一种用于无创产前检测双侧杯状耳畸形的基因芯片、试剂盒及基因芯片的应用方法与流程

本发明涉及生物、医药
技术领域：
，具体涉及一种用于无创产前检测双侧杯状耳畸形的基因芯片、试剂盒及基因芯片的应用方法。
背景技术：
：先天性耳部畸形是影响耳郭位置和形态的一种常见的出生缺陷，耳部软骨发育的异常多累及耳的外形和正常功能。流行病学调查显示，人群中约有5％的样本有不同程度的先天性耳部发育畸形，主要包括招风耳、杯状耳畸形和先天性小耳(或无耳)畸形等。杯状耳畸形是先天性耳畸形中的一种，是介于招风耳和小耳之间的先天性畸形疾患，其主要的临床表型为：耳郭上半部的耳轮紧缩，耳轮及耳郭软骨卷曲和粘着，耳轮脚向下移位，对耳轮及其后脚扁平甚至消失，耳舟变宽，耳轮缘弯向耳甲艇，耳郭呈杯形，严重者耳郭卷曲几乎成管状。杯状耳畸形约占各种先天性耳部畸形的10％；区别于其他常见的耳部畸形，杯状耳畸形多双侧发生，同时具有明显的遗传倾向。尽管杯状耳畸形一般不伴随严重的中耳、内耳畸形或其他器官畸形，但由于不同的严重程度所导致的外观缺损和其明显的遗传倾向，往往会给患者造成巨大的心理压力和负担。因此基于杯状耳畸形的家系鉴定易感基因，具有重要的科学价值和社会意义。从发育生物学的角度看，人的面部形成主要受头部神经嵴细胞的影响，神经嵴细胞起源于预置神经板的外侧边缘，在神经管闭合时位于闭合处，随后离开闭合处向特定部位迁移。外耳和中耳由第一、第二鳃弓和神经嵴细胞细胞迁移衍化而来。胚胎第6周时，第一鳃沟周围的间充质增生，形成6个结节状的耳丘围绕外耳道口，逐渐演变为耳郭；而中耳则主要由神经嵴的间叶组织分化而来。外耳和中耳的发生是神经嵴细胞迁移及软骨分化、多种细胞相互作用的结果，并且受多种结构和调控蛋白及信号通路的影响。基因芯片技术是指将特定寡核苷酸片段作为探针固定于支持物上，掺入标记物的目的dna片段通过pcr扩增后，按碱基配对原理进行杂交，再通过信号检测系统对芯片进行扫描，并配用相关分析软件对每一探针上的信号作出比较和检测。目前该技术在疾病检测领域已得到了广泛应用。传统方法对双侧杯状耳畸形诊断，并无特殊的产前检测方法，只能等出生后进行手术治疗，给患者带来了精神和身体上的双重痛苦。因此，寻找一种高灵敏度的无创产前诊断双侧杯状耳畸形遗传病的方法是非常必要的。我们针对前期研究结果，收集孕妇外周血，提取孕妇外周血中胎儿的游离dna(cf-fdna)，采用特异性引物或探针对进行扩增检测，并进行双侧杯状耳畸形生育风险评估，为患儿和父母提供更多的选择和预警，为优生优育提供有力工具。技术实现要素：本发明的目的是提供一种用于无创产前检测双侧杯状耳畸形的基因芯片、试剂盒及基因芯片的应用方法，以克服现有技术中提到的不足。本发明的目的是通过以下技术方案来实现：一种用于无创产前检测双侧杯状耳畸形的基因芯片，所述基因芯片包括片基，该片基上设有用于检测双侧杯状耳畸形相关基因的探针组形成微阵列基因芯片。所述探针组包括10条探针，各个探针的序列如下所示：(1)探针p1：其核苷酸序列为gtgggttattggggggaagaac；(2)探针p2：其核苷酸序列为taaatattgcagttgactttatt；(3)探针p3：其核苷酸序列为caggttcgagacacggatcgcat；(4)探针p4：其核苷酸序列为ctgtcaacagaggagaaagcctg；(5)探针p5：其核苷酸序列为atggtgtctgcagcaggaggc；(6)探针p6：其核苷酸序列为ttatctcttgtatgtaacttga；(7)探针p7：其核苷酸序列为gtggcaactaagaaccaacatt；(8)探针p8：其核苷酸序列为ggcctgtgagtccctctgccaggtg；(9)探针p9：其核苷酸序列为cccacagccggctcctggcctgg；(10)探针p10：其核苷酸序列为tcccttccctaacgccccctgag；在，探针p1～探针p10中，每条探针的5’端均标记有荧光基团，其3’端均标记有淬灭基团。