一种重组马绒毛膜促性腺激素融合蛋白及其制备方法和其应用与流程

本发明属于生物医药和动物繁殖技术领域，具体涉及一种重组马绒毛膜促性腺激素融合蛋白及其制备方法和其应用。

背景技术：

马绒毛膜促性腺激素(equinechorioniegonadotropin，ecg)是妊娠马、驴或斑马的子宫内膜杯组织分泌的一种糖蛋白类激素，主要存在于孕马血清中，因此又称为孕马血清促性腺激素(pregnantmareserumgonadotropin，pmsg)。ecg含有α和β两个亚基，α亚基由96个氨基酸残基组成，含有2个n-糖基化位点，分别位于n56和n82位。β亚基由149个氨基酸残基组成，含有1个n-糖基化位点和12个0-糖基化位点，其中n-糖基化位点位于n33位，0-糖基化位点分别为于n118、n123、n127、n128、n129、n130、n131、n133、n137、n140、n141和n149位，α亚基和β亚基均通过n-糖苷键连接于氨基酸残基的氨基上。

ecg具有促卵泡素(folliclestimulatinghormone，fsh)和促黄体素(luteinizinghormone，lh)的双重作用，但以fsh的作用为主。对于雌性动物，ecg作用于卵巢，可以促进卵泡发育、成熟、排卵以及黄体生成；对于雄性动物，ecg作用于睾丸，可以促进曲细精管的发育、精子的生成和睾丸间质细胞雄激素的分泌。因此，在动物繁殖领域，ecg可用于同期发情、超数排卵、胚胎移植以及母畜卵巢疾病的治疗。

ecg唾液酸含量高，占分子总重的45％左右，在动物体内肾小球的清除率低，作用时间长。半衰期长，在牛体内，注射ecg120h后血液中仍有有效浓度，因此一个发情周期只需要注射一针。而类似的生殖激素药物，如猪垂体促卵泡素(pfsh)，半衰期短一个发情周期需要每日一次或每日两次注射，连续注射3-5天。因此ecg作用的持续性使其在动物繁殖领域广泛应用。

目前市售的pmsg产品是从妊娠40-120天的母马血清中提取的，一般使用偏磷酸去除血清中杂蛋白，之后用乙醇分段沉淀，这种处理方法得到的ecg生产效价低，精品pmsg的效价约1000iu/mg，所以pmsg在畜牧生产上受到很大限制，而市场急需大量的pmsg产品。同时不同批号pmsg的fsh/lh比率差异大，导致pmsg作用差异大。从怀孕母马采集血清制备pmsg，采血过多经常会导致母马流产、胎马死亡，方式野蛮且不人道。

技术实现要素：

基于上述问题，本发明提供了一种重组马绒毛膜促性腺激素融合蛋白及其制备方法。

本发明的一个目的是提供一种重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列包括下述1)-3):

1)fc片段的氨基酸序列；和/或将fc片段的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与fc片段相同功能的由fc片段的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；

2)马绒毛膜促性腺激素ecg的α亚基的氨基酸序列；和/或将所述α亚基的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与所述α亚基相同功能的由所述α亚基的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；

3)马绒毛膜促性腺激素ecg的β亚基的氨基酸序列；和/或将所述β亚基的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与所述β亚基相同功能的由所述β亚基的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；

