一种霉菌和酵母计数测试片、制备方法及其应用与流程

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种霉菌和酵母计数测试片、制备方法及其在检测食品中霉菌和酵母计数方面的应用。

背景技术：

霉菌和酵母计数测定指标是反映食品卫生质量的重要指标，用来判定食品被污染的程度。霉菌和酵母计数测定是我国饮料、坚果制品、米面制品、糕点类等食品的检测指标，也是食品风险预测和危害评估的重要监测项目。目前gb4789.15《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》采用霉菌和酵母平板计数法，该方法需要进行培养基配制、灭菌、玻璃器皿清洗等工作，程序繁琐，工作量大。微生物测试片类检测产品计数便捷，使用起来只需要样品制备、增殖培养和计数步骤，省去了配制培养基、消毒灭菌和培养器皿的清洗处理等大量辅助性工作，是国内外进行微生物污染计数测定最好的检测产品。

现有商业化微生物测试片检测产品中，美国3m公司的petrifilm^tm测试片在世界各地应用广泛，国内北京陆桥科技有限公司等多家企业也相继推出系列国产测试片产品，还有一些测试片处于研发和小范围使用阶段。虽然这些测试片具有方便实用的突出优势，但霉菌和酵母计数测试片尚存在一些关键技术瓶颈需解决。突出问题集中在三个方面：即霉菌菌丝蔓延生长影响计数甚至导致无法计数，霉菌菌落显色颜色深覆盖酵母菌，造成计数结果偏差大；酵母菌生长慢、菌落小，检测周期长；菌落显色不能指示所有霉菌和酵母菌，需要完善，防止漏检。本发明针对上述存在问题研制了霉菌和酵母菌计数测试片，采用两种特异性酶底物显色方法，即脂肪酶的特异性显色底物棕榈酸对硝基苯酯和碱性磷酸酯酶的特异性显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯；添加了显色促进因子乙醇、硫酸铜、氯化钙、氯化锌，加快菌落显色，缩短测试片检测时间；通过硫酸镁、磷酸二氢钾和硫酸铁等无机盐的联合使用，控制霉菌菌丝蔓延生长，使菌落大小适中，霉菌和酵母菌均呈色清晰、计数准确。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种操作简单、价格低廉、检测准确的霉菌和酵母计数测试片，该测试片从上至下依次由带有粘性下表面的透明塑料上层膜(如透明度高、无毒无刺激性气味、防水透气的pet硅胶膜，厚度为0.05mm～0.10mm，pet硅胶膜的下表面自身带有粘性)、带有镂空区域的塑料中层板(如硬度较好的聚丙烯(pp)塑料板或pet塑料板，厚度为0.15mm～0.30mm)、印刷有方格的底板(如防水、防渗透的白色铜版纸，厚度为0.10mm～0.20mm；方格的尺寸范围是1cm～2cm×1cm～2cm)组成；以上材料耐高温的温度范围为130℃～150℃；透明塑料上层膜的粘性下表面涂覆有复配冷水(温度范围是20℃～45℃)可溶性凝胶，塑料中层板的镂空区域为圆形、椭圆形或方形结构，镂空区域面积与塑料中层板面积的比例范围为1：1.6～2.7，在镂空区域填充有形状与镂空区域相同的浸渍有霉菌和酵母计数显色检测培养基的灭菌无纺布。

复配冷水可溶性凝胶组分为：将经研磨后过100～150目标准筛的聚丙烯酸钠和瓜尔胶混合，按聚丙烯酸钠和瓜尔胶的重量和100％计算，聚丙烯酸钠的重量百分含量为15～25％，其余为瓜尔胶。

霉菌和酵母计数显色检测培养基重量组份为：蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，乙醇4～10ml，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，硫酸镁2～6g，磷酸二氢钾0.3～1.0g，硫酸铁0.3～1.0g，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(bcip)0.1～0.4g，棕榈酸对硝基苯酯0.1～0.4g，氯霉素0.05～0.2g和蒸馏水1000ml。

