一种中华鳖基因组微卫星多重PCR体系构建方法与流程

本发明涉及一种微卫星标记多重pcr体系的构建方法，特别是涉及了一种基于中华鳖基因组信息构建微卫星标记多重pcr体系的方法。

背景技术：

微卫星标记是一种共显性的分子标记，由动、植物基因组中多次重复的重复单元(motif，通常为1～6个碱基)和两侧的侧翼序列构成。微卫星标记具有变异程度高，在基因组中分布广泛，符合孟德尔遗传，易于pcr扩增等特点，是群体遗传、亲子鉴定、遗传管理中最常使用的分子标记。

微卫星标记传统上的基因分型方法是，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将pcr产物中不同片段大小的等位基因进行分离，通过银染方式对目的条带进行显色。理论上，聚丙烯酰胺凝胶电泳方法可以区分1bp-2bp碱基差异的等位基因，但该技术存在处理通量低的技术弊端，通常每个泳道通常只能处理一个位点或一组多重pcr体系，对于标记的扩增性及等位基因分布区间均有较为严格的要求。近年来，随着毛细管电泳技术的普及，利用荧光接头，构建微卫星多重pcr体系已经成为微卫星标记应用的主流技术。毛细管电泳使用液态基质，具有电泳速度快，分析精读高，可实现自动上样的技术优点，大大增加了微卫星标记的处理通量及基因分型的精度。同时，利用不同颜色荧光接头进行区分，可实现在一个上样孔同时对多组pcr产物的分型。

目前，制约微卫星标记多重pcr体系应用的技术难点在于，微卫星位点的开发项费时费力。近年来，随着下一代测序技术(ngs)的发展，公共数据库成为获取微卫星位点序列信息的重要资源。利用公共数据库的资源，通过生物信息学的分析手段，可以在短时间内筛选到大量的微卫星序列，用于后期的开发验证工作。

微卫星标记在水产动物的遗传育种研究中有着广泛的应用。不同于其他物种，多数水产动物具有极强的繁殖力，一对亲本可产生数以万计的子代个体，这无疑给水产动物的遗传管理增加了不小的技术难度。如何提高微卫星标记的应用效率，降低基因分型的成本，是水产动物分子标记辅助育种(mas)顺利实施的重要保证。多重pcr体系构建，尤其是构建10×以上的pcr体系，为该问题解决提供了技术思路。

中华鳖是我国重要的名特优水产水产养殖品种，我国商品鳖目前的年产量基本稳定在33万吨，约占淡水养殖总量的1.2％。目前，中华鳖的人工选育工作已开展多年，但分子标记的开发研究却存在一定程度的滞后，这无疑阻碍了中华鳖遗传育种工作的研究进程。针对上述问题，本发明提供一种快速构建中华鳖10×以上多重pcr的技术方法，可为中华鳖家系鉴定，遗传育种以及群体遗传研究提供研究工具。

技术实现要素：

本发明提供了一种使用公共数据，快速构建中华鳖10×以上多重pcr体系的技术方法，本发明具体的技术方案如下：

1、使用公共数据库，获取中华鳖基因组序列。

2、使用misa软件对上述中华鳖基因组序列进行分析，查找和定位序列中的微卫星位点。

3、使用primer3对上述微卫星位点进行批量引物设计。

4、根据产物大小分布情况，将全部位点按照产物大小进行区间分组，每80bp-100bp设置一个分组区间；从每组中随机选取10-15个标记/套多重pcr体系，合成选取的全部位点的上下游引物。

5、使用8个或以上中华鳖个体基因组检验上述微卫星位点的多态性以及引物的扩增情况，剔除产物不能扩增或者pcr产物无多态性的位点。

6、按照步骤4的分组，使用autodimer软件计算步骤5中保留位点引物组内和组间上下游序列的相容性，保留组内和组间引物序列相容性最强的10-12个位点。

7、将步骤6保留的位点按照步骤4分组，将每组中每个位点上游引物的5’端分别标记一种颜色的荧光，重新合成上游引物；上游引物标记荧光，可选择包含m13(-21)通用引物在内的已经过实验验证具备扩增通用性的接头序列，使用m13-ssr方法进行pcr扩增，也可将荧光基团直接标记在每个位点上游引物的5’端，进行常规pcr反应。

