一种利用蛋白酶制备脱脂豆粕贮铁多肽的方法和应用与流程

本发明属于食品技术领域，尤其是一种利用蛋白酶制备脱脂豆粕贮铁多肽的方法和应用。

背景技术：

铁缺乏症是一类严重影响人类健康的疾病。世界卫生组织2016年统计数据表明全球有20亿人患有铁缺乏症，具体表现为精神萎靡、厌食、生长发育迟缓、经常头晕、注意力不集中、理解记忆力差等症状。目前市场上使用的补铁制剂主要是二价的非血红素铁，如无机亚铁类(feso4)以及有机酸亚铁盐类(葡萄糖酸亚铁等)。然而由于这些补铁剂的铁吸收率不高，导致补铁效果不理想，甚至具有一定的副作用从而发生铁中毒症状。因此，开发天然高效的补铁产品势在必行。

大豆豆粕是大豆经过提取豆油油脂后得到的副产品。近十年，我国豆粕产量快速增长，年复合增长率为9.36％，且最近几年依然保持着10％左右的增速，2015年豆粕产量为6120万吨，约占世界豆粕产量的26.92％。1993年以来，我国豆粕供给量始终大于消费量。并且，由于豆粕具有不易保存的特点，一旦豆粕库存增加，还容易引起豆粕霉变，严重影响了其利用水平。目前，大豆豆粕的主要利用途径是牲畜和家禽的饲料原料，有少量用于制作糕点食品、健康食品及化妆品，此外还用作抗菌素原料使用。然而，其利用水平仍然较低，寻求豆粕资源的高效利用成为农业及食品行业关注的热点问题。

大豆在油脂浸出加工产出过程中主要产物为大豆豆粕和油脂，大豆组成中的大部分蛋白质组分保留在了豆粕中。研究表明，豆粕典型成分中，区别于其他食品的主要成分之一即是大豆铁蛋白。每分子大豆铁蛋白含有2500-4000个铁离子，它蕴藏着非常丰富的铁资源；并且，相对于其他补铁制剂，大豆铁蛋白具有补铁活性高、绿色、安全的特点。每分子大豆铁蛋白通常是由24个亚基组成的中空球状分子，其分子量约为560kda，每个亚基分子量为28kda和26.5kda。目前，铁蛋白作为补铁制剂在应用上具有以下缺点：首先，铁蛋白较大的分子构象容易受到加工条件如高温、ph的影响，容易导致蛋白质聚合现象，溶解性及稳定性降低，影响了蛋白质稳定性及铁吸收效果；其次，铁蛋白在肠胃道内极不稳定，复杂的肠胃环境(如消化酶、低ph、食物组分)促进了蛋白质的降解，加速了铁离子的释放，影响了补铁效果。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种利用蛋白酶制备脱脂豆粕贮铁多肽的方法和应用，该方法通过酶解与分离纯化技术获得分子量更低的贮铁多肽，以使其更容易被人体吸收利用，从而提高铁的生物利用度和补铁效率，该方法制得的贮铁多肽能够应用在食品添加剂、饲料、保健食品等行业中。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种利用蛋白酶制备脱脂豆粕贮铁多肽的方法，步骤如下：

以脱脂的大豆豆粕为原料，利用水提法提取并分离铁蛋白，通过蛋白酶解技术获得含铁多肽组分，并进一步应用分级超滤技术得到具有高铁含量的贮铁多肽。

而且，具体步骤如下：

⑴利用脱脂的大豆豆粕为原料，使用0.05-0.10m磷酸缓冲液浸泡豆粕，所述磷酸缓冲液的ph为7.0，且其含质量百分数为1％的聚乙烯吡烷酮，磷酸缓冲液：豆粕质量比为10-15:1，浸泡时间为6-8h，然后使用内切式匀浆机匀浆2-3min，得蛋白粗提液；

⑵向蛋白粗提液中加入浓度为50-100mm的mgcl2晶体，溶解后立即4500-5000g离心5-10min，弃沉淀，得上清液；

⑶上清液静置20-30min后，加入浓度为70-100mm的柠檬酸三钠晶体，静置6-24h，经10000-12000g离心20-30min后，得沉淀和离心后上清液，沉淀即为大豆铁蛋白，该大豆铁蛋白不复溶于该离心后上清液；

⑷在离心获得的沉淀中加入其1.5-3倍体积的离心上清液，冲洗沉淀中的淀粉和核糖体，然后10000g离心5-10min，弃上清，重复一至两次以上，直至只有褐色沉淀；

将沉淀溶于1.5倍体积蒸馏水中，10000g离心5-10min，弃上清；重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，13000g离心5-10min，收集并合并上清液，获得豆粕大豆铁蛋白，该豆粕大豆铁蛋白的浓度为1.0-2.0μm，其ph值为6.5-7.0；

⑸向豆粕大豆铁蛋白中加入蛋白酶进行酶解，酶解参数为：酶浓度1000-2000u、底物铁蛋白浓度1.0-2.0μm、反应时间4h-6h、反应ph6.5-7.0、反应温度55-60℃，酶解后，即获得粗贮铁多肽；

