痛风差异表达基因检测与急性发作预警试剂盒的制作方法

本发明涉及应用于医学基础研究以及痛风性关节炎急性发作早期预警和临床诊断的分子生物学
技术领域：
，特别涉及一种痛风差异表达基因检测与急性发作预警试剂盒。
背景技术：
：痛风(gout)是由单钠尿酸盐(msu)沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，特指急性特征性关节炎和慢性痛风石疾病，主要包括急性发作性关节炎、痛风石形成、痛风石性慢性关节炎、尿酸盐肾病和尿酸性尿路结石，重者可出现关节残疾和肾功能不全，常伴腹型肥胖、高脂血症、高血压、2型糖尿病及心血管病等表现，目前已成为危害人类健康的常见病、多发病。临床上痛风检查包括血尿酸测定、尿尿酸测定、尿酸盐检查、影像学检查、超声检查等，其中尿酸盐检查是当前不可替代的金标准：偏振光显微镜下表现为负性双折光的针状或杆状的单钠尿酸盐晶体，急性发作期，可见于关节滑液中白细胞内、外；也可见于在痛风石的抽吸物中；在发作间歇期，也可见于曾受累关节的滑液中。但该检测方法会带给患者创伤和较重的痛感，且关节滑液的穿刺吸取比较困难，所以需要敏感而特异性的无创性指标，从分子水平上提高对痛风的预警能力。越来越多的证据显示，msu晶体介导的炎症属于先天固有免疫反应范畴，主要涉及tlr4—nf-κb—il-1β、nlrp3炎症体信号通路，已有的多组学研究表明，tlr2、tlr4、nlrp3、il1b、p2rx7和cxcl8等炎症因子对于痛风炎症的发展至关重要，有可能作为预警痛风急性发作的生物标记物。toll样受体(toll-likereceptors，tlrs)为i型跨膜蛋白，主要特点是结构功能区富含亮氨酸重复序列(lrrs结构)，可介导对病原相关分子模式(pamps)/损伤相关分子模式(damps)的识别，其与细胞外配体结合触发细胞活化和增生。研究显示缺乏tlr2或tlr4的小鼠骨髓源性巨噬细胞吞噬msu晶体能力下降，释放的促炎性细胞因子il-1β和肿瘤坏死因子α(tnf-α)也减少，提示这些tlr受体在msu诱导的炎症反应中必不可少。toll样受体还可能通过调节il-1β前体的合成发挥间接作用。胞内的nlrs(nod-likereceptors，nod样受体)同tlrs一样是固有免疫系统对病原体的重要感受器，广泛参与对病原体上pamps的识别，同时也可感知内源性damps，产生相应的炎症应答反应。其典型代表nlrp3可识别并结合尿酸钠晶体、atp、内毒素和细胞裂解产物等“危险信号”启动炎症反应。白细胞介素1β(il-1β)也被称为白细胞热原，白细胞内源性介质，单核细胞因子，淋巴细胞活化因子等，是固有免疫反应中起关键作用的前炎症因子，作为免疫和炎症反应的介质，参与许多生物过程。p2rx7蛋白属于atp的嘌呤受体家族，可作为模式识别受体参与细胞外atp介导的凋亡细胞死亡、受体运输调节、肥大细胞脱颗粒和炎症。多个研究小组证实细胞外atp是激活nlrp3炎性体的重要危险信号。一些研究还表明，细胞外atp对nlrp3炎性体的激活需要嘌呤受体p2rx7与泛连接蛋白1(pannexin-1)通道的共同活化。白细胞介素8(il8)、趋化因子(c-x-c基序)配体8(cxcl8)，是cxc亚家族的典型趋化因子，也称为嗜中性粒细胞趋化因子，是先天免疫系统反应中的重要介质，可诱导靶细胞(主要是嗜中性粒细胞以及其他粒细胞)趋化，使其向感染部位迁移并发挥吞噬作用。有研究表明痛风患者的循环cxcl8水平升高，并且cxcl8相关蛋白质组与糖尿病、心血管并发症有关。综上所述，鉴于tlr2、tlr4、nlrp3、il1b、p2rx7、cxcl8等基因在高尿酸血症和痛风疾病中体现出来的相关性，可以通过检测这些痛风发生相关基因来及时预警痛风的急性发作，从而有针对性地预防和治疗痛风，这对于降低痛风发病率、控制患者病情有非常重要的意义。本发明利用多重荧光定量pcr方法检测外周血单核细胞中上述痛风差异表达基因以及内参照基因的表达水平，以实现对痛风的无创准确诊断、预警及早期治疗。目前以mrna标志物来预警痛风急性发作的方法还未有报道。单核细胞基因表达水平的检测主要包括以下几个步骤：单核细胞分离、mrna提取、逆转录合成cdna和荧光定量pcr反应检测相应cdna的含量。其中前3个步骤均可以使用市场上已有的试剂盒来完成，因此本发明只针对最后一步，即荧光定量pcr反应检测上述6个痛风差异表达基因及2个内参照基因的cdna的含量。