一种靶向Muc1的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途的制作方法

本发明属于基因工程学和肿瘤学，涉及一种特异性靶向muc1抗原的嵌合抗原受体修饰细胞及其抗肿瘤效果。

背景技术：

嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcell，car-t)治疗技术无疑是肿瘤免疫细胞治疗领域中一颗冉冉升起的巨星。car-t技术是通过基因工程技术将识别某抗原分子的抗体可变区基因序列与t淋巴细胞免疫受体的胞内区序列拼接后，通过逆转录病毒或慢病毒载体、转座子或转座酶系统或直接mrna转导到淋巴细胞内，并表达融合蛋白于细胞表面，使t淋巴细胞能通过非mhc限制性的方式识别特定抗原，增强其识别和杀伤肿瘤的能力。

car的结构自1989年以色列eshhar研究小组首次提出后，经过近30年的发展，已经被证实经过car结构修饰的t细胞在肿瘤免疫治疗中具有较好的疗效。第一代car受体包含了胞外特异识别肿瘤抗原的片段(single-chainvariablefragment，scfv)，胞内激活信号由cd3ζ信号链来传递。但是第一代car受体缺乏t细胞的共刺激信号，导致t细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代car受体增加了共刺激信号分子的胞内结构域，包括如cd28，cd134/ox40，cd137/4-1bb，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lck)，可诱导的t细胞共刺激剂(icos)以及dnax活化蛋白10(dap10)等结构域，增强了t细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，il-2、ifn-γ以及gm-csf增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长aicd(激活诱导的细胞死亡，aicd)。第三代car受体则是在共刺激结构cd28和itam信号链之间再融合一个二级共刺激分子如4-1bb，因而产生了一个三重信号的car受体，第三代car受体改造的t细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。常用的经典car-t结构即为二代car受体，其结构具体可分为以下4部分：识别肿瘤抗原的抗体单链可变区(scfv)、铰链区、跨膜区、胞内刺激信号结构区域。其中，car结构铰链区负责形成正确构象，形成二聚体。铰链区的长短及氨基酸序列特征决定了car的空间构象，也决定了其与肿瘤细胞表面抗原结合的能力。

实体瘤具有高度的异质性，不同患者、同一患者不同病灶、同一病灶不同肿瘤细胞之间均存在高度的差异。这种高度的异质性致使肿瘤靶向治疗缺乏理想的通用、广谱靶点，限制了car-t细胞治疗实体瘤的疗效。因而，寻找有效的car-t细胞治疗靶点已然成为car-t细胞治疗的重中之重。muc1(mucins，粘蛋白)是一类高分子量(>200kd)的ⅰ型跨膜糖蛋白(多以o-糖苷键与多肽骨架上的ser/thr相连)，正常情况下主要表达于多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面，呈顶端表达，极性分布。在肿瘤发生时，muc1蛋白可在肿瘤细胞表面异常表达，表达量可达正常时的100倍以上。并且，其在细胞表面的极性分布丧失，可在整个细胞表面均匀分布。另外，由于糖基化不全，muc1蛋白的结构也发生改变，出现新的糖链及肽表位。出现的这些新的糖链和肽表位虽然可以成为car-t细胞治疗很理想的靶点，但由于在不同的肿瘤细胞表面会展示出不同的糖链和肽表位，特异性靶向某种糖肽的car-t细胞也许不能在多种类型的肿瘤中得到应用。

技术实现要素：

muc1抗原的胞外区为一段串联重复序列，其n端可被剪切，而靠近细胞膜表面的片段不会被切割，因而可以在任何一种muc1抗原高表达的肿瘤细胞表面存在，可以成为car-t细胞治疗合适的靶点。由于这一抗原表位存在于近膜端，本发明设计了2种不同铰链长度的car结构，一种是cd8铰链区与cd8跨膜区组合形成的跨膜铰链区，一种是由igg4fcch2ch3铰链区与cd8跨膜区组合形成的跨膜铰链区。由于car上存在的igg4fc片段容易被单核/巨噬细胞识别而引起t细胞aicd反应，本发明对car上的igg4fcch2ch3铰链区进行改造以满足本发明car片段既可以很好的识别抗原又不引起aicd反应的要求，从而达到良好的识别抗原和细胞杀伤作用，由此完成本发明。