进一步地，所述片基包括载玻片、硅片或膜作为载体。进一步地，在基因芯片上，每个所述的探针均设有3条，则基因芯片上含有30条所述的探针。进一步地，在基因芯片上，还固定有阳性质控探针、阴性质控探针和空白对照探针；优选地阳性质控探、阴性质控探针和白对照探针各设有3条，则基因芯片上一共固定有39条探针。进一步地，在上述(1)～(10)中，每个探针中的5’端所标记的荧光基团均为fam、hex、vic、cy5和tet中的任意一种；每个探针中的3’端所标记的淬灭基团均为tamra、mgb和bhq中的任意一种。一种用于无创产前检测双侧杯状耳畸形的基因芯片的制备方法，包括如下步骤：片基的酸碱预处理，醛基化处理，异硫氰酸化处理，芯片探针的设计，探针的点制，立即将玻片在80℃烘烤10min，制成微阵列玻片，存储在带有干燥剂的盒子里，室温保存即得。一种用于无创产前检测双侧杯状耳畸形的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的基因芯片。一种基因芯片的应用方法，所述方法为：准备含有dna的样本，然后对dna样本进行定量，随后采用所述的基因芯片进行杂交。本发明的有益效果为：本发明公开了一种基因芯片，并将特定碱基序列的探针固定在芯片上形成微阵列，进而采用该芯片进行检测双侧杯状耳畸形，通过基因芯片的方式进行检测，比直接使用探针具有诸多优势，具体地，该检测方法操作步骤更简便，时间更短，通常30～60分钟便可完成检测，大大缩短了时间周期，且检测的特异性好、分辨率高，具有高灵敏度、准确、快速的特点；并具有高通量的特点，可以快速筛查双侧杯状耳畸形相关基因的变异，并将双侧杯状耳畸形的诊断提高到基因水平上；总之，该方法节约成本时间，减少病人痛苦，可无创产前诊断胎儿的患病几率。该微阵列芯片，是以待测孕妇外周血的cf-fdna(胎儿与母体游离dna混合物)为模板，提取并进行定量进行标记后，与本发明的芯片进行杂交，根据杂交结果确定胎儿是否携带有双侧杯状耳畸形相关基因；非常简单，大大降低误差率和时间成本，提高精确度；能用于产前先天性遗传病的诊断，在无创产前诊断领域具有很大的潜力。附图说明通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：图1是本发明实施例所述的基因芯片中探针顺序的分布结构示意图；图2是本发明实施例所述的胎儿未携带有任何双侧杯状耳畸形及调控区拷贝数变异的扫描图；图3是本发明实施例所述的胎儿混合携带有双侧杯状耳畸形相关基因调控区域拷贝数变异(cnv)的扫描图。具体实施方式下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1一种用于无创产前检测双侧杯状耳畸形的基因芯片，所述基因芯片包括片基，该片基上设有用于检测双侧杯状耳畸形相关基因的探针组形成微阵列基因芯片；所述探针组包括10个探针，各个探针的序列如下所示：(1)探针p1：其核苷酸序列为gtgggttattggggggaagaac；(2)探针p2：其核苷酸序列为taaatattgcagttgactttatt；(3)探针p3：其核苷酸序列为caggttcgagacacggatcgcat；(4)探针p4：其核苷酸序列为ctgtcaacagaggagaaagcctg；(5)探针p5：其核苷酸序列为atggtgtctgcagcaggaggc；(6)探针p6：其核苷酸序列为ttatctcttgtatgtaacttga；(7)探针p7：其核苷酸序列为gtggcaactaagaaccaacatt；(8)探针p8：其核苷酸序列为ggcctgtgagtccctctgccaggtg；(9)探针p9：其核苷酸序列为cccacagccggctcctggcctgg；(10)探针p10：其核苷酸序列为tcccttccctaacgccccctgag。