荧光定量pcr技术具有准确性高、重复性好等特点，可对检测对象在很大跨度范围内进行精确定量，已广泛用于基因表达研究、病原体检测、snp分析及基因分型等诸多领域。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种痛风差异表达基因检测与急性发作预警试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种痛风差异表达基因检测与急性发作预警试剂盒，包括：与2种内参照基因actb、gapdh及6种痛风性关节炎急性发作期差异表达基因il1b、p2rx7、cxcl8、tlr2、tlr4、nlrp3互补配对的特异性引物探针seqidno.1-93。优选的是，actb探针为seqidno.8，其使用的荧光基团为fam；gapdh探针为seqidno.11、18中的任意一种，其使用的荧光基团为tamra；tlr2探针为seqidno.24、27、30、36)中的任意一种，其使用的荧光基团为cy5；tlr4探针为seqidno.43、46中的任意一种，其使用的荧光基团为rox；nlrp3探针为seqidno.53、56中的任意一种，其使用的荧光基团为joe；il1b探针为seqidno.63、66中的任意一种，其使用的荧光基团为cy5；p2rx7探针为seqidno.74、77中的任意一种，其使用的荧光基团为rox；cxcl8探针为seqidno.84、90、93中的任意一种，其使用的荧光基团为joe。优选的是，与actb基因cdna互补配对的特异性引物为seqidno.1-7中任意一对匹配的正向引物和反向引物；与gapdh基因cdna互补配对的特异性引物为seqidno.9、10、12-17中任意一对匹配的正向引物和反向引物；与tlr2基因cdna互补配对的特异性引物为seqidno.19-23、25、26、28、29、31-35中任意一对匹配的正向引物和反向引物；与tlr4基因cdna互补配对的特异性引物为seqidno.37-42、44、45中任意一对匹配的正向引物和反向引物；与nlrp3基因cdna互补配对的特异性引物为seqidno.47-52、54、55中任意一对匹配的正向引物和反向引物；与il1b基因cdna互补配对的特异性引物为seqidno.57-62、64、65中任意一对匹配的正向引物和反向引物；与p2rx7基因cdna互补配对的特异性引物为seqidno.67-73、75、76中任意一对匹配的正向引物和反向引物；与cxcl8基因cdna互补配对的特异性引物为seqidno.78-83、85-89、91、92中任意一对匹配的正向引物和反向引物。优选的是，还包括用于2管多重荧光定量pcr的第一管pcr反应液和第二管pcr反应液。优选的是，所述第一管pcr反应液包括actb正向引物、actb反向引物、actb探针、gapdh正向引物、gapdh反向引物、gapdh探针、tlr2正向引物、tlr2反向引物、tlr2探针、tlr4正向引物、tlr4反向引物、tlr4探针、nlrp3正向引物、nlrp3反向引物和nlrp3探针。优选的是，所述第一管pcr反应液还包括无mg2+离子pcr缓冲液、mg2+、dntp混合液和热启动聚合酶。优选的是，所述第一管pcr反应液总各组分的反应终浓度分别为：优选的是，所述第二管pcr反应液包括actb正向引物、actb反向引物、actb探针、gapdh正向引物、gapdh反向引物、gapdh探针、il1b正向引物、il1b反向引物、il1b探针、p2rx7正向引物、p2rx7反向引物、p2rx7探针、cxcl8正向引物、cxcl8反向引物和cxcl8探针。优选的是，所述第二管pcr反应液还包括无mg2+离子pcr缓冲液、mg2+、dntp混合液和热启动聚合酶。优选的是，所述第二管pcr反应液总各组分的反应终浓度分别为：本发明的有益效果是：本发明提供一个高灵敏度、高特异性的可以在2管荧光定量pcr反应中同时检测2种内参照基因(actb、gapdh)和6种痛风性关节炎急性发作期差异表达基因(il1b、p2rx7、cxcl8、tlr2、tlr4、nlrp3)的表达水平的方法以及基于此方法的痛风差异表达基因检测与急性发作预警试剂盒，本发明的试剂盒检测灵敏度高、特异性强、准确度高。