因此，本文提供一种igg4fcch2ch3铰链区，所述铰链区的氨基酸序列如seqidno:5所示。

本文还提供所述igg4fcch2ch3铰链区的编码序列，包括其互补序列。

在一个或多个实施方案中，igg4fcch2ch3铰链区的编码序列如seqidno:12第796-1479位碱基所示。

本文还提供一种嵌合抗原受体(car)，从n端到c端，该嵌合抗原受体依次含有信号肽、抗muc1单链抗体、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序。

在一个或多个实施方案中，所述信号肽是膜蛋白信号肽。

在一个或多个实施方案中，所述信号肽选自cd8信号肽、cd28信号肽和cd4信号肽。

在一个或多个实施方案中，所述信号肽是cd8信号肽，其氨基酸序列如seqidno:1所示。

在一个或多个实施方案中，所述抗muc1单链抗体为muc1近膜端氨基酸序列的特异性抗体。

在一个或多个实施方案中，所述muc1近膜端的氨基酸序列如seqidno:10所示。

在一个或多个实施方案中，所述抗muc1单链抗体的氨基酸序列如seqidno:3所示。

在一个或多个实施方案中，所述铰链区为cd8α铰链区，其氨基酸序列如seqidno:4所示。

在一个或多个实施方案中，所述igg4fcch2ch3铰链区的氨基酸序列如seqidno:5所示。

在一个或多个实施方案中，所述跨膜区选自cd28跨膜区、cd8跨膜区、cd3ζ跨膜区、cd134跨膜区、cd137跨膜区、icos跨膜区和dap10跨膜区中的一种或多种。

在一个或多个实施方案中，所述跨膜区为cd8跨膜区，其氨基酸序列优选如seqidno:6所示。

在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子胞内结构域选自cd28、cd134/ox40、cd137/4-1bb、lck、icos和dap10胞内结构域中的一种或多种。

在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子胞内结构域是cd28胞内结构域，其氨基酸序列如seqidno:7所示。

在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子胞内结构域是cd137胞内结构域，其氨基酸序列如seqidno:8所示。

在一个或多个实施方案中，所述免疫受体酪氨酸活化基序为cd3ζ和/或fcεriγ的酪氨酸活化基序。

在一个或多个实施方案中，所述免疫受体酪氨酸活化基序为cd3ζ酪氨酸活化基序，其氨基酸序列如seqidno:9所示。

在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体从n端到c端依次含有cd8信号肽、抗muc1单链抗体、cd8铰链区或igg4fcch2ch3铰链区、cd8跨膜区、cd137胞内结构域和cd3ζ的酪氨酸活化基序。

在一个或多个实施方案中，，所述嵌合抗原受体从n端到c端依次含有cd8信号肽、抗muc1单链抗体、igg4fcch2ch3铰链区、cd8跨膜区、cd137胞内结构域和cd3ζ的酪氨酸活化基序。

在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno:11所示。

本文也提供本文嵌合抗原受体的编码序列，包括其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述编码序列的核苷酸序列如seqidno:12所示。

本文还提供一种核酸构建物，其含有本文所述嵌合抗原受体的编码序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体，用于表达本文所述的嵌合抗原受体。

在一个或多个实施方案中，所述表达载体是转座子载体。

在一个或多个实施方案中，所述转座子载体含有选自piggybac、sleepingbeauty、frogprince、tn5和ty的转座元件。

本文还提供一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有本文所述嵌合抗原受体的编码序列或本文所述的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为t细胞。

在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞为原代培养t细胞。

在一个或多个实施方案中，所述细胞表达本文所述的嵌合抗体受体。

本文还提供下述用途：

(1)所述igg4fcch2ch3铰链区或其编码序列在制备本文所述嵌合抗原受体或其编码序列中的用途；

(2)本文所述嵌合抗原受体的编码序列在制备重组表达载体中的用途；

(3)本文所述的核酸构建物在制备重组宿主细胞中的用途；以及

(4)本文所述的重组宿主细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述癌症选自：腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。