优选地，所述片基包括载玻片、硅片或膜作为载体；所述片基或载体可由高分子材料制成。在上述探针p1～探针p10中，每条探针的5’端均标记有荧光基团，其3’端均标记有淬灭基团。基因芯片上探针的顺序如图1所示，即由左至右依次设有探针p1～探针p10，按顺序进行排列，为后面的结果判定带来便利。10条所述探针的5’端所标记的荧光基团为fam、hex、vic、cy5和tet中的任意一种；3’端所标记的淬灭基团为tamra、mgb和bhq中的任意一种。优选地，所述探针p1到探针p13中的荧光基团相同，所述探针p1到探针p13中的淬灭基团相同。优选地，在基因芯片上，每个所述的探针均设有3条，即重复三次，则基因芯片上含有30条所述的探针，每条的位点如图1所示。优选地，在基因芯片上，还固定有阳性质控探针(即附图1中的c2)、阴性质控探针(即附图1中的c1)和空白对照探针(即附图1中的c3)；优选地阳性质控探、阴性质控探针和白对照探针各设有3条，一共9条，则基因芯片上一共固定有39条探针。在本实施例中，检测双侧杯状耳畸形时，只需要在cf-fdna提取并定量进行标记以后，与本实施例中的固定有特定数量与特定序列探针的基因芯片杂交便可，最后根据杂交结果进行相应的评估。这10个具体的探针序列以及10个序列之间的配合作用属于本发明重要的发明点之一。实施例2一种用于无创产前检测双侧杯状耳畸形的基因芯片的制备方法，选择载玻片作为基因芯片的载体片基，该基因芯片的制备则包括如下步骤，依次如下：(1)载玻片的酸碱预处理；(2)醛基化处理；(3)异硫氰酸化处理；(4)芯片探针设计；(5)探针点制；(6)点制完成的芯片放置80℃烘烤10min，制成微阵列玻片；(7)存储在带有干燥剂的盒子里，室温保存。在本实施例中，制备方法可按常规方法制备也可以，重点是基因芯片本身，而非其制备方法。实施例3一种用于无创产前风险评估先天性双侧杯状耳畸形的试剂盒，所述试剂盒包括实施例1中所述的基因芯片。在本实施例中，检测评估双侧杯状耳畸形时，只需要将cf-fdna提取并定量以后，再与本实施例中的固定有特定序列的探针的基因芯片杂交检测，便可根据杂交结果进行相应的评估。实施例4一种基因芯片的应用方法，其特征在于，所述方法为：首先，准备含有dna的样本，即cf-fdna，对cf-fdna提取并定量进行标记，然后采用所述的基因芯片进行杂交，杂交以后再进行数据处理和图像分析，芯片扫描等再进行结果评估。具体如下：(1)采集孕妇血液，提取血液中的胎儿cf-fdna；s1：准备洗涤液(购买厂家：常州百代生物科技有限公司)，配制洗涤液a和洗涤液b；a)洗涤液a：取21ml洗涤液则加入9ml无水乙醇；若取42ml洗涤液则加入18ml无水乙醇。b)洗涤液b：取9ml洗涤液则加入21ml无水乙醇；若取18ml洗涤液则加入42ml无水乙醇。s2：取1.5ml离心管，加入200μl所采集的孕妇血液样本，4μldnacarrier(dna载体，购买厂家：常州百代生物科技有限公司)混合均匀，加入300μl裂解液(购买厂家：常州百代生物科技有限公司)，以及20μl消化液(购买厂家：常州百代生物科技有限公司)，振荡混匀，56℃水浴10分钟。