利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧-2-氨基腺苷的方法与流程

本发明属于生物医药中生物发酵技术领域，涉及嘌呤脱氧核苷的生物合成，具体涉及利用密西根克雷伯氏菌合成2'-脱氧-2-氨基腺苷的方法。

背景技术：

克雷伯氏菌属(klebsiella)为革兰氏阴性杆菌。主要有肺炎克雷伯氏菌(k.peneumoniae)、臭鼻克雷伯氏菌(k.ozaenae)和鼻硬结克雷伯氏菌(k.rhinoscleromatis)。生物学性状：为较短粗的杆菌，大小0.5-0.8×1-2um,单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。营养要求不高，有普通琼脂培养基上形成较大的灰白色粘液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。

具有o抗原与k抗原，后者用以分型。利用荚膜肿胀试验，本属k抗原可分为82型。肺炎克氏菌大多属3型和12型；臭鼻克氏菌主要属4型，少数为5型或6型；鼻硬结克氏菌一般属3型，但并非所有3型均为该菌。本属细菌在55℃、30分钟内被杀死，在培养基上可存活数周至数月。

2'-脱氧-2-氨基腺苷(dda)简称2-氨基脱氧腺苷，是精细化工、农药和医药的重要中间体，特别在医药领域，主要用于合成抗艾滋病、抗癌、治疗高血压等方面药物，应用非常广泛。其合成方法主要为化学合成法，采用生物合成从胸苷和2,6-二氨基嘌呤直接转化为2'-脱氧-2-氨基腺苷仍然没有突破性进展。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明工艺采用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源将胸苷和2,6-二氨基嘌呤转化为2'-脱氧-2-氨基腺苷，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。

本发明技术方案转化过程包括：菌体制备、固定化酶制备、酶促反应和产品提取等四个过程。详细工艺流程如图1所示。

微生物信息：本发明所采用密西根克雷伯氏菌，其拉丁名为以及具体实施方式所使用的密西根克雷伯氏菌(klebsiellamichiganensis)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.16111。

保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2018年07月16日。

一、菌体制备

1.1菌体活化及产酶培养

菌种：klebsiellamichiganensis(密西根克雷伯氏菌)

菌株编号：dur201505001

菌株保藏号：cgmcc16111

活化培养基：酵母膏5g/l、氯化钠10g/l、蛋白胨10g/l、ph7.0

培养条件：38℃、200rpm、12h

产酶培养基：酵母膏75g/l、氯化钠15g/l、玉米浆60ml/l、氯化钙0.8g/l、七水硫酸镁0.6g/l、一水硫酸锰0.8g/l、氯化锌0.1g/l、ph7.0

培养条件：38℃、do≥50％、14h

1.2菌体收集

产酶培养液离心处理，然后湿菌体用ph7.0、20mmol/l的磷酸二氢钾缓冲液洗涤，离心所得湿菌体-20℃冷冻保存备用。

二、固定化酶制备

2.1提酶

利用超声波细胞破碎法处理菌悬液，离心上清即酶液。

超声处理条件：菌悬液配方：tris-hcl50mn、edta5mn、ph8.0、菌体浓度60％

破碎条件：1600w、35℃、30min

离心条件：7000rpm、30min

2.2活化树脂

(1)水洗

称量适量的新树脂用纯化水洗至无混浊(5-8次)，然后抽滤后用适量pbs缓冲液浸泡5-10h。

(2)戊二醛交联

抽滤除掉pbs缓冲液，然后加入10倍体积的0.5％戊二醛溶液，25℃水浴搅拌12-15h。

(3)水洗

交联后的树脂抽滤出去戊二醛溶液，然后用纯化水洗干净后待用。2.3酶联

活化树脂与酶量按照1:1.5比例混匀，20℃水浴搅拌12-15h，然后水洗至中性待用。

三、酶促反应

3.1反应体系配制

胸苷50-200g/l；2,6-二氨基嘌呤50-200g/l；固定化酶量50-200g/l；

反应体系：纯化水

3.2反应条件

待反应体系配制完成以后200rpm搅拌，55-65℃水浴反应72h，然后，抽滤得合成液，进行下一步提取工序。

四、产品提取

4.1浓缩

酶促反应结束后，抽滤得2'-脱氧-2-氨基腺苷(dda)合成液，旋蒸浓缩得粗品。

4.2热溶

检测粗品中产物含量，按照粗品中2'-脱氧-2-氨基腺苷含量用适量碱乙醇热溶，抽滤后得粗品溶液。

4.3干燥

将粗品溶液旋蒸干燥得到2'-脱氧-2-氨基腺苷粗品。

4.4精制

根据粗品中杂质含量，将2'-脱氧-2-氨基腺苷粗品溶于适量的碱水溶液中，然后抽滤得沉淀，干燥后得2'-脱氧-2-氨基腺苷纯品。

进一步地，在上述技术方案中，该工艺反应体系为纯化水，以胸苷和2,6-二氨基嘌呤为底物一步合成目标产物2'-脱氧-2-氨基腺苷，成本低廉环保易操作适合工业化。

进一步地，在上述技术方案中，提取工序中，该工艺该工艺产物积累浓度最高达450mmol/l以上，固定化酶与反应液易分离，产物易提取，收率高(≥90％)。

发明有益效果

1)酶促工序

菌种：该工艺首次利用密西根克雷伯氏菌为菌种，利用该菌株湿菌体为酶源转化胸苷和尿嘧啶合成脱氧尿苷，工艺简单，成本低廉且易操作适合工业化。

反应体系：该工艺使用的反应体系为纯化水(参考文献中是利用pbs和tris-hcl)，以胸苷和2,6-二氨基嘌呤为底物酶促合成目的产物2'-脱氧-2-氨基腺苷，成本低廉环保易操作适合工业化。