本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的重组宿主细胞。

附图说明

图1：pnb328-muc1car1、pnb328-muc1car2、pnb328-muc1car3的表达框模式。

图2：不同患者来源的pbmcs经muc1car基因修饰后检测muc1car基因表达的westernblotting检测图。

图3：muc1car基因的基因组在t细胞基因组中的表达水平。

图4：不同铰链区的muc1car-t细胞的杀伤作用比较。

图5：表达muc1car3的t细胞在体外可以增强t细胞的杀伤活性。a、b：流式检测间接反映t细胞杀伤活性的标记cd107α，活化标记cd69和衰老标记klrg1，以及记忆性t细胞的标记cd62l和ccr7。c、d：通过多因子检测试剂盒检测muc1car3t细胞和mockt细胞受muc1抗原刺激后il-2，il-4，il-6，il-10，tnf-α和ifn-γ细胞因子的变化。

图6：muc1car3t细胞的体内杀伤功能检测结果。

具体实施方式

本发明人经过大量的预实验和创造性的劳动，建立了成熟的car表达系统，并通过铰链区的筛选组合及转基因修饰优化，构建产生了靶向muc1抗原的高效稳定表达car基因且具有杀伤活性的muc1car-t细胞(简称muc1car-t)，该t细胞能高水平稳定的表达car基因。外源表达的car基因可以准确的靶向muc1抗原，增强t细胞的增殖能力及细胞因子的分泌，增强car-t细胞对肿瘤细胞的杀伤，并通过增强免疫反应，发挥抗肿瘤作用。同时外源car基因可经pb转座酶系统整合到t细胞的基因组中，从而在t细胞中稳定持续的表达。本发明获得的高水平稳定表达car基因的muc1car-t细胞可用于多种muc1高表达的恶性肿瘤的治疗。

本文的嵌合抗原受体(car)，从n端到c端，依次含有信号肽、抗muc1单链抗体、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序。

信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的n-末端的氨基酸序列(有时不一定在n端)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。本文的信号肽为膜蛋白信号肽，可选自cd8信号肽、cd28信号肽和cd4信号肽。在优选的实施方案中，本发明使用cd8信号肽。示范性的cd8信号肽的氨基酸序列可如seqidno：1所示。

单链抗体(scfv)是指由抗体轻链可变区(vl区)氨基酸序列和重链可变区(vh区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。本文所述的抗muc1单链抗体可以是本领域周知的针对muc1抗原的单链抗体。优选的是，该单链抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列来自针对muc1近膜端氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，该muc1近膜端氨基酸序列如seqidno:10所示。示例性的抗muc1单链抗体的氨基酸序列如seqidno:3所示。

铰链区指免疫球蛋白重链chl和ch2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。适用于本文的铰链区可选自cd8的胞外铰链区、igg1fcch2ch3铰链区、igd铰链区、cd28的胞外铰链区、igg4fcch2ch3铰链区和cd4的胞外铰链区的任意一种或多种，优选是长50个氨基酸残基以上、更优选长80个氨基酸以上的铰链区。在某些实施方案中，本文使用cd8α铰链区和igg4fcch2ch3铰链区。示例性的cd8α铰链区的氨基酸序列如seqidno：4所示。示例性的igg4fcch2ch3铰链区的氨基酸序列如seqidno:5所示。

跨膜区可选自cd28跨膜区、cd8跨膜区、cd3ζ跨膜区、cd134跨膜区、cd137跨膜区、icos跨膜区和dap10跨膜区中的一种或多种。优选地，用于本文的嵌合抗原受体的跨膜区为cd8跨膜区。示例性的cd8跨膜区的氨基酸序列可如seqidno:6所示。

共刺激信号分子胞内结构域可选自cd28、cd134/ox40、cd137/4-1bb、lck、icos和dap10胞内结构域中的一种或多种。在某些实施方案中，适用cd28的胞内结构域或cd137的胞内结构域。示例性的cd28胞内结构域的氨基酸序列可如seqidno:7所示；示例性的cd137胞内结构域的氨基酸序列可如seqidno:8所示。

免疫受体酪氨酸活化基序可为cd3ζ和/或fcεriγ的酪氨酸活化基序。示例性的cd3ζ酪氨酸活化基序的氨基酸序列可如seqidno:9所示。

形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如cd8信号肽、抗muc1单链抗体的轻链可变区和重链可变区、铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域以及免疫受体酪氨酸活化基序等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含g和s的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(a)、亮氨酸(l)、苏氨酸(t)、谷氨酸(e)、苯丙氨酸(f)、精氨酸(r)、谷氨酰胺(q)等。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的n-末端、c-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本文的car的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是flag，ha，ha1，c-myc，poly-his，poly-arg，strep-tagii，au1，ee，t7，4a6，ε，b，ge以及ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