以灭菌无纺布作为显色检测培养基的载体，其规格为密度50～80g/m²的水刺无纺布。

本发明另一个目的是提供上述霉菌和酵母计数测试片的制备方法，其步骤如下：

(1)霉菌和酵母计数显色检测培养基的制备

称取蛋白胨10～20g，葡萄糖10～20g，乙醇2～8ml，硫酸铜0.1～0.3g，氯化钙0.1～0.3g，氯化锌0.05～0.25g，硫酸镁2～6g，磷酸二氢钾0.3～1.0g，硫酸铁0.3～1.0g，氯霉素0.05～0.2g，加入蒸馏水900ml，经121℃高温灭菌15～20min，得到液体培养基；用100ml蒸馏水将0.1～0.4g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(bcip)溶解，用孔径0.22μm的一次性过滤器过滤除菌；用2ml乙醇将0.1～0.4g的棕榈酸对硝基苯酯溶解；将这两种溶液加入到灭菌后的液体培养基中，得到混合液体培养基；将厚度0.10mm～0.20mm、密度50～80g/m²的灭菌无纺布充分浸泡在混合液体培养基中，浸泡的时间为15min～30min，再于无菌、45℃～50℃条件下烘干，得到含有霉菌和酵母计数显色检测培养基的灭菌无纺布；

(2)复配冷水可溶性凝胶的制备

将经研磨后过100～150目标准筛的聚丙烯酸钠和瓜尔胶混合，得到复配冷水可溶凝胶粉末，其中聚丙烯酸钠的重量百分含量为15～25％；

(3)霉菌和酵母计数测试片的制备

将透明塑料上层膜、塑料中层板和印刷有方格的底板剪裁成相同尺寸(长度9～12cm，宽度8～10cm)，用聚丙烯酸树脂压敏胶(透明、无毒、无味、无菌)将贴有标签的一侧封闭粘合，粘合宽度为4～6mm；

将上述复配冷水可溶凝胶粉末均匀地涂在透明塑料上层膜的粘性下表面上，厚度为0.10mm～0.20mm；

在塑料中层板镂空区域露出的底板上均匀涂覆聚丙烯酸树脂压敏胶，厚度为0.05mm～0.10mm，将浸渍有霉菌和酵母计数显色检测培养基的灭菌无纺布放在塑料中层板的镂空区域内并压实；

进行真空包装，然后采用环氧乙烷灭菌法进行灭菌，从而得到霉菌和酵母计数测试片。

(3)测试片法霉菌和酵母菌计数测定的操作步骤

固体或半固体样品：称取25g样品(样品可以是米面制品、糕点类食品、坚果制品)，加入225ml无菌稀释液(蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液)，充分振摇或用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1：10的稀释匀液。

液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品(样品可以是饮料)置于盛有225ml无菌稀释液(蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液)的容器或无菌均质袋中，充分振摇或用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1：10的稀释匀液。

取1ml1：10的稀释匀液加入盛有9ml无菌稀释液的试管中，在漩涡混合器上混匀，得到1：100的稀释匀液；依次制备10倍梯度稀释匀液，备用。

根据对样品污染状况的估计，选择2～3个适宜稀释度的稀释匀液，掀开霉菌和酵母菌计数测试片的透明塑料上层膜，取上述样品的稀释匀液1ml加至中层浸渍有霉菌和酵母计数显色检测培养基的灭菌无纺布上，使样品稀释匀液均匀分布于整个培养区；将塑料上层膜缓缓落下，避免挤压，静置30s～1min待复配冷水可溶性凝胶与水固化，放入恒温培养箱于25～30℃培养40～50h，按照国家食品安全标准gb4789.15《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行计数。同时，分别取1ml生理盐水作空白对照。

本发明研制的是霉菌和酵母计数测试片，与同类产品相比，突出特征在于该测试片培养基的组分和用量，该选择性显色培养基由基础营养培养基、无机盐、抑菌剂、显色剂及显色促进因子组成。主要包括3个重要特征。