和/或所述重组蛋白包括，蛋白的折叠或修饰包括下述1)-4)所述中的至少一种：

1)与任一马绒毛膜促性腺激素ecg的α亚基的折叠和/或修饰一致；

2)与任一马绒毛膜促性腺激素ecg的β亚基的折叠和/或修饰一致；

3)由任一真核表达系统完成的折叠和/或修饰；具体的，所述折叠和/或修饰不同于上述1)和2)所述的折叠和/或修饰；

4)经人工折叠和/或修饰；具体的，所述折叠和/或修饰不同于上述1)、2)和3)所述的折叠和/或修饰。

具体的，所述蛋白还包括下述1)-6)中所述的至少一种：

1)所述β亚基与fc片段连接构成β-fc亚基，所述α亚基与β-fc亚基通过非共价键结合；

2)所述α亚基与fc片段连接构成α-fc亚基，所述β亚基与α-fc亚基通过非共价键结合；

3)所述fc片段包含免疫球蛋白铰链区、ch2和ch3区；

4)所述fc片段来自哺乳动物的免疫球蛋白；

5)当所述蛋白的折叠和/或修饰包括由任一真核表达系统完成的折叠和/或修饰时，所述真核表达系统包括cho、hek293、bhk、ns0和/或sp2/0细胞中的至少一种；

6)当所述蛋白的折叠和/或修饰包括经人工折叠和/或修饰时，所述修饰包括糖基化、聚乙二醇化、乙酰化和/或与bsa结合中的至少一种。

具体的，所述蛋白还包括下述1)-7)中所述的至少一种：

1)当所述蛋白包括所述β亚基与fc片段连接构成β-fc亚基和/或所述α亚基与fc片段连接构成α-fc亚基时，所述连接包括β和/或α亚基与fc片段之间通过肽键直接连接；

2)当所述蛋白包括所述β亚基与fc片段连接构成β-fc亚基和/或所述α亚基与fc片段连接构成α-fc亚基时，所述连接包括β和/或α亚基与fc片段之间通过连接体linker连接；

3)所述fc片段来自人、猪、牛、羊、马、和/或狗的免疫球蛋白；

4)当所述蛋白包括β-fc亚基时，所述β-fc亚基的氨基酸序列为序列表中seqidno:5所示的氨基酸序列；

5)当所述蛋白包括β-fc亚基时，所述β-fc亚基包括将序列表中seqidno:5所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与序列表中seqidno:5所示的氨基酸序列同等功能的由具有序列表中seqidno:5所示氨基酸序列的亚基衍生的蛋白；

6)当所述蛋白包括β-fc亚基时，所述β-fc亚基包括与序列表中seqidno:5所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有与序列表中seqidno:5所示的氨基酸序列同等功能的蛋白；

7)当所述蛋白的折叠和修饰包括由任一真核表达系统完成的折叠和/或修饰时，所述真核表达系统为cho。

具体的，所述蛋白还包括下述1)-7)中所述的至少一种：

1)所述α亚基的氨基酸序列为序列表中seqidno:1所示的氨基酸序列；

2)所述α亚基包括将序列表中seqidno:1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与马绒毛膜促性腺激素ecg的α亚基同等功能的由具有序列表中seqidno:1所示氨基酸序列的α亚基衍生的蛋白；

3)所述α亚基包括与序列表中seqidno:1所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有与马绒毛膜促性腺激素ecg的α亚基同等功能的氨基酸序列构成的蛋白；

4)所述β亚基的氨基酸序列为序列表中seqidno:3所示的氨基酸序列；

5)所述β亚基包括将序列表中seqidno:3所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与马绒毛膜促性腺激素ecg的β亚基同等功能的由具有序列表中seqidno:3所示氨基酸序列的β亚基衍生的蛋白；

6)所述β亚基包括与序列表中seqidno:3所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有与马绒毛膜促性腺激素ecg的β亚基同等功能的氨基酸序列构成的蛋白；

7)所述fc片段来自人的免疫球蛋白。

具体的，所述蛋白的制备方法包括，通过真核表达系统表达本发明任一所述蛋白。

具体的，所述蛋白的制备方法还包括下述1)-4)中所述的至少一种：

1)所述真核表达系统包括cho、hek293、bhk、ns0和/或sp2/0细胞中的至少一种；

2)所述通过真核表达系统表达本发明任一所述蛋白包括：将包含有α亚基的编码基因的载体或微生物、包含有根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的α亚基的编码基因的载体或微生物、包含有β亚基的编码基因的载体或微生物、包含有根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的β亚基的编码基因的载体或微生物、包含有fc片段的编码基因的载体或微生物、和/或包含有根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的fc片段的编码基因的载体或微生物中的至少一种导入所述真核表达系统；