s3：向s2中的离心管中加入1000μl无水乙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响dna的提取与后续实验；s4：将吸附柱放入收集管内，将760μl步骤s3中所得到的溶液转入吸附柱内，静置2分钟，将含有收集管的吸附柱在12,000rpm4℃离心1分钟，拿出吸附柱，弃收集管内的废液，并将吸附柱重新放回收集管内，将剩余760μl溶液转移至吸附柱内，重复一次该步骤；s5：将重复步骤中收集管内所得到的液体除去，并将吸附柱再放回收集管内，加500μl洗涤液a至吸附柱内，12,000rpm4℃离心1分钟，弃收集管内废液，将吸附柱放回收集管内；s6：加500μl洗涤液b至吸附柱内，12,000rpm4℃离心1分钟，弃收集管内废液，并将吸附柱放回收集管内，12,000rpm4℃离心2分钟，离去残留的洗涤液；s7：取出吸附柱，放入新的1.5ml离心管内，加入30-50μl洗脱液，静置3分钟，12,000rpm4℃离心2分钟，收集cf-fdna溶液。提取的cf-fdna即可用于下一步实验或-20℃保存。(2)标记：将步骤(1)中提取的cf-fdna和正常对照的标准dna样本(来自正常人群，或者可以从人类基因组数据库中获得)进行荧光标记，并准确对样本进行定量。具体操作如下：分别取1ug标准dna样本，以随机引物法进行荧光标记，cf-fdna以fluorescein-12-dutp标记，探针显绿色荧光；正常对照dna以tetramethylrhodamine-5-dutp标记，探针显红色荧光。(3)杂交：首先制备芯片杂交液：杂交液配比如：100～300mmhepes-hcl(ph8.0)、1～3mnacl、0.5～1mmedta(ph8.0)；然后将定量并标记后的dna各取500ng等比例混合，混合物再与杂交液等比例混匀，在95℃条件下变性10min后，立即置于冰浴中5min，同时将基因芯片在0.2％sds中漂洗20s后，再在超纯水中漂洗5s，甩去基因芯片表面的水，在室温条件下晾干。取变性的扩增产物10μl，小心加入基因芯片反应区中，使其分布均匀(以杂交混合液覆盖杂交反应区且不溢出为准)。将杂交混合液加入基因芯片反应区时，应注意切不可使枪头与基因芯片接触，以免影响探针阵列。将基因芯片平置于杂交盒中，在待定杂交温度的水浴中杂交1小时。杂交反应时应防止冷凝水滴落在基因芯片上；移动杂交盒时应小心，以防各反应区的反应液交叉污染。杂交反应结束后，将基因芯片在ssc洗涤液中漂洗。取出基因芯片，甩去残留在基因芯片上的液体，室温晾干。(4)数据处理和图像分析：杂交结果采用激光共聚焦基因芯片扫描仪对步骤(3)中的基因芯片进行扫描，并采用信号分析软件进行分析。具体可根据现有技术进行操作。(5)芯片效果验证：使用上述基因芯片检测经测序验证为正常人样品20份和先天性双侧杯状耳遗传病患者20份，共计40份，检测结果均与高密度snp芯片检测结果以及二代测序结果一致，证明了本发明的芯片检测先天性双侧杯状耳畸形突变时具备特异性。结果判定：结合附图1-3，本发明的阳性扫描结果如附图中的图标●，实心图标；阴性扫描结果如附图中的图标内填充斜杠图标；杂合携带者如附图中的图标内填充三角形图标。图1为基因芯片上探针的顺序或位置的分布示意图；图2：胎儿未携带有任何有双侧杯状耳畸形相关基因及调控区拷贝数变异的扫描结果示意图；图3：胎儿混合携带有双侧杯状耳畸形相关基因调控区域拷贝数变异(cnv)的扫描结果示意图。检测结果分析，待检样本经基因芯片杂交检测，若基因芯片上的10个探针的颜色与图3一致则为阳性病例，即携带有双侧杯状耳畸形相关的致病基因，则可知，出生后的婴儿患有双侧杯状耳畸形；若检测结果出来后，基因芯片上的10个探针的颜色与图2一致则为阴性病例，即被检测胎儿没有携带双侧杯状耳畸形相关的致病基因，则可知，出生后的婴儿不会患有双侧杯状耳畸形。则杂交、扫描以后的结果分析只需要对比图1～3便可得出结论，非常简单，不需要另外计算ct值等等，也不需要绘制相应的曲线图辅助判断，大大节约时间，且减少误差率，增加结果的精确性，对于实际应用具有极其重要的价值。