在某些实施方案中，本文的嵌合抗原受体从n端到c端依次含有cd8信号肽、抗muc1近膜端的scfv、cd8铰链区、cd8跨膜区、cd137胞内结构域和cd3ζ酪氨酸活化基序。

在其它实施方案中，本文的嵌合抗原受体从n端到c端依次含有cd8信号肽、抗muc1近膜端的scfv、igg4fcch2ch3铰链区、cd8跨膜区、cd137胞内结构域和cd3ζ酪氨酸活化基序。

示例性的嵌合抗原受体的氨基酸序列可如seqidno:11所示。

本文还包括编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列。本文的多核苷酸序列可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。

本文所述的多核苷酸序列通常可以用pcr扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如seqidno:12所示。

本文还包括核酸构建物，其含有本文所述的编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。

调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。

在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。具体而言，可将本文car的编码序列克隆入许多类型的载体，例如这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’ltr，5’ltr，本文所述car的编码序列，以及任选的可选择的标记。

合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、eb病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。在某些实施方案中，可使用cn201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请seqidno:1所示的含mcmv增强子、hcmv增强子和ef1α启动子的ccef启动子；seqidno:2所示的含cd3e增强子和ef1α启动子的tef启动子；seqidno:3所示的含cd3e增强子、mcmv增强子、hcmv增强子和ef1α启动子的tcef启动子；seqidno:4所示的含mcmv增强子、hcmv增强子和含内含子的ef1α启动子的ccefi启动子；seqidno:5所示的含cd3e增强子和含内含子的ef1α启动子的tefi启动子；以及seqidno:5所示的含cd3e增强子、mcmv增强子、hcmv增强子和含内含子的ef1α启动子的tcefi启动子。本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文。

可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。

在某些实施方案中，本文的表达载体真核表达载体，具体是转座子载体。在某些实施方案中，该转座子载体是含有选自piggybac、sleepingbeauty、frogprince、tn5或ty的转座元件的真核表达载体。这类转座子载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’itr)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’itr)。例如，在某些实施方案中，本文的核酸构建物或表达载体从5’到3’依次含有转座子5’反向末端重复序列(5’itr)、cd8信号肽编码序列、抗muc1scfv编码序列、cd8铰链区编码序列或igg4fcch2ch3编码序列、cd8跨膜区编码序列、cd137编码序列、cd3ζ胞内信号区编码序列以及转座子3’反向末端重复序列(3’itr)。所述转座子载体还可含有转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子。在某些实施方案中，所述真核表达载体是pnb328载体。

可采用常规的方法将本文的载体导入宿主细胞中，这些方法包括显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等。在某些实施方案中，本文采用电穿孔法将本文的核酸构建物导入宿主细胞中。具体地，将重组的质粒经电转仪高压电的作用转到感兴趣的宿主细胞中。

适用于本文的宿主细胞可以是本领域周知的哺乳动物细胞，优选是t细胞，包括各种来源的各种类型的t细胞。例如，t细胞可来源于b细胞恶性肿瘤患者的pbmc。在某些实施方案中，t细胞为原代培养t细胞。

因此，本文也包括一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有本文所述嵌合抗原受体的编码序列或本文所述的核酸构建物；和/或所述重组宿主细胞表达本文所述的嵌合抗原受体。该重组宿主细胞可以是前文所述的转入了本文所述载体的宿主细胞。

用于本文嵌合抗原受体中的igg4fcch2ch3铰链区及其编码序列也包括在本文的范围之内。更具体而言，本文包括其氨基酸序列如seqidno:7所示的igg4fcch2ch3铰链区及其编码序列(包括互补序列)。

本文还包括前文提及的各种氨基酸序列、核酸序列、重组宿主细胞等的用途。具体而言，本文包括所述igg4fcch2ch3铰链区和/或其编码序列在制备本文所述嵌合抗原受体和/或其编码序列中的用途；所述嵌合抗原受体的编码序列在制备重组表达载体中的用途；所述核酸构建物在制备重组宿主细胞中的用途；以及所述重组宿主细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的用途。在某些实施方案中，本文包括所述igg4fcch2ch3铰链区和/或其编码序列、所述嵌合抗原受体和/或其编码序列以及所述核酸构建物在制备用于治疗或预防癌症的重组宿主细胞中的应用。