具体的，所述通过真核表达系统表达本发明任一所述蛋白包括，将包含有根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的α亚基的编码基因的载体或微生物、包含有根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的β亚基的编码基因和根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的fc片段的编码基因的载体或微生物，共同导入所述真核表达系统；

具体的，任一所述fc片段来自哺乳动物的免疫球蛋白；再具体的，任一所述fc片段来自人、猪、牛、羊、马、和/或狗的免疫球蛋白；优选人免疫球蛋白；

具体的，所述通过真核表达系统表达本发明任一所述蛋白包括，将包含有序列表中seqidno:2所示核苷酸序列的载体或微生物、包含有序列表中seqidno:6所示核苷酸序列的载体或微生物，共同导入所述真核表达系统；

和/或具体的，所述任一导入包括电穿孔转染、磷酸钙转染、脂质体转染、和/或原生质体融合；优选电穿孔转染；

和/或具体的，所述载体包括pcdna3.1、pcmv/zeo、pires、pdr、pbk、psport和/或pcmv-dhfr；优选pcdna3.1；

所述包含有序列表中seqidno:2所示核苷酸序列的载体具体为将序列表中seqidno:2所示核苷酸序列连接到表达载体pcdna3.1的ecori和xbai内切酶位点之间所得的重组载体；

所述包含有序列表中seqidno:6所示核苷酸序列的载体为将序列表中seqidno:6所示核苷酸序列连接到表达载体pcdna3.1的ecori和xbai内切酶位点之间所得的重组载体；

所述根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的β亚基的编码基因具体为序列表中seqidno:4所示核苷酸序列；

3)所述通过真核表达系统表达本发明任一所述蛋白包括，培养所述真核表达系统，所述培养使用的培养基的组分中包括尿苷、氯化锰、甘露糖、半乳糖、葡萄糖胺、n-乙酰-d-甘露糖胺、和/或cu²⁺；

具体的，所述培养使用的培养基包括基础培养基和/或补料培养基，所述基础培养基的组分中包括cu²⁺，所述补料培养基的组分中包括n-乙酰-d-甘露糖胺；

再具体的，所述培养使用的培养基包括基础培养基和/或补料培养基，所述基础培养基的组分中包括100μmcu²⁺，所述补料培养基的组分中包括2mmn-乙酰-d-甘露糖胺；

4)所述通过真核表达系统表达本发明任一所述蛋白包括，纯化所述蛋白；

具体的，纯化所述蛋白包括弱阳离子交换层析纯化、疏水层析、强阴离子交换层析中的至少一种；

再具体的，所述弱阳离子交换层析纯化包括mmc纯化，具体用平衡液20mm乙酸铵，ph5.5平衡上样，之后用洗脱液50mm甘氨酸，1m硫酸铵，ph8.0洗脱，收集洗脱液；

所述疏水层析纯化包括phenyl纯化，具体用平衡液50mm甘氨酸，1.5m硫酸铵，ph8.0平衡上样，之后用洗脱液10mm甘氨酸，ph8.0洗脱，收集洗脱液；

所述强阴离子交换层析包括qff，具体用平衡液50mm甘氨酸，ph7.2平衡上样，之后用洗脱液50mm甘氨酸，0.2mnacl，ph7.2洗脱，收集得到纯化的目的蛋白。

本发明的另一个目的是提供一种重组蛋白的制备方法，所述方法包括，通过真核表达系统表达本发明任一所述蛋白；

具体的，所述方法还包括，下述1)-4)中所述的至少一种：

1)所述真核表达系统包括cho、hek293、bhk、ns0和/或sp2/0细胞中的至少一种；

2)所述通过真核表达系统表达本发明任一所述蛋白包括：将包含有α亚基的编码基因的载体或微生物、包含有根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的α亚基的编码基因的载体或微生物、包含有β亚基的编码基因的载体或微生物、包含有根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的β亚基的编码基因的载体或微生物、包含有fc片段的编码基因的载体或微生物、和/或包含有根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的fc片段的编码基因的载体或微生物中的至少一种导入所述真核表达系统；