重要技术特征1：本发明通过无机盐的组成和用量设计与优化，显著改善了测试片中霉菌和酵母菌的生长和显色性能，有效控制了霉菌菌丝过度生长影响计数和酵母菌生长慢导致检测时间长的技术难题。试验结果表明，通过对无机盐浓度的控制可实现抑制霉菌菌丝蔓延生长和促进酵母菌生长。其中mg²⁺在霉菌和酵母计数测试片中发挥了重要作用。在常规微生物培养基中mg²⁺可以作为一种微量元素被微生物利用，在国标孟加拉红培养基中mg²⁺用量是0.5g/l，在本发明试验研究结果表明，4g/lmg²⁺对霉菌孢子的形成无影响，霉菌检测计数结果正确，但能极显著抑制霉菌菌丝生长，有效解决了霉菌蔓延生长菌落过大导致计数准确性差的问题。mg²⁺还作为一种酶的激活剂，mg²⁺对碱性磷酸酯酶有激活作用、可增敏5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯显色反应的灵敏度。此外，本发明还研究了不同浓度的硫酸镁、磷酸二氢钾和硫酸铁对霉菌和酵母菌生长状态的影响，通过试验分析优选了硫酸镁、磷酸二氢钾和硫酸铁的最佳组合，即4g/lmg²⁺、0.2g/l的k⁺和fe²⁺，该浓度组合可以最大程度地抑制霉菌菌丝生长，促进霉菌孢子的形成与酵母菌生长，还可以增敏碱性磷酸酯酶与显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯的显色反应。

重要技术特征2：基于凝胶特性与质构分析，首次对培养基组分和浓度与冷水可溶性凝胶质构特性进行了研究，研究了无机盐离子浓度对测试片培养基凝胶质构的影响，筛选出最适无机盐浓度，使测试片的培养基组分、冷水可溶性凝胶与检测样液形成具有网状结构的胶体，为微生物在测试片上的生长提供良好的环境。实验结果表明，无机盐离子浓度对凝胶质构有很大影响，而且变化趋势与无机盐离子浓度对菌落生长速率的影响相一致。优化后测试片的凝胶质构与国标法平板的质构无显著性差异，凝胶形成的网状空间结构利于霉菌和酵母菌的生长。

重要技术特征3：研制了复合酶底物型霉菌和酵母菌测试片。本发明显色剂基于酶底物型显色，显色剂选择了两种特异性酶的显色底物，可指示食品污染中常见霉菌和酵母菌产生的特异性酶并显色，提高了检测准确率和效率。与同类研究相比，采用了双酶底物与显色促进因子复配，48h可获得准确测定结果(国标方法检测周期5天)，显著缩短检测时间，计数结果也更加准确。其中，显色剂为5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(bcip，碱性磷酸酯酶的底物)和棕榈酸对硝基苯酯(脂肪酶的底物)两种显色剂复配。棕榈酸对硝基苯酯经脂肪酶水解使菌落显黄色。5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯bcip经碱性磷酸酯酶水解使菌落显蓝色。计数测试片上的蓝色和黄色菌落就可以报告检测结果；本发明还通过添加优选浓度的显色促进因子乙醇、硫酸铜、氯化钙和氯化锌，促进显色酶底物与特异性酶的酶促反应，霉菌和酵母菌菌落生成就能显色，缩短显色所需时间，同时霉菌和酵母菌所呈现的颜色不相互覆盖，菌落颜色清晰，计数准确。特别要说明的是优选浓度的乙醇对显色效果具有重要作用，实验结果表明，低浓度乙醇可以促进霉菌和酵母菌的显色反应。培养至48h时霉菌和酵母菌的显色结果表明，未添加乙醇组的霉菌和酵母虽有菌落出现，但还没有显色，而添加乙醇的霉菌和酵母菌有菌落出现就会显色。当浓度为4～10ml/l时显色效果良好。同时实验结果也表明该浓度的乙醇对霉菌和酵母生长无抑制作用，这是首次提出低浓度乙醇在该类测试片中应用。

本发明基于上述组分制备的霉菌和酵母计数测试片，加入待检食品样品稀释液于中层板培养区域后，在无纺布上的培养基与上层的复配冷水可溶性凝胶混合，在凝胶吸水过程中形成稳定的、孔隙适中又具有致密网状空间的凝胶胶体，尤其适合测试片环境下的霉菌和酵母生长与菌落形成。利用本专利的霉菌和酵母计数测试片检测多类食品中霉菌和酵母菌落总数，程序简便、菌落呈色清晰、计数准确。这种测试片将在食品生产企业出厂检验、卫生防疫、市场监督、商检及进出口检疫领域有着较为广阔的应用前景。