适用于本文所述car或其表达细胞进行治疗或预防的癌症优选muc1阳性癌症，具体包括癌细胞表面异常表达muc1的癌症，如在muc1在癌细胞表面的表达量为正常时的100倍以上、且muc1在整个细胞表面均匀分布的癌症。在具体而言，这类癌症可选自：腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。

本文还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的重组表达载体。试剂盒还可含有适用于将所述重组表达载体转入细胞中的试剂，以及任选的指导本领域技术人员将所述重组表达载体转入细胞的说明书。

本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的重组宿主细胞和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以是本领域周知的适用于细胞给药的载体，包括但不限于pnb328载体。

治疗或预防癌症的方法也包括在本文的范围之内，所述方法包括将本文所述的重组宿主细胞或药物组合物给予有需要的个体的步骤。给予的方法可以是细胞治疗中常用的方法。给予的剂量可根据病患性别、年龄、所患疾病、身体状况等因素加以考虑。

本文提供的特异性靶向muc1抗原的cart细胞能够促进t细胞的增殖，增强t细胞的体外功能，在肿瘤免疫细胞治疗或癌症治疗方面发挥细胞免疫和体液免疫的双重作用。这些细胞可以通过非mhc限制性途径特异性识别肿瘤表面抗原，发挥杀伤毒性，从而高效特异性杀灭肿瘤细胞。

下面将结合实施案例对本发明所涉及的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施案例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。此外，用理解的是，本文所用的“含有”也包括“由……组成”。

实施例1：重组质粒pnb328-muc1car1、pnb328-muc1car2、pnb328-muc1car3的构建和muc1car基因修饰t细胞的获得

1、人工合成含有信号肽(cd8信号肽或轻链信号肽)、抗原识别单链抗体(anti-muc1scfv)、铰链区(cd8铰链区或igg4fcch2ch3铰链区)、cd8跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序的muc1car外源基因(分别命名为muc1car1、muc1car2和muc1car3)，并在其上游引入多克隆酶切位点(bglii-xbai-ecori-bamhi)，在其下游插入酶切位点(sali-nhei-hindiii-spei)，委托上海捷瑞生物公司合成，将其装入用ecor1+sali双酶切的pnb328-ef1α载体中(含ef1α启动子的pnb328，pnb328载体见cn201510812654.9)构成重组质粒，分别命名为pnb328-muc1car1、pnb328-muc1car2和pnb328-muc1car3，其结构分别如图1所示。其中，cd8信号肽的氨基酸序列如seqidno:1所示；轻链信号肽的氨基酸序列如seqidno:2所示；抗原识别单链抗体的序列如seqidno:3所示；cd8铰链区的氨基酸如seqidno:4所示；igg4fcch2ch3铰链区的氨基酸序列如seqidno:5所示；cd8跨膜区的氨基酸序列如seqidno:6所示；共刺激信号分子胞内结构域的氨基酸序列如seqidno:8所示；免疫受体酪氨酸活化基序的氨基酸序列如seqidno:9所示。

2、获得muc1car基因修饰的t细胞

利用filcoll分离法从捐献者血液中分离获得外周血单核细胞(pbmcs)。将pbmc贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始t细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp，离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp，离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤。

针对每一种重组质粒，分别取两个1.5ml离心管，每管加入5×10⁶个细胞，编号a、b，1200rmp离心3min，弃上清。取电转试剂盒(来自lonza公司)，a、b管按比例加入电转试剂共100ul，a管加入6ug构建好的重组质粒pnb328-muc1car1或pnb328-muc1car2或pnb328-muc1car3，重悬混匀细胞，b管加入6ug对照质粒。将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击。使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培养液的六孔板中(含2％fbs的aim-ⅴ培养液)，混匀，置于37℃，5％co2培养箱培养。六小时后加入刺激因子il-2和包含cd3抗体、cd28抗体、il-15抗体的滋养细胞sh385(5×10⁴/孔)，37℃，5％co2培养3～4天，观察t细胞的生长情况，获得表达muc1car基因的t细胞。