具体的，所述通过真核表达系统表达本发明任一所述蛋白包括，将包含有根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的α亚基的编码基因的载体或微生物、包含有根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的β亚基的编码基因和根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的fc片段的编码基因的载体或微生物，共同导入所述真核表达系统；

具体的，任一所述fc片段来自哺乳动物的免疫球蛋白；再具体的，任一所述fc片段来自人、猪、牛、羊、马、和/或狗的免疫球蛋白；优选人免疫球蛋白；

再具体的，所述通过真核表达系统表达本发明任一所述蛋白包括，将包含有序列表中seqidno:2所示核苷酸序列的载体或微生物、包含有序列表中seqidno:6所示核苷酸序列的载体或微生物，共同导入所述真核表达系统；

和/或具体的，所述任一导入包括电穿孔转染、磷酸钙转染、脂质体转染、和/或原生质体融合；优选电穿孔转染；

和/或具体的，所述载体包括pcdna3.1、pcmv/zeo、pires、pdr、pbk、psport和/或pcmv-dhfr；优选pcdna3.1；

所述包含有序列表中seqidno:2所示核苷酸序列的载体具体为将序列表中seqidno:2所示核苷酸序列连接到表达载体pcdna3.1的ecori和xbai内切酶位点之间所得的重组载体；

所述包含有序列表中seqidno:6所示核苷酸序列的载体为将序列表中seqidno:6所示核苷酸序列连接到表达载体pcdna3.1的ecori和xbai内切酶位点之间所得的重组载体；

所述根据所述真核表达系统的密码子偏爱性进行基因序列优化后的β亚基的编码基因具体为序列表中seqidno:4所示核苷酸序列；

3)所述通过真核表达系统表达权利要求1、2、3和/或4任一所述蛋白包括，培养所述真核表达系统，所述培养使用的培养基的组分中包括尿苷、氯化锰、甘露糖、半乳糖、葡萄糖胺、n-乙酰-d-甘露糖胺、和/或cu²⁺；

具体的，所述培养使用的培养基包括基础培养基和/或补料培养基，所述基础培养基的组分中包括cu²⁺，所述补料培养基的组分中包括n-乙酰-d-甘露糖胺；

再具体的，所述培养使用的培养基包括基础培养基和/或补料培养基，所述基础培养基的组分中包括100μmcu²⁺，所述补料培养基的组分中包括2mmn-乙酰-d-甘露糖胺；

4)所述通过真核表达系统表达本发明任一所述蛋白包括，纯化所述蛋白；

具体的，纯化所述蛋白包括弱阳离子交换层析纯化、疏水层析、强阴离子交换层析中的至少一种；

再具体的，所述弱阳离子交换层析纯化包括mmc纯化，具体用平衡液20mm乙酸铵，ph5.5平衡上样，之后用洗脱液50mm甘氨酸，1m硫酸铵，ph8.0洗脱，收集洗脱液；

所述疏水层析纯化包括phenyl纯化，具体用平衡液50mm甘氨酸，1.5m硫酸铵，ph8.0平衡上样，之后用洗脱液10mm甘氨酸，ph8.0洗脱，收集洗脱液；

所述强阴离子交换层析包括qff，具体用平衡液50mm甘氨酸，ph7.2平衡上样，之后用洗脱液50mm甘氨酸，0.2mnacl，ph7.2洗脱，收集得到纯化的目的蛋白。