⑹对粗贮铁多肽进行超滤，使用超滤膜分级超滤，其截留分子量分别为1.5和3.0kda，获得截留组分，即得贮铁多肽。

而且，所述步骤⑸中蛋白酶为木瓜蛋白酶。

而且，所述步骤⑹的具体步骤为：

分级超滤多肽，通过两步超滤多肽组分：首先利用3.0kda膜截留获得3.0kda以下多肽片段，再经1.5kda截留，获得该截留分子量以上片段，得到目标分子量2.0-3.0kda范围的多肽，即得贮铁多肽。

如上所述的利用蛋白酶制备脱脂豆粕贮铁多肽的方法制得的贮铁多肽在食品添加剂、饲料、保健食品行业中的应用。

本发明取得的优点和积极效果是：

1、本发明方法以脱脂的大豆豆粕为原料，提取并分离铁蛋白，通过蛋白酶解技术获得分子量分布在2.0-3.0kda的含铁多肽组分，并进一步应用超滤与柱层析技术得到具有高铁含量的贮铁多肽。对该贮铁多肽的结构及含铁量进行分析，获得的储铁多肽溶液浓度为0.32mg/ml，含铁量为8.3*10^-6mg/ml。本方法开发了一种新型的基于多肽的补铁资源，并研究阐明多肽结构与含铁量关系，为今后的补铁的产品开发提供参考。本发明方法制得的贮铁多肽及相关产品的开发在食品添加剂、饲料、保健食品等行业有着广阔的开发潜力和应用前景，同时，该方法也为豆粕资源的利用开拓了新途径。

2、本发明方法在提取获得豆粕铁蛋白资源的基础上，利用特定蛋白酶对豆粕中铁蛋白进行酶解，制备获得结合了一定量的铁离子的多肽。本发明方法的提出主要基于大豆本身含有丰富的三价铁资源，而这些铁大约90％贮存在铁蛋白中，其分子量为560kda，通过酶解与分离纯化技术获得分子量更低的贮铁多肽，以使其更容易被人体吸收利用，从而提高铁的生物利用度和补铁效率。该发明对于提高豆粕资源的利用程度，开发新型的补铁产品具有重要的研究意义和应用前景。

附图说明

图1为本发明中一种木瓜蛋白酶酶解豆粕铁蛋白制备贮铁多肽技术路线图；

图2为本发明中豆粕大豆铁蛋白的sds-page电泳图；

图3为本发明中豆粕大豆铁蛋白的透射电镜图；

图4为本发明中豆粕大豆铁蛋白的动态光散射尺寸分布图；

图5为本发明中豆粕大豆铁蛋白经木瓜蛋白酶酶解后所获得的贮铁多肽sds-page电泳图；

图6为本发明中豆粕大豆铁蛋白与贮铁多肽(贮铁多肽是经酶处理豆粕大豆铁蛋白制得的)的圆二色谱图。

具体实施方式

下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

一种利用蛋白酶制备脱脂豆粕贮铁多肽的方法，步骤如下：

以脱脂的大豆豆粕为原料，利用水提法提取并分离铁蛋白，通过蛋白酶解技术获得含铁多肽组分，并进一步应用分级超滤技术得到具有高铁含量的贮铁多肽。

较优地，具体步骤如下：

⑴利用脱脂的大豆豆粕为原料，使用0.05-0.10m磷酸缓冲液浸泡豆粕，所述磷酸缓冲液的ph为7.0，且其含质量百分数为1％的聚乙烯吡烷酮，磷酸缓冲液：豆粕质量比为10-15:1，浸泡时间为6-8h，然后使用内切式匀浆机匀浆2-3min，得蛋白粗提液；

⑵向蛋白粗提液中加入浓度为50-100mm的mgcl2晶体，溶解后立即4500-5000g离心5-10min，弃沉淀，得上清液；

⑶上清液静置20-30min后，加入浓度为70-100mm的柠檬酸三钠晶体，静置6-24h，经10000-12000g离心20-30min后，得沉淀和离心后上清液，沉淀即为大豆铁蛋白，该大豆铁蛋白不复溶于该离心后上清液；

⑷在离心获得的沉淀中加入其1.5-3倍体积的离心上清液，冲洗沉淀中的淀粉和核糖体，然后10000g离心5-10min，弃上清，重复1至两次以上，直至只有褐色沉淀；

将沉淀溶于1.5倍体积蒸馏水中，10000g离心5-10min，弃上清；重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，13000g离心5-10min，收集并合并上清液，获得豆粕大豆铁蛋白，该豆粕大豆铁蛋白的浓度为1.0-2.0μm，其ph值为6.5-7.0；

⑸向豆粕大豆铁蛋白中加入蛋白酶进行酶解，酶解参数为：酶浓度1000-2000u、底物铁蛋白浓度1.0-2.0μm、反应时间4h-6h、反应ph6.5-7.0、反应温度55-60℃，酶解后，即获得粗贮铁多肽；