在上述步骤(1)中，对于孕妇，最早于怀孕4～8周便可进行该疾病的筛查，即通过本发明的试剂盒，使得采集怀孕4～8周孕妇的外周血便能评估判断胎儿是否患有双侧杯状耳畸形，即若检测结果为阳性，则胎儿患有双侧杯状耳畸形，可进行提早干预，若为阴性，则没有患有。实施例5为了验证本发明探针等的特异性以及方法的有效性，本发明采集了样本库中的阴性样本和阳性样本各4个(为了研究方便，本申请人具有大型的样本库)，分别记为样本a01～a08，按照实施例4所述的方法进行检测，采用的杂交体系与实施例4相同。所得结果如以下表1所示。表1检测结果数据分析在表1中，阴阳性以及胎儿出生后的表型等均为已知，通过本发明的方法所检测到的阴性、阳性结果等均与样本库中记录的信息完全一致，所预测的胎儿表型也与实际中婴儿的表型完全一致。此外，本发明人在多年的研究中，已经对样本库中的几百个案例进行了验证研究，结果均与实际中的基本一致，故本申请中的准确率极高，基本能够达到100％以上。实施例6对象：采集怀孕4～5周的孕妇的外周血，且所采集的孕妇均为带有双侧杯状耳畸形表型或其家族近亲含有双侧杯状耳畸形；采集地点：在全国范围将近30个医院进行采集；时间：2017.1～2017.10；数量：192个；方法：按照实施例4所述的方法进行检测，所采用的杂交体系与实施例4一致，所采用的结果判定方法与实施实例5一致。结果：其中，183例通过芯片杂交，获得理想检测结果；9例由于胎儿发育较为缓慢等原因，导致孕妇外周血中的胎儿cf-fdna较少，杂交检测结果不理想，因此，在这9例孕妇怀孕7～8周的时候进行了第二次采集，同样采用实施例4所述的方法进行检测，最后成功得到了杂交信号。具体的杂交检测结果以及实际的结果如下表2所示，实际结果为产后跟踪观察、检测所得到的结果。表2检测结果以及预测结果检测结果数量预测结果实际结果阳性42例患有双侧杯状耳畸形双侧杯状耳畸形阴性141例未患有双侧杯状耳畸形表型正常由此可知，通过跟踪上述被检测的183例孕妇，结果发现，显示阳性的孕妇所生的婴儿均表现为明显的双侧杯状耳畸形，显示阴性的孕妇所生的婴儿正常，不具有双侧杯状耳畸形的外观特征。则可进一步获知，本申请基因芯片中固定的探针特异性强，准确率高，本发明中的方法预测精确，可精确到100％，使得孕妇能够及早知道胎儿情况，有助于及早进行治疗或干预，对于优生优育具有极其重要的价值。更重要的是，在孕妇怀孕4～5周，几乎是刚发现怀孕时，97％左右的孕妇便能够进行该项目的检测，最晚8周便能检测到，从而进行较为精确的预估；当然8周以后更能检测到，但越早检测到意义越大。例外，本实施例中采集样本是在孕妇同意的情况下，用其产检常规所采的血液进行试验。需要说明的是，本实施例中采集的所有样本均是在30～60分钟便得到最终结果，速度快，效率高，准确度高。而且本实施例中采集的所有样本均是在孕妇同意的情况下，用其产检常规所采的血液进行试验。在本发明中，所采用的基因芯片中的探针序列特异性强，若改变其中一条或几条探针中的某一个或某几个碱基，则特异性大大降低，导致误差率高。而且本申请试剂盒中的引物组序列也具有极强的特异性，改变某些引物组中的碱基位点，也会对结果的准确表达具有极其影响，本发明人通过多年的研究测试验证等，得到了高特异性、高精确度的本申请中的探针和引物组序列。hmx1调控区域片段的拷贝数变化(cnv)与双侧杯状耳畸形家系的发生存在连锁共分离，与双侧杯状耳畸形的发生直接相关，因此，本发明主要是针对hmx1调控区域片段进行的研究，效果惊喜。本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。当前第1页12