本发明的还一个目的是提供一种重组蛋白的编码基因，所述编码基因包括下述1)-3)中所述的至少一种：

1)具有序列表中seqidno:2所示核苷酸序列；

2)具有序列表中seqidno:4所示核苷酸序列；

3)具有序列表中seqidno:6所示核苷酸序列。

本发明的还一个目的是提供一种组合物，所述组合物包括下述1)-2)中所述的至少一种：

1)本发明任一所述蛋白和任意辅料；

2)本发明任一所述方法直接制备得到的蛋白和任意辅料。

本发明的再一个目的是提供本发明任一所述蛋白、本发明任一所述方法直接制备得到的蛋白、本发明任一所述编码基因、和/或本发明任一所述组合物的应用；

具体的，所述应用包括下述1)-2)中所述的至少一种：

1)制备用于促进动物繁殖产品中的应用；

具体的，所述促进动物繁殖包括促进动物同期发情和/或超数排卵；

2)制备用于治疗动物生殖相关疾病的药物中的应用。

具体的，所述动物包括哺乳动物。

再具体的，所述哺乳动物包括家畜、家禽、宠物和/或特种经济动物；优选家畜。

还具体的，所述家畜包括猪、牛和/或羊；所述家禽包括兔；所述宠物包括狗；所述特种经济动物包括梅花鹿、水貂和/或狐狸。

本发明提供的重组马绒毛膜促性腺激素融合蛋白及其制备方法，至少具有以下优点：

(一)本发明提供的重组马绒毛膜促性腺激素fc融合蛋白，及其衍生蛋白或经过修饰的蛋白，在哺乳动物细胞-cho细胞中高效表达，表达量约为0.5g/l(4600iu/ml)，而从怀孕母马血清中提取的pmsg总体水平约50iu/ml，recg表达量是天然提取的pmsg的92倍。

(二)本发明提供的重组马绒毛膜促性腺激素fc融合蛋白，及其衍生蛋白或经过修饰的蛋白，质量相对均一，纯化后的recg-fc融合蛋白蛋白纯度达99％以上，纯度高，安全系数大；活性高，比活可达9200iu/mg。

(三)本发明提供的重组马绒毛膜促性腺激素fc融合蛋白，及其衍生蛋白或经过修饰的蛋白，可以促进小鼠排卵，与hcg合用，每只小鼠的均排卵数为50.4个/只，远远大于正常小鼠的排卵数(均排卵数为11个/只)，亦比天然提取的pmsg效果好(均排卵数为38.9个/只)。

(四)本发明提供的重组马绒毛膜促性腺激素fc融合蛋白，及其衍生蛋白或经过修饰的蛋白，可以诱导初产母猪发情，发情率为80％，高于天然的pmsg产品(65％)。可以治疗乏情母猪，诱导乏情母猪发情，发情率为60％，高于天然的pmsg产品(45％)。

(五)本发明提供的重组马绒毛膜促性腺激素fc融合蛋白，及其衍生蛋白或经过修饰的蛋白，可以用于母山羊的同期发情，发情率为87％，高于天然的pmsg产品(67％)。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例1制备和实施例2纯化出的recg-fc融合蛋白的sds-page非还原电泳图，其中mk：蛋白marker；1：澄清发酵液；2：mmc收集液；3：phenyl收集液；4：qff收集液。

图2为本发明实施例3中pmsg和recg-fc融合蛋白诱导小鼠超数排卵的卵细胞图。

具体实施方式

下述实施例中所使，用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例及其具体说明用于解释和理解本发明，并不构成对本发明的不当限定。

若未特别指明，下述实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

下述实施例3-6所述的pmsg来自市售孕马血清(血促性素)产品。

实施例1、重组recg和recg-fc融合蛋白的获得

为了获得具有活性的重组ecg蛋白产品，同时设计了recg和recg-fc融合蛋白：在基因库中检索ecgα(genbanknm_001099763.1)、β(genbanknm_001197093.1)和人fc(genbankah005273.2)的基因序列，根据哺乳动物密码子偏爱性优化α亚基、β亚基和β-fc亚基基因序列，优化后的α亚基核苷酸序列如序列表中seqidno:2所示，优化后的β亚基核苷酸序列如序列表中seqidno:4所示，优化后的β-fc亚基核苷酸序列如序列表中seqidno:6所示。