实施例2：不同患者来源的pbmcs细胞经muc1car外源基因修饰活化后t细胞表达的muc1car基因表达鉴定

将重组质粒pnb328-muc1car1或pnb328-muc1car2或pnb328-muc1car3电转后的不同患者的活化t细胞按2×10⁶细胞数目收集细胞沉淀，加入80ul的2xsds-pageloadingbuffer100℃煮沸10min，-20℃保存备用。westernblotting(使用cd3ζ抗体作为一抗，hrp-羊抗人为二抗)实验检测muc1car的表达。

结果如图2所示。结果显示，t细胞可以稳定表达muc1car1和muc1car3重组蛋白，却不能表达muc1car2重组蛋白。

实施例3：不同患者来源的pbmcs细胞经muc1car外源基因修饰后t细胞基因组中muc1car基因组表达水平的检测

提取mockt细胞(电转pnb328空载体的t细胞)和muc1car-t细胞的基因组dna(试剂盒法)，实验步骤参照试剂盒内附带的说明书，测定mockt细胞和muc1car-t细胞的dna浓度，采用实时荧光定量pcr的方法检测muc1car基因组的表达水平，反应程序为:50℃，2min→95℃，10min→95℃，15s→60℃，1min，40个循环。

结果如图3所示。结果显示，经pb转座酶系统，muc1car1、muc1car2和muc1car3基因组均被整合到t细胞基因组中。

实施例4：表达muc1car的不同跨膜铰链区的muc1car-t细胞在体外对培养的肿瘤细胞的杀伤实验

选取mhcclassi分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用实时无标记细胞功能分析仪(rtca)检测细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：

(1)调零：每孔加入50μldmem或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；

(2)靶细胞铺板：宫颈癌细胞hela，乳腺癌细胞mcf7，肺癌细胞a549(购买于美国菌种保藏中心atcc)按每孔10⁴个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；

(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为8:1、4:1、2:1，以未转质粒的mockt细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线；

结果如图4所示。结果显示，表达igg4跨膜铰链区的muc1car3t细胞对肿瘤细胞的杀伤作用强于表达cd8α跨膜铰链区的muc1car1t细胞。

实施例5：流式检测muc1car3t细胞表型和细胞因子分泌的实验。

1、收集部分悬浮的muc1car3t细胞和mockt细胞，计数后以1×10⁶个细胞/管分别加入7个1.5ml的ep管中，pbs清洗两遍，1200rpm离心5min，分别加入2ul的同型对照抗体igg1-pe，荧光流式抗体anti-cd69-pe、anti-klrg1-pe，同型对照抗体igg1-pc5，荧光流式抗体anti-cd107α-pc5，同型对照抗体igg1fitc，荧光流式抗体anti-cd62l-fitc，同型对照抗体igg1-pc5，荧光流式抗体anti-cd45ro-pc5，同型对照抗体igg1-pe，荧光流式抗体anti-ccr7-pe，轻弹沉淀使其混合均匀，室温避光孵育30min，pbs清洗一遍，加入400ulpbs将细胞转移至流式管中，上机检测。

结果如图5a和5b所示。结果显示，muc1car3t细胞具有更强的杀伤活性，同时也能促进记忆t的形成，且活化标记cd69明显高于mockt细胞而衰老标记klrg1要明显低于mockt细胞。

2、用5ug/ml的muc1抗原包被24孔板，4℃包被过夜，pbs清洗3遍，加入3×10⁵的muc1car3t细胞和mockt细胞，培养24h后收集细胞上清。用bd^tmcbahumanth1/th2cytokinekitii检测muc1car3t细胞受muc1抗原刺激后细胞因子的分泌情况：

(1)混合人的il-2，il-4，il-6，il-10，tnf，ifn-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；

(2)加入50ul人的th1/th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml，2500pg/ml，1250pg/ml，625pg/ml，312.5pg/ml，156pg/ml，80pg/ml，40pg/ml，20pg/ml，0pg/ml)和50ul的待测样品(经稀释液2倍稀释)；

(3)每管加入50ul的人的th1/th2-ii-pe的检测抗体；

(4)室温避光孵育3h；

(5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200离心5min，弃上清；

(6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值；

结果如图5c所示，muc1car3t细胞分泌的il-2、il-6和ifn-γ相比于mockt细胞而言有了很大的提高，而两种细胞分泌的il-10和tnf-α并没有什么差异。

3、收集1×10⁶个的muc1car3t细胞和mockt细胞，加入1.5ml的ep管中，pbs清洗两遍，1200rpm离心5min，加入2ul的α-cd3cd4cd8抗体，室温避光孵育30min，pbs清洗一遍，加入400ulpbs将细胞转移至流式管中，上机检测。