附图说明

图1：霉菌和酵母计数测试片结构示意图；

如图1所示，各部分为：标签1、上层透明pet硅胶膜2、中间带有镂空区域的透明聚丙烯塑料中层板3、培养区域4、白色铜版纸5；

图2：本发明霉菌和酵母计数测试片回归方程与相关系数曲线；

具体实施方式

实施例1霉菌和酵母计数测定培养基的制备

霉菌和酵母计数显色检测培养基的原始重量组分：蛋白胨15g，葡萄糖15g，乙醇10ml，硫酸铜0.2g，氯化钙0.2g，氯化锌0.15g，硫酸镁4g，磷酸二氢钾0.7g，硫酸铁0.71g，5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(bcip)0.2g，棕榈酸对硝基苯酯0.2g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000ml。

霉菌和酵母计数检测培养基的制备方法是：将15g蛋白胨，15g葡萄糖，8ml乙醇，0.2g硫酸铜，0.2g氯化钙，0.15g氯化锌，4g硫酸镁，0.7g磷酸二氢钾，0.71g硫酸铁，加入900ml蒸馏水中，加热、搅拌溶解后，121℃高压灭菌15min，冷却至室温；另将0.2g棕榈酸对硝基苯酯用2ml乙醇溶解，0.2g的bcip用100ml蒸馏水溶解后，用一次性过滤器0.22μm条件下过滤除菌后，将这两种溶液加入到前述的液体培养基中，搅拌混匀。将密度为60g/m²，直径为6cm的灭菌无纺布浸在上述液体培养基中充分浸泡15min后，经无菌烘箱45℃烘干后，粘贴于培养区域，备用。

复配冷水可溶性凝胶的制备方法是：将冷水可溶性凝胶瓜尔胶、聚丙烯酸钠分别研磨成粉末，过120目分子筛，按瓜尔胶和聚丙烯酸钠的重量百分含量80％和20％充分混匀，备用。

实施例2霉菌和酵母计数测试片的制备

1)测试片由三层组成，分别为上层pet硅胶膜、中层带有镂空区域的聚丙烯塑料板、底板白色方格铜板纸。三部分均裁剪成10.5cm×9cm，中间镂空区域(直径为6cm的圆形)与底板粘合成培养区，底板上印有淡橘色1cm×1cm的方格，方便计数。将上、中、下三部分用聚丙烯酸树脂压敏胶将标签一侧边缘互相粘合，粘合宽度为5mm。

2)将复配冷水可溶凝胶粉末，均匀地涂在测试片上层膜里侧，厚度为0.15mm，每片测试片的冷水凝胶质量为0.2g。

3)以密度为60g/m²，直径为6cm圆形的无纺布为培养基载体。

4)在中层镂空区域对应的底板上先均匀涂上透明聚丙烯酸树脂压敏胶0.2g，再将载有培养基的无纺布粘贴到培养区。

5)将测试片进行真空包装。

6)采用环氧乙烷灭菌法进行测试片灭菌。

实施例3利用测试片测定食品中霉菌和酵母计数的方法

1)以无菌操作称取待检食品样本25g(待检样品可以是米面制品、饼干、蛋糕等固体食品)或待检食品样品(待检样品可以是饮料等液体食品)25ml加入到225ml稀释液的无菌均质袋中，用均质器拍打1～2min，制成1：10的样品匀液。对上述样品均液做10倍系列梯度稀释，根据样品的污染程度，选择2～3个稀释度，每个稀释度做两个平行样品。

2)取待检食品样品稀释液1ml，掀开测试片的上层膜，加至培养基区域中，使样液均匀分布于整个培养区，将上膜缓缓落下，避免手指挤压，静置30s待凝胶固化，放入培养箱于28℃培养48h。每个稀释度做两个平行样品，同时取1ml生理盐水作空白对照。

3)将完成增殖培养的测试片放入无菌操作台，观察其有无黄色和蓝色菌落，并对黄色和蓝色菌落进行计数。计数方法按照gb4789.15《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行计数。