人工合成序列表中seqidno:2、seqidno:4和seqidno:6所示核苷酸序列。

将人工合成的上述核苷酸序列即α、β和β-fc亚基的核苷酸编码序列分别转入表达载体pcdna3.1中构建表达载体，获得重组载体pcdna3.1-α、重组载体pcdna3.1-β和重组载体pcdna3.1-β-fc。

其中，重组载体pcdna3.1-α为将序列表中seqidno:2所示核苷酸序列连接到表达载体pcdna3.1的ecori和xbai内切酶位点之间。

重组载体pcdna3.1-β为将序列表中seqidno:4所示核苷酸序列连接到表达载体pcdna3.1的ecori和xbai内切酶位点之间。

重组载体pcdna3.1-β-fc为将序列表中seqidno:6所示核苷酸序列连接到表达载体pcdna3.1的ecori和xbai内切酶位点之间。

将序列正确的重组载体转入dh5α中，-80℃保存。

分别将重组载体pcdna3.1-α和pcdna3.1-β、pcdna3.1-α和pcdna3.1-β-fc瞬时转入hek293细胞中，表达重组recg和recg-fc蛋白。对瞬转表达的recg和recg-fc进行纯化，采用实施例2中活性检定方法验证活性，结果显示直接表达recg对大鼠卵巢增重不明显，recg活性很低；recg-fc融合蛋白对大鼠卵巢增重明显，存在活性。

将重组载体pcdna3.1-α和重组载体pcdna3.1-β-fc线性化后电转转入cho细胞中获得recg-fc稳转细胞系。将稳转细胞株保存于液氮中。

实施例2重组recg-fc融合蛋白的发酵和纯化

将实施例1制备得到的recg-fc稳转细胞株在摇瓶中进行培养，并对细胞培养条件进行优化，优化条件显示在基础培养基中加入100μmcu²⁺，补料培养基加入2mmn-乙酰-d-甘露糖胺，可以增加重组recg-fc的糖基化程度，使唾液酸含量提高约20％。摇瓶细胞优化培养条件成功后，在7l生物反应器中进行放大，培养表达重组recg-fc融合蛋白。

培养表达的recg-fc融合蛋白细胞培养液，通过两级深层过滤膜包去除细胞和细胞碎片，然后用0.22μm滤膜过滤，获得澄清的发酵液。澄清的发酵液首先用弱阳离子交换层析(如captommc,gehealthcare)纯化：用平衡液(20mm乙酸铵，ph5.5)平衡上样，之后用洗脱液(50mm甘氨酸，1m硫酸铵，ph8.0)洗脱，收集洗脱液。其次用疏水层析(如phenyl,gehealthcare)纯化：用平衡液(50mm甘氨酸，1.5m硫酸铵，ph8.0)平衡上样，之后用洗脱液(10mm甘氨酸，ph8.0)洗脱，收集洗脱液。最后强阴离子交换(如qff，gehealthcare)层析进一步纯化：用平衡液(50mm甘氨酸，ph7.2)平衡上样，之后用洗脱液(50mm甘氨酸，0.2mnacl，ph7.2)洗脱，收集得到纯化的目的蛋白。对目的蛋白进行sds-page凝胶电泳，结果如图1所示。

实施例3重组recg-fc融合蛋白的活性检定

采用大鼠卵巢增重法(steelman-pohley法)测定重组recg-fc的生物学活性，参照《兽药质量标准》中“血促性素生物检定法”检定药品活性，以市售pmsg作为标准品。具体实施如下：将重组recg-fc(预估比活10000u/mg)和pmsg均配制成40iu、20iu和10iu高、中、低三个剂量。选取日龄21-23天、体重40-55g雌性sd(spraguedawley)大鼠随机分成6组，每组6只。每只大鼠皮下注射0.5ml相应药品，6日后，将大鼠处死，称体重，解剖，摘出卵巢，称重，换算成每100g体重的卵巢重。使用中检所《药典生物检定统计bs2000》软件计算recg-fc比活为9200iu/mg，是《兽药质量标准》规定的不低于100iu/mg的92倍。

实施例4重组recg-fc融合蛋白对小鼠超数排卵的作用

选择24只，9-13g、出生19-23天的雌性幼小鼠，随机分为3组，阴性对照组、pmsg和recg-fc组。分别将pmsg和recg-fc用无菌生理盐水稀释为50iu/ml，每只小鼠腹腔注射0.1mlpmsg或recg-fc，阴性对照组注射0.1ml无菌生理盐水。间隔48h后三组小鼠均注射5iuhcg，18h后处死小鼠，摘出卵巢、输卵管和部分子宫，在体视镜下找到输卵管壶腹部，用镊子刺破，卵丘细胞包围的卵子流出并转移至含有透明质酸酶的m2培养基中消化，将消化掉卵丘细胞的卵子转移至m2培养基液滴中清洗2-3次。显微镜下记录排卵数和拍照，排出的卵细胞如图2所示。

表1为pmsg和recg对幼小鼠超数排卵的比较。结果如表1所示，24只小鼠均排卵，pmsg和recg-fc均能明显促进小鼠排卵，阴性对照组共排卵87个，均排卵10.9个；pmsg组小鼠共排卵305个，均排卵数为38.1个；recg-fc组小鼠共排卵409个，平均排卵51.1个。recg-fc组与阴性对照和pmsg组比差异极其显著。

表1

注：同列系列肩标不同大小写字母表示差异及其显著(p<0.01)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)。

实施例5重组recg-fc融合蛋白在初产母猪和乏情母猪同期发情的应用

分别选取40头初产大白母猪和断奶后21天以上仍未发情的乏情母猪，体重85-100kg，品种相同，体征接近，随机分为pmsg组和recg-fc组。分别在两组供体猪耳后颈部肌肉注射1000iu的pmsg或recg-fc，间隔72h后注射500iuhcg。5天后观察两组母猪的发情情况，如阴户红肿、有粘液；压背时出现静立反应。记录发情母猪数，计算发情率。

表2为pmsg和recg对初产母猪和乏情母猪同期发情的比较。结果如表2所示，pmsg和recg-fc均能诱导初产母猪和发情母猪发情，pmsg组初产母猪和乏情母猪的发情率为65％和45％，recg-fc组初产母猪和乏情母猪的发情率为80％和60％，高于pmsg组。说明recg-fc可以促进初产母猪和乏情母猪同期发情，并且效果要优于天然提取的pmsg。

表2

注：同列系列肩标不同大小写字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)。

实施例6重组recg-fc融合蛋白在促进母山羊同期发情中的应用

选择30只1.5-3岁，体重30-45kg、体质健康、无疾病的母山羊，随机分为pmsg组和recg-fc组。于发情周期任一天给供体羊放置孕酮阴道栓并记为0天，两组供体羊分别肌肉注射300iu相应药品(day10)，撤栓(day12)。观察母山羊的发情表现，并用试情公羊进行试情。以母羊外阴发红、流黏液并接受爬跨视为发情，记录发情母羊数，计算发情率。

表3为pmsg和recg对母山羊的发情比较。结果如表3所示，两组山羊发情明显，pmsg组母羊发情率为67％，recg-fc组母羊的发情率为87％，高于pmsg组。说明recg-fc可以诱导母山羊发情，并且效果要优于天然提取的pmsg。

表3

注：同列系列肩标不同大小写字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>北京伟杰信生物科技有限公司

<120>一种重组马绒毛膜促性腺激素融合蛋白及其制备方法和其应用

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