附图说明图1为本发明的实施例中的第一管荧光定量pcr反应检测actb、gapdh、tlr2、tlr4、nlrp3基因的浓度梯度标准品所得的扩增曲线图；图2为本发明的实施例中的第二管荧光定量pcr反应检测actb、gapdh、il1b、p2rx7、cxcl8基因的浓度梯度标准品所得的扩增曲线图；图3为本发明的实施例中的本发明荧光定量pcr反应检测浓度梯度标准品所得的平均ct值与每反应拷贝数对数的线性关系图；图4为本发明的实施例中的本发明试剂盒对单基因标准品及相应竞争标准品的检测结果对比图。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。本发明的目的是提供一个高灵敏度、高特异性的可以在2管荧光定量pcr反应中同时检测2种内参照基因(actb、gapdh)和6种痛风性关节炎急性发作期差异表达基因(il1b、p2rx7、cxcl8、tlr2、tlr4、nlrp3)的表达水平的方法以及基于此方法的痛风急性发作预警试剂盒。本发明的痛风差异表达基因检测与急性发作预警试剂盒包括设计的与上述2种内参照基因、6种痛风性关节炎急性发作期差异表达基因cdna互补配对的特异性引物和探针(seqidno.1-93)，其中(1)肌动蛋白β(actb)探针(seqidno.8)使用的荧光基团为fam；(2)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)探针(seqidno.11、18)使用的荧光基团为tamra；(3)toll样受体2(tlr2)探针(seqidno.24、27、30、36)使用的荧光基团为cy5；(4)toll样受体4(tlr4)探针(seqidno.43、46)使用的荧光基团为rox；(5)nlrfamilypyrindomaincontaining3(nlrp3)探针(seqidno.53、56)使用的荧光基团为joe；(6)白细胞介素-β(il1b)探针(seqidno.63、66)使用的荧光基团为cy5；(7)嘌呤受体p2x7(p2rx7)探针(seqidno.74、77)使用的荧光基团为rox；(8)c-x-c基序趋化因子配体8(cxcl8)探针(seqidno.84、90、93)使用的荧光基团为joe；(9)与肌动蛋白β(actb)基因cdna互补配对的特异性引物(seqidno.1-7中任意一对匹配的正向引物和反向引物)；(10)与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因cdna互补配对的特异性引物(seqidno.9、10、12-17中任意一对匹配的正向引物和反向引物)；(11)与toll样受体2(tlr2)基因cdna互补配对的特异性引物(seqidno.19-23、25、26、28、29、31-35中任意一对匹配的正向引物和反向引物)；(12)与toll样受体4(tlr4)基因cdna互补配对的特异性引物(seqidno.37-42、44、45中任意一对匹配的正向引物和反向引物)；(13)与nlrfamilypyrindomaincontaining3(nlrp3)基因cdna互补配对的特异性引物(seqidno.47-52、54、55中任意一对匹配的正向引物和反向引物)；(14)与白细胞介素-β(il1b)基因cdna互补配对的特异性引物(seqidno.57-62、64、65中任意一对匹配的正向引物和反向引物)；(15)与嘌呤受体p2x7(p2rx7)基因cdna互补配对的特异性引物(seqidno.67-73、75、76中任意一对匹配的正向引物和反向引物)；(16)与c-x-c基序趋化因子配体8(cxcl8)基因cdna互补配对的特异性引物(seqidno.78-83、85-89、91、92中任意一对匹配的正向引物和反向引物)。其中，具体引物和探针的基因序列如下表1：表1：引物和探针的基因序列表其中，表1中引物和探针基因名之后的后缀中，第一个数字代表pcr靶序列区域编号，f代表正向引物，r代表反向引物，p代表探针。如actb-1-f1、actb-1-r1和actb-1-p指的是actb靶序列区域1的正向引物、反向引物和探针。本发明的痛风差异表达基因检测与急性发作预警试剂盒还包括用于2管多重荧光定量pcr的pcr反应液。