8、将步骤7中每个位点按照上游引物0.4μm，下游引物10μm的浓度配制引物预混液，然后将全部位点的引物预混液等体积混合配制多重pcr引物工作液，构建微卫星多重pcr反应体系。

9、使用常规pcr方法，使用毛细管电泳对步骤5所述的中华鳖个体进行基因分型，检验多重pcr体系的扩增效率。根据实验结果，调整体系中各位点之间的引物浓度比例，以达到最佳扩增效果。

本发明有如下技术优点：

1、充分利用了现有的公共数据库资源，可在短时间内获取大量微卫星位点信息，降低了开发标记的成本。

2、构建的多重pcr体系标记通量高，可在一个反应体系中实现10个以上的位点分型，节约了试剂及耗材的投入，提高了遗传分析实验的效率。

3、分型结果准确，使用了荧光毛细管电泳的技术手段作为微卫星位点的分型方法，基因分型的结果快速、准确。

附图说明

图1为本发明主要技术特征的流程图。

图2为本发明实施例中构建的多重pcr体系基因分型结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细阐述。实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或遵照厂商说明书建议的条件。实施例中所用的试剂及仪器，如无特别说明，均从常规生物制品代理商处购得。

1、中华鳖基因组信息的获得

使用公共数据库，获取中华鳖基因组序列，中华鳖基因组序列的下载地址为ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/pelodiscussinensis/chrun/。

2、微卫星位点序列信息的获取

使用misa软件对上述中华鳖基因组序列进行分析，查找和定位序列中的微卫星位点。为简化数据分析中的计算量，本实施例仅使用中华鳖基因组的一个scaffold(nw_005855045.1)。misa软件的参数设置为，definition(unit_size，min_repeats)：2-63-54-5，interruptions(max_difference_for_2_ssrs)：100。中华鳖微卫星位点的碱基重复单元分布情况见表1。

表1中华鳖基因组微卫星碱基重复单元分布

3、微卫星位点引物序列设计

使用primer3对上述微卫星位点进行批量引物设计，primer3软件的参数设置为，primer_product_size_range＝100-400；primer_max_end_stability＝250。

4、位点分组及多态性验证

把全部位点按照产物大小90bp-180bp，180bp-260bp，260bp-400bp分为3组，从每组中随机选取12个标记/套多重pcr体系，合成选取的全部位点的上下游引物。使用随机选取的30只中华鳖个体基因组dna检验上述微卫星位点引物的扩增效率及位点的多态性，剔除其中产物不能扩增或者pcr产物无多态性的位点。pcr反应程序根据taq酶的说明书进行设置，毛细管电泳使用abi3130遗传分析仪。

5、多重pcr位点的筛选

使用autodimer软件计算步骤4中保留位点引物组内和组间上下游序列的相容性，保留组内和组间引物序列相容性最强的12个位点。将每组中每个位点上游引物的5’端分别标记一种颜色的荧光，重新合成每个位点的上游引物。atuodimer软件的参数设置为，minimumscorerequirement＝7，na⁺(molar)＝0.085。12个位点的引物信息见表2。

表2中华鳖12×微卫星多重pcr体系位点信息

6、多重pcr反应体系的构建

将上述位点按照上游引物0.4μm，下游引物10μm的浓度配制引物预混液，然后将全部位点的引物预混液等体积混合配制多重pcr引物工作液，按照表3的反应体系进行多重pcr扩增。

表3中华鳖12×微卫星多重pcr反应体系

7、多重pcr体系扩增效率检验

使用步骤4的30只中华鳖个体检验上述12×中华鳖微卫星多重pcr体系。以多重pcr成功扩增样本数目/全部位点单独扩增成功样本数目，计算多重pcr的扩增效率。结果表明，该12×中华鳖微卫星多重pcr体系扩增效率为99.89％，多重pcr中位点的基因分型结果与每个位点单独扩增分型结果一致。

上述具体实施方式是对本发明的具体细节进行的阐述。本领域的一般技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改、添加和替换都是可能的，都属于本发明要求的保护范围。