若所有稀释度的测试片上菌落数均大于150cfu，则对稀释度最高的测试片进行计数，其他测试片可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

若所有稀释度的测试片菌落数均小于10cfu，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

若所有稀释度(包括液体样品原液)测试片均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

若所有稀释度的测试片菌落数均不在10cfu～150cfu之间，其中一部分小于10cfu或大于150cfu时，则以最接近10cfu或150cfu的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

实施例4：霉菌和酵母计数测试片测定效果评价

1)按实施例1和实施例2制备霉菌和酵母计数测试片，备用。

2)测试片检测限和灵敏度的测定

实验菌株为白假丝酵母ccic1965和黑曲霉ccic2487。

分别取白假丝酵母和黑曲霉单菌落接种于100mlyepd液体培养基(蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母浸粉10g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000ml，ph值为7.0)中，放入摇床于28℃、200r/min振荡培养12h，取1ml菌液加入9ml生理盐水混匀，制成稀释液1，重复以上操作将菌液稀释至适宜计数的稀释度(浓度为10⁰～10²cfu/ml)，取1ml菌液按照实施例3中的方法使用测试片测定霉菌和酵母菌落数。同时按照gb4789.15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行霉菌和酵母计数测定，每个稀释度做两个平行样品，检测结果取平均值。

以最低稀释度菌落数的检测结果作为最低检测限，以最低检测限作为测试片灵敏度的检测标准，检测结果大于最低检测限的为阳性，检测结果小于最低检测限的为阴性，灵敏度＝阳性/(阳性+阴性)，实验结果表明，两种方法可以达到相同水平的检出限，检测限为1cfu/ml，灵敏度为100％。本发明研制的霉菌和酵母菌测试片检测结果与国标平板法无差异显著性(p>0.05)，r²达到0.9985，具有很好的相关性。见表1和图2。

表1：测试片准确度和灵敏度测定数据

2)测试片特异性检测

将实验菌株白假丝酵母菌、黑曲霉等23株霉菌和酵母菌分别接种于100mlyepd液体培养基(蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母浸粉10g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000ml，ph值为7.0)中，28℃恒温摇床200r/min振荡培养12h，制备成原菌液备用。将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡糖球菌等5株细菌分别接种于100mllb液体培养基(酵母浸粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，1000ml蒸馏水，ph值为7.0)中，于37℃恒温摇床200r/min振荡培养12h，制备成原菌液备用。取25ml原菌液加入225ml无菌生理盐水，重复以上操作，制备10倍系列稀释的菌液，采用本发明霉菌和酵母菌测试片实例3方法和gb4789.15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》进行13株酵母菌和10株霉菌、5株细菌的菌落总数计数测定。

实验结果表明，13株酵母菌和10株霉菌在培养48h均能生长并显色，5株细菌不生长，测试片特异性良好。测试片法与gb4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》的霉菌和酵母测定计数结果无差异显著性(p>0.05)，计数结果准确。实验结果见表2。

表2：测试片特异性检验数据

3)测试片应用于食品样品检测

称取25g或吸取25ml食品样品，加入225ml无菌生理盐水，用拍击式均质器拍打混匀，制成1：10样品匀液。处理后的食品样品匀液中加入1ml霉菌和酵母菌混合液，进行食品样品人工污染。对人工污染样液进行10倍系列稀释，取1：10的稀释液1ml加入到9ml生理盐水中，充分混匀，制成1：100稀释液，重复以上操作将样液稀释至3个适宜计数的稀释度(浓度为10⁰～10²cfu/ml)，按照实施例3的方法进行霉菌和酵母菌菌落总数计数测定，比较测试片测定与国家标准方法测定结果的符合度。

表3：两种方法检测食品样品结果比较及符合率数据

使用霉菌和酵母菌测试片法和国标法分别对120份人工污染的食品样品检测，检验结果如表3所示，数据显示两种方法酵母菌的符合率最高可达到99.0％，霉菌的符合率最高可达到99.0％，两种方法检测结果无差异显著性(p>0.05)，结果表明：霉菌和酵母菌计数测试片适合用于食品中霉菌和酵母菌总数的检测。