2管pcr反应液配方见下表2和3：表2：第一管pcr反应液表3：第二管pcr反应液名称反应终浓度浓度单位无mg2+离子pcr缓冲液1xmg2+2-12mm4种dntp混合液0.1-0.4mmactb正向引物0.1-0.4μmactb反向引物0.1-0.4μmactb探针0.01-0.1μmgapdh正向引物0.1-1.0μmgapdh反向引物0.1-1.0μmgapdh探针0.01-0.2μmil1b正向引物0.1-0.6μmil1b反向引物0.1-0.6μmil1b探针0.01-0.1μmp2rx7正向引物0.1-0.9μmp2rx7反向引物0.1-0.9μmp2rx7探针0.01-0.1μmcxcl8正向引物0.1-0,9μmcxcl8反向引物0.1-0,9μmcxcl8探针0.01-0.1μm热启动聚合酶(taq)0.01-0.3u/μl为了验证本发明试剂盒的技术性能，本发明还制备了8个分别包含上述2种内参照基因和6种痛风性关节炎急性发作期差异表达基因cdna的质粒，并与变性鲱鱼精dna混合来制备不同组份及不同浓度的标准品，以对发明试剂盒的技术性能进行测试验证，具体如以下实施例。实施例1：为了验证本发明试剂盒能够在大跨度浓度范围内定量检测这8种基因，本发明制备了各基因的10倍稀释的浓度梯度标准品。使用本发明试剂盒进行荧光定量pcr反应所得结果如表4和图1、2、3所示，在106浓度跨度范围内本发明pcr反应可以定量检测相应基因。表4.本发明试剂盒检测8种基因浓度梯度标准品所得结果(ct值)。其中，“/”代表未检测。实施例2：为了验证在多个差异表达基因和内参照基因同时表达时，高浓度表达基因的pcr反应是否干扰低浓度表达基因的pcr反应，本发明制备了各基因的竞争标准品。每个竞争标准品中包含对应于每管荧光定量pcr反应所检测的5种cdna，其中目标cdna模板浓度为103拷贝/反应，其余4种竞争cdna模板浓度均为107拷贝/反应。使用本发明试剂盒进行荧光定量pcr反应所得结果如表5和图4所示，103拷贝/反应的单基因标准品和相应的竞争标准品的检测结果非常相近。这一结果表明在浓度差异达到104时，本发明试剂盒对低浓度靶标的检测效果不受高浓度靶标检测反应的影响。表5.本发明试剂盒检测103拷贝/反应的单基因标准品和相应的竞争标准品所得结果*单基因标准品：只包含目标cdna，其浓度为103拷贝/反应。**竞争标准品：包含浓度为103拷贝/反应的目标cdna和其余4个浓度为107拷贝/反应的竞争cdna。例如：针对管1反应的actb竞争标准品中，actbcdna浓度为103拷贝/反应，gapdh、tlr2、tlr4和nlrp3这4个竞争cdna的浓度分别为107拷贝/反应。***δct＝竞争标准品目标cdna的ct值-单基因标准品目标cdna的ct值。图1示出了本发明第一管荧光定量pcr反应检测actb、gapdh、tlr2、tlr4、nlrp3基因的浓度梯度标准品所得的扩增曲线。各基因的浓度梯度区间为10～108拷贝/反应。各浓度梯度的检测反应依次包含6/4/4/2/2/2/2/2个技术重复。图2示出了本发明第二管荧光定量pcr反应检测actb、gapdh、il1b、p2rx7、cxcl8基因的浓度梯度标准品所得的扩增曲线。各基因的浓度梯度区间为10～108拷贝/反应。各浓度梯度的检测反应依次包含6/4/4/2/2/2/2/2个技术重复。图3示出了本发明荧光定量pcr反应检测浓度梯度标准品所得的平均ct值与每反应拷贝数对数的线性关系。图4示出了本发明试剂盒对单基因标准品及相应竞争标准品的检测结果对比图，可见，本发明试剂盒对单基因标准品及相应竞争标准品的检测结果非常相近。标准品溶液的组成和各组份的浓度见表5。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。