⑹对粗贮铁多肽进行超滤，使用超滤膜分级超滤，其截留分子量分别为1.5和3.0kda，获得截留组分，即得贮铁多肽。

较优地，所述步骤⑸中蛋白酶为木瓜蛋白酶。

较优地，所述步骤⑹的具体步骤为：

分级超滤多肽，通过两步超滤多肽组分：首先利用3.0kda膜截留获得3.0kda以下多肽片段，再经1.5kda截留，获得该截留分子量以上片段，得到目标分子量2.0-3.0kda范围的多肽，即得贮铁多肽。

如上所述的利用蛋白酶制备脱脂豆粕贮铁多肽的方法制得的贮铁多肽在食品添加剂、饲料、保健食品行业中的应用。

实施例2

一种利用蛋白酶制备脱脂豆粕贮铁多肽的方法，步骤如下：

(1)豆粕大豆铁蛋白的制备

选用脱脂大豆豆粕为原料，可以先将豆粕放入4℃蒸馏水中浸泡过夜，加入2倍体积缓冲液(含有0.05m磷酸缓冲液，ph7.0，质量百分数为1％的聚乙烯吡烷酮)，浸泡7h，并用内切式匀浆机匀浆2分钟，即得蛋白粗提液，该蛋白粗提液也可以使用纱布过滤，除豆渣，取上清液。

粗提液中加入浓度为50mmmgcl2晶体后，溶解后立即4800g离心5min，弃沉淀，上清液静置20min后，加入浓度为70mm柠檬酸三钠晶体静置过夜，经12000g离心20min后，大豆铁蛋白基本不复溶于上清液。向沉淀中加入沉淀1.5倍体积上清液，冲洗沉淀中的淀粉和核糖体，并10000g离心5min，弃上清，重复3-4次直至只有褐色沉淀。

将沉淀溶于1.5倍体积蒸馏水中，10000g离心5min，弃上清。重复两次用5倍体积蒸馏水溶解沉淀，13000g离心5min，收集并合并上清液，获得豆粕大豆铁蛋白。

(2)蛋白酶解豆粕铁蛋白获得储铁多肽

选用商业化木瓜蛋白酶，酶解参数为：酶浓度(1000u)、底物铁蛋白浓度(1.0μm)、反应时间(4h)、反应ph(ph6.5)、反应温度(55℃)，获得粗贮铁多肽。

(3)大豆贮铁多肽的分离纯化

2.0-3.0kda贮铁多肽的分级分离：选择超滤技术参数(膜截留分子量分别为1.5、3.0kda)，分级超滤多肽，通过两步超滤多肽组分，首先利用3.0kda膜截留获得3.0kda以下多肽片段，再经1.5kda截留，获得该截留分子量以上片段，得到目标分子量2.0-3.0kda范围的多肽，即得贮铁多肽。

本发明方法获得的脱脂豆粕贮铁多肽的相关检测：

1、利用sds-page检测分离纯化的豆粕大豆铁蛋白的蛋白质纯度和分子量，结果见图2，由图2可以看出，获得的铁蛋白由典型的两种亚基构成，证明豆粕中存在铁蛋白。

利用通过透射电镜实验及动态光散射分析检测豆粕大豆铁蛋白的蛋白形态，结果见图3及图4，透射电镜图表明获得的铁蛋白具有规则的球形结构，大小约为12nm；动态光散射结果证明铁蛋白的水合半径为7.3nm。

2、获得的粗贮铁多肽结果见图5，该sds-page结果表明，酶解后的多肽分子量显著降低(对比图2)，主要组分在2.0-4.5kda左右。该结果证明蛋白酶能够有效酶解铁蛋白为多肽组分，利用木瓜蛋白酶酶解大豆铁蛋白获取多肽是可行的。

3、大豆贮铁多肽的分离纯化技术研究

2.0-3.0kda贮铁多肽的分级分离：选择超滤技术参数(膜截留分子量分别为1.5、3.0kda)，分级超滤多肽，通过两步超滤多肽组分，首先利用3.0kda膜截留获得3.0kda以下多肽片段，再经1.5kda截留，获得该截留分子量以上片段，得到目标分子量2.0-3.0kda范围的多肽，即得贮铁多肽，目标产物的分子量显著低于豆粕铁蛋白，更利于提高溶解度与吸收效果。

4、大豆贮铁多肽的二级结构

通过cd光谱法以测定贮铁多肽的二级结构。通过电泳法测定不同贮铁多肽的分子量，采用原子吸收光谱法测定多肽中含铁量。比较豆粕铁蛋白与储铁多肽结构，如图6所示，两组分结构存在显著差异，贮铁多肽的吸收率显著降低，证明了多肽与铁蛋白结构显著不同。

5、大豆贮铁多肽含铁量分析

通过原子吸收法测定贮铁多肽中的铁含量，结果如表1所示，其含量为8.3*10^-6mg/ml。该贮铁多肽具有天然、易获取、水溶性好的特点，具有在食品添加剂、饲料、保健食品等行业开发的潜力。

表1酶解、纯化后铁蛋白多肽分子量组成及含铁量表

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。