结果如图5d所示，muc1car3t细胞和mockt细胞中cd3⁺cd4⁺，cd3⁺cd8⁺细胞所占的百分比并没有很大的差异。

实施例6：表达muc1car3t细胞的体内功能实验

第一步：4～6周龄nsg完全免疫缺陷小鼠15只，平均重量22～27g，由北京维通达生物技术有限公司提供，spf级动物实验室饲养。

第二步：体外培育人宫颈癌细胞hela，取对数生长期贴壁生长细胞，0.25％胰酶消化，离心、收集细胞后用pbs液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用pbs液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×10⁷个/ml。

第三步：于小鼠右肋背部皮下接种hela-luc细胞，0.1ml/只。接种10天左右后，通过活体成像仪观察肿瘤大小，将nsg免疫缺陷小鼠随机分为3组，每组5只小鼠，分别给予pbs、mockt细胞和muc1car3t细胞(1×10⁷个/只)1次。给药途径为直接瘤内多点注射。

第四步：每日观察小鼠的生活状态并每隔10天通过活体成像仪观察小鼠肿瘤变化。

结果如图6所示。pbs组50天时有一只小鼠死亡。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110>上海细胞治疗研究院

上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司

<120>一种靶向muc1的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途

<130>174382

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cd8信号肽

<400>1

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproser

20

<210>2

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>轻链信号肽

<400>2

metglualaproalaglnleuleupheleuleuleuleutrpleupro

151015

aspthrthrgly

20

<210>3

<211>243

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抗muc1单链抗体

<400>3

aspilevalilethrglnthrthralailemetseralaserprogly

151015

glugluvalthrleuthrcysseralathrserservalsertyrile

202530

histrppheglnglnargproglythrserprolysleutrpiletyr

354045

serthrserasnleualaserglyvalprovalargpheserglyser

505560

glytyrglythrsertyrserleuthrileserargmetglualaglu

65707580

aspalaalathrtyrtyrcysglnglnargserserserprophethr

859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

thrproasplysargleuglutrpvalalathrileserserglygly

165170175

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180185190

argaspasnalalysasnthrleutyrleuglnmetserserleulys

195200205

sergluaspthralamettyrtyrcysalaargaspasntyrglyser

210215220

sertyrasptyralametasptyrtrpglyglnglythrservalthr

225230235240

valserser

<210>4

<211>83

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cd8α铰链区

<400>4

phevalprovalpheleuproalalysprothrthrthrproalapro

151015

argproprothrproalaprothrilealaserglnproleuserleu

202530

argproglualacysargproalaalaglyglyalavalhisthrarg

354045

glyleuaspphealacysaspiletyriletrpalaproleualagly

505560

thrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcysasn

65707580

hisargasn

<210>5

<211>228

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg4fcch2ch3铰链区

<400>5

gluserlystyrglyproprocysproprocysproalaproproval

151015

alaglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleu

202530

metileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalser

354045

glngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalglu

505560

valhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheglnserthr

65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

methisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleu

210215220

serleuglylys

225

<210>6

<211>81

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cd8跨膜区

<400>6

phevalprovalpheleuproalalysprothrthrthrproalapro

151015

argproprothrproalaprothrilealaserglnproleuserleu

202530

argproglualacysargproalaalaglyglyalavalhisthrarg

354045

glyleuaspphealacysaspiletyriletrpalaproleualagly

505560

thrcysglyvalleuleuleuserleuvalilethrleutyrcysasn

65707580

his

<210>7

<211>28

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cd28胞内结构域

<400>7

prophetrpvalleuvalvalvalglyglyvalleualacystyrser

151015

leuleuvalthrvalalapheileilephetrpval

2025

<210>8

<211>42

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cd137胞内结构域

<400>8

lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet

151015

argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe

202530

proglugluglugluglyglycysgluleu

3540

<210>9

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>cd3ζ酪氨酸活化基序

<400>9

argvallyspheserargseralaaspalaproalatyrglnglngly

151015

glnasnglnleutyrasngluleuasnleuglyargarggluglutyr

202530

aspvalleuasplysargargglyargaspproglumetglyglylys

354045

proargarglysasnproglngluglyleutyrasngluleuglnlys

505560

asplysmetalaglualatyrsergluileglymetlysglygluarg

65707580

argargglylysglyhisaspglyleutyrglnglyleuserthrala

859095

thrlysaspthrtyraspalaleuhismetglnalaleuproproarg

100105110

<210>10

<211>233

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>muc1近膜端氨基酸序列

<400>10

proalaproglyserthralaproproalahisglyvalthrserala

151015

proaspasnargproalaleuglyserthralaproprovalhisasn

202530

valthrseralaserglyseralaserglyseralaserthrleuval

354045

hisasnglythrseralaargalathrthrthrproalaserlysser

505560

thrpropheserileproserhishisseraspthrprothrthrleu

65707580

alaserhisserthrlysthraspalaserserthrhishisserser

859095

valproproleuthrserserasnhisserthrserproglnleuser

100105110

thrglyvalserphephepheleuserphehisileserasnleugln

115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

alaglnserglyalaglyvalprogly

225230

<210>11

<211>728

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合抗原受体氨基酸序列

<400>11

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargproseraspilevalilethrglnthrthralaile

202530

metseralaserproglyglugluvalthrleuthrcysseralathr