发明名称：痛风差异表达基因检测与急性发作预警试剂盒编号名称序列5’-3’两端修饰seqidno.1actb-1-f1accctggcattgccgacaseqidno.2actb-1-f2attgccgacaggatgcagseqidno.3actb-1-f3ggcacccagcacaatgaaseqidno.4actb-1-r1gccgatccacacggagtaseqidno.5actb-1-r2ggacagcgaggccaggatseqidno.6actb-1-r3tgcttgctgatccacatctseqidno.7actb-1-r4ctcctgcttgctgatccacseqidno.8actb-1-pagatcattgctcctcctgagcgca5'-fam,3'-bhq1seqidno.9gapdh-1-fggtgtgaaccatgagaagtatseqidno.10gapdh-1-ratgagtccttccacgatacseqidno.11gapdh-1-pagcctcaagatcatcagcaatgcc5'-tamra,3'-bhq2seqidno.12gapdh-2-f1tatgacaacagcctcaagatcaseqidno.13gapdh-2-f2acagcctcaagatcatcagcaseqidno.14gapdh-2-r1tcatgagtccttccacgatacseqidno.15gapdh-2-r2actgtggtcatgagtccttcseqidno.16gapdh-2-r3cttctgggtggcagtgatgseqidno.17gapdh-2-r4tggcatggactgtggtcatseqidno.18gapdh-2-pcaccaccaactgcttagcacccct5'-tamra,3'-bhq2seqidno.19tlr2-1-f1cctccaggctctggtgctgaseqidno.20tlr2-1-f2ctctggtgctgacatccaatseqidno.21tlr2-1-f3ggaattaacacaatagaggaseqidno.22tlr2-1-r1ccctagggttttgtaaggattseqidno.23tlr2-1-r2gtttcccctagggttttgtaaseqidno.24tlr2-1-ptcttcctggttcaagcccctttctt5'-cy5,3'-bhq2seqidno.25tlr2-2-faggatctttaaactccattccseqidno.26tlr2-2-rgtgttaattccattggatgtcseqidno.27tlr2-2-paggatcacctacattagcaacagt5'-cy5,3'-bhq2seqidno.28tlr2-3-fattggccagcaaattacctseqidno.29tlr2-3-rggcggacatcctgaacctseqidno.30tlr2-3-pctctccatcccatgtgcgtggcca5'-cy5,3'-bhq2seqidno.31tlr2-4-f1aaaagccttgacctgtccaaseqidno.32tlr2-4-f2acctacagaggtgtgtgaaseqidno.33tlr2-4-f3acagtgacctacagaggtgseqidno.34tlr2-4-r1tgttcaagactgcccagggseqidno.35tlr2-4-r2ctgcccagggaagaaaaaseqidno.36tlr2-4-pcctccaggctctggtgctgacatc5'-cy5,3'-bhq2seqidno.37tlr4-1-f1atcccagccatggccttccseqidno.38tlr4-1-f2ctgcgtgagaccagaaagseqidno.39tlr4-1-r1gaggttgtcggggattttseqidno.40tlr4-1-r2ggttgagaaggggaggttseqidno.41tlr4-1-r3caggtccaggttcttggtseqidno.42tlr4-1-r4aaagctcaggtccaggttseqidno.43tlr4-1-pctgggagccctgcgtggaggtgg5'-rox,3'-bhq2seqidno.44tlr4-2-ftggccttcctctcctgcgtseqidno.45tlr4-2-rcaggtccaggttcttggttseqidno.46tlr4-2-ptattacttatcaatgcatggagctg5'-rox,3'-bhq2seqidno.47nlrp3-1-f1ggtgaattctggccttacgtcseqidno.48nlrp3-1-f2ggccttacgtcagtctgttgseqidno.49nlrp3-1-f3cagtctgttgttcagctttgseqidno.50nlrp3-1-r1taattccaacacctgaagcttseqidno.51nlrp3-1-r2gaggttgcagttgtctaattcseqidno.52nlrp3-1-r3tgacgtgaggttgcagttseqidno.53nlrp3-1-pcctttacctgcgaggcaacactct5'-joe,3'-bhq1seqidno.54nlrp3-2-ftaacattcggagattgtggseqidno.55nlrp3-2-rccaaccagagcttcttcaseqidno.56nlrp3-2-pggagctggacctgagtgacaacg5'-joe,3'-bhq1seqidno.57il1b-1-f1ctttgaagctgatggccctaaaseqidno.58il1b-1-f2gctgatggccctaaacagatgseqidno.59il1b-1-f3ggccctaaacagatgaagtgcseqidno.60il1b-1-r1ggtggtcggagattcgtagseqidno.61il1b-1-r2tgaagcccttgctgtagtgseqidno.62il1b-1-r3gcttgtccatggccacaaseqidno.63il1b-1-pacctctgccctctggatggcggca5'-cy5,3'-bhq2seqidno.64il1b-2-faagctgaggaagatgctggtseqidno.65il1b-2-rtaagcctcgttatcccatgtseqidno.66il1b-2-paagatgaagggaaagaaggtgct5'-cy5,3'-bhq2seqidno.67p2rx7-1-f1tttgacaccgcagactacacseqidno.68p2rx7-1-f2tcgtgatgacaaactttctcseqidno.69p2rx7-1-f3gccaagagcagcggttgtseqidno.70p2rx7-1-f4cggttgtgtcccgagtatccseqidno.71p2rx7-1-r1tccggtctgaattcctttgcseqidno.72p2rx7-1-r2caccttccggtctgaattccseqidno.73p2rx7-1-r3gtcttctggttcccttcatacseqidno.74p2rx7-1-paggacgctctgttcctctgaccga5'-rox,3'-bhq2seqidno.75p2rx7-2-ftgtctttgacaccgcagaseqidno.76p2rx7-2-rggtccatccatccctttttaseqidno.77p2rx7-2-pttcgtgatgacaaactttctcaaa5'-rox,3'-bhq2seqidno.78cxcl8-1-f1cacaagcttctaggacaagseqidno.79cxcl8-1-f2caagagccaggaagaaaccseqidno.80cxcl8-1-f3aaaccaccggaaggaaccseqidno.81cxcl8-1-f4ccggaaggaaccatctcacseqidno.82cxcl8-1-r1tcaggaaggctgccaagagseqidno.83cxcl8-1-r2cacacagagctgcagaaatseqidno.84cxcl8-1-paaacatgacttccaagctggccgt5'-joe,3'-bhq1seqidno.85cxcl8-2-ftttccaccccaaatttatcaaaseqidno.86cxcl8-2-r1agctctcttccatcagaaagseqidno.87cxcl8-2-r2acagagctctcttccatcagseqidno.88cxcl8-2-r3gggtccagacagagctctctseqidno.89cxcl8-2-r4aaaacttctccacaaccctcseqidno.90cxcl8-2-pgagtggaccacactgcgccaaca5'-joe,3'-bhq1seqidno.91cxcl8-3-fcaaggagtgctaaagaacseqidno.92cxcl8-3-rgaattctcagccctcttcaseqidno.93cxcl8-3-pttatcaaagaactgagagtgattg5'-joe,3'-bhq1当前第1页12