用pbs洗涤三次；用含有0.02％edta的0.25％胰蛋白酶覆盖细胞使细胞得到解离；待细胞回缩变圆并从培养皿上开始脱落时用含有10％胎牛血清的完全培养基终止消化；将混合液反复吹打直至贴壁细胞从培养皿上脱落形成细胞悬液1200rpm下离心5min；弃去液体后加入培养基轻柔吹匀使细胞散开，取30μl细胞液，与同等剂量的0.4％台盼蓝染色液混匀，将羊水间充质干细胞接种于transwell板下室，hela癌细胞接种于小室内，37℃孵育24h。

(2)脐带间充质干细胞

当脐带间充质干细胞达到80～90％汇合时，弃去细胞培养液；用pbs洗涤三次；用含有0.02％edta的0.25％胰蛋白酶覆盖细胞使细胞得到解离；待细胞回缩变圆并从培养皿上开始脱落时用含有10％胎牛血清的完全培养基终止消化；将混合液反复吹打直至贴壁细胞从培养皿上脱落形成细胞悬液1000rpm下离心5min；弃去液体后加入培养基轻柔吹匀使细胞散开，取30μl细胞液，与同等剂量的0.4％台盼蓝染色液混匀，将脐带间充质干细胞接种于transwell板下室，hela癌细胞接种于小室内，37℃孵育24h。

(3)胎盘间充质干细胞

当胎盘间充质干细胞达到80～90％汇合时，弃去细胞培养液；用pbs洗涤三次；用含有0.02％edta的0.25％胰蛋白酶覆盖细胞使细胞得到解离；待细胞回缩变圆并从培养皿上开始脱落时用含有10％胎牛血清的完全培养基终止消化；将混合液反复吹打直至贴壁细胞从培养皿上脱落形成细胞悬液1000rpm下离心5min；弃去液体后加入培养基轻柔吹匀使细胞散开，取30μl细胞液，与同等剂量的0.4％台盼兰染色液混匀，将胎盘间充质干细胞接种于transwell板下室，hela癌细胞接种于小室内，37℃孵育24h。

实施例2：检测细胞迁徙

实施例1中三种间充质干细胞与hela癌细胞共培养后的hela癌细胞会迁徙至transwell上室的膜外，先用棉签擦去transwell上室未迁移细胞，再将上室倒置风干10min，待液体干掉之后，采用0.4％台盼蓝染色穿膜细胞，后经pbs清洗一次。

期间通过相差显微镜观察台盼蓝染色前和染色后的traswell板膜上的hela癌细胞形态，其观察结果分别如附图1(1a、1b、1c)和附图2(2a、2b、2c)所示。

实施例3：计算迁移细胞数

分别在实施例2中三种间充质干细胞与hela癌细胞共培养的小室中随机取5个视野拍照并计数迁移细胞数，计算平均值，具体地是采用spss19.0统计软件进行统计分析，计量资料以表示，每种间充质干细胞的组间比较采用t检验，以*p<0.05为差异显著，具有统计学意义，再通过软件对细胞数量进行分析、作图，其结果如附图3所示。

上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。