354045

serservalsertyrilehistrppheglnglnargproglythrser

505560

prolysleutrpiletyrserthrserasnleualaserglyvalpro

65707580

valargpheserglyserglytyrglythrsertyrserleuthrile

859095

serargmetglualagluaspalaalathrtyrtyrcysglnglnarg

100105110

serserserprophethrpheglyserglythrlysleugluilelys

115120125

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglu

130135140

vallysleuglugluserglyglyaspleuvallysproglyglyser

145150155160

leulysleusercysalaalaserglyphethrpheserargtyrgly

165170175

metsertrpvalargglnthrproasplysargleuglutrpvalala

180185190

thrileserserglyglythrtyriletyrtyrproaspservallys

195200205

glyargphethrileserargaspasnalalysasnthrleutyrleu

210215220

glnmetserserleulyssergluaspthralamettyrtyrcysala

225230235240

argaspasntyrglysersertyrasptyralametasptyrtrpgly

245250255

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260265270

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275280285

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290295300

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305310315320

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325330335

proargglugluglnpheglnserthrtyrargvalvalservalleu

340345350

thrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslys

355360365

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370375380

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385390395400

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420425430

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485490495

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530535540

phealacysaspiletyriletrpalaproleualaglythrcysgly

545550555560

valleuleuleuserleuvalilethrleutyrcysasnhislysarg

565570575

glyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemetargpro

580585590

valglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargpheproglu

595600605

gluglugluglyglycysgluleuargvallyspheserargserala

610615620

aspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyrasngluleu

625630635640

asnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplysargarggly

645650655

argaspproglumetglyglylysproargarglysasnproglnglu

660665670

glyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalaglualatyrser

675680685

gluileglymetlysglygluargargargglylysglyhisaspgly

690695700

leutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyraspalaleu

705710715720

hismetglnalaleuproproarg

725

<210>12

<211>2184

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合抗原受体的编码序列

<400>12

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60

ccgagcgatattgtgatcacccagactacagcaatcatgtctgcatctccaggggaggag120

gtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaagttacatacactggttccagcagagg180

ccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccct240

gttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggag300

gctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggc360

tcggggacaaagttggaaataaaaggtggaggcggttcaggcggaggtggcagcggcggt420

ggcgggtcggaggttaagctggaggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtcc480

ctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggtt540

cgccagactccagacaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttac600

atctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaac660

accctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgca720

agggataactacggtagtagctacgactatgctatggactactggggtcaaggaacctca780

gtcaccgtctcctcagagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctccc840

gtggccggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcc900

cggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccag960

ttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggag1020

cagttccagagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg1080

aacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaa1140

accatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcc1200

caggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctacccc1260

agcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacg1320

cctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaag1380

agcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaac1440

cactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaattcgtgccggtcttcctgcca1500

gcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcg1560

cagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacg1620

agggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccctggccgggacttgtggg1680

gtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaaacggggcagaaagaag1740

ctcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagat1800

ggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttc1860

agcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctc1920

aatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgag1980

atggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaa2040

gataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaag2100

gggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgccctt2160

cacatgcaggccctgccccctcgc2184