固定化酶：该工艺利用细胞破碎后酶液与树脂载体结合，使脱氧核糖转移酶固定于树脂载体上，工艺简单，固定化酶可以长时间保持活力(连续使用30天以上，转化率保持在80％以上)，固定化树脂载体可以回收重复利用，成本低廉且易操作适合工业化。

胸苷(dt)转化率：[dda(mmol/l)/起始dt(mmol/l)]×100％

反应效率高：利用该工艺生产2'-脱氧-2-氨基腺苷与文献报道相比，反应速度快且转化率高，底物胸苷转化率达到90％以上，底物胸苷浓度高达500mmol/l，操作简单，易工业化。

2'-脱氧-2-氨基腺苷(dda)收率：[dda成品质量/dda实际质量]×100％

环保压力小：该工艺是利用固定化脱氧核苷转移酶为酶源，以纯化水为反应体系连续快速酶促合成2'-脱氧-2-氨基腺苷，既提高了酶的利用率，既降低成本，又大大减少了废液排放量。

2)提取工序

产物易提取、收率高：该工艺产物积累浓度最高达450mmol/l以上，固定化酶与反应液易分离，产物易提取，收率高(≥90％)。

环保：该工艺使用碱乙醇和碱水为溶剂,提取工艺简单且成本低,溶剂可重复套用，实现了零排放，工艺环保且适合工业化。

产品质量高：利用该工艺生产得到的目的产物2'-脱氧-2-氨基腺苷与其他工艺相比，由于反应体系为纯化水、合成液中各个组分非常明确，产物易提取，产品质量高，成品含量≥99.9％(市场销售一般为≥98％)。

附图说明

图1为发明内容中转化过程详细工艺流程图；

图2为实施例1中1.1培养温度对菌体生长和酶活性的影响；

图3为实施例1中1.2不同ph下培养20h的菌体浓度和酶活；

图4为实施例1中1.3dur201505001菌株发酵产酶曲线；

图5为实施例1中2.1不同反应温度下底物转化率；

图6为实施例1中2.2反应体系ph值对转化率的影响；

图7为实施例1中2.3不同底物配比下胸苷转化率；

图8为实施例1中2.4底物浓度与转化率关系曲线；

图9为实施例1中2.5反应时间与胸苷转化率曲线；

图10为实施例1中2.6酶量与底物转化率的关系。

具体实施例

实施例1

转化反应条件优化

1.产酶培养条件优化

1.1dur201505001菌株最适培养温度

将培养20h的种子培养液按5％接种量接种于产酶培养基中，600l/h通风量，分别在28-42℃温度范围不同温度条件下500rpm搅拌培养20h，测定培养液od660、酶活(图2)。结果表明dur201505001菌株在28-38℃培养温度范围内菌体量和酶活性都随培养温度升高而增加，高于38℃酶活变化不明显或有所下降，但菌体生长量开始明显下降。因此，选择dur201505001菌株在产酶培养基中最适培养温度为38℃左右。

1.2dur201505001菌株菌体最适培养ph值

将培养20h的种子培养液按5％接种量接种于产酶培养基中，通风量600l/h，搅拌速度500rpm，培养温度38℃,分别测定不同ph条件下培养20h培养液的od660、酶活(图3)。结果表明：菌体生长的ph范围为7.0-7.5，低于或高于此范围，菌体生长量明显下降；在酸性ph范围内，单位湿菌体的酶活随ph升高而增加，在ph7.0-7.5范围内达到最大值，ph高于7.5酶活明显下降。考虑菌体生长、酶活及总酶量等因素，dur201505001菌株生长和产酶的适宜ph为7.0左右。

1.3dur201505001菌株发酵产酶曲线

以接种量5％接种dur201505001于产酶发酵培养基，培养温度38℃，ph7.0，通气量600l/h，500r/min搅拌条件下，定时取样测定培养过程发酵液od660nm、酶活，绘制生长曲线和产酶曲线(图4)。结果表明：发酵液菌体浓度在小于16h范围内增加迅速，培养16h以后变化不明显；在发酵最初的12h酶活性随着培养时间延长而迅速提高，表现为与菌体生长呈平行关系，培养时间达到16h之后单位湿菌体酶活均达到最大值，酶活曲线呈现一平台期。因此适宜的产酶培养时间为16h以上。

2反应条件优化

在初始反应体系基础上进行固定化酶促合成2'-脱氧-2-氨基腺苷反应条件优化试验，包括对酶量、底物浓度、配比、ph值、反应温度及时间等条件的优化，以期达到提高底物转化率和降低成本的目的。2.1酶促反应的最适温度

利用初始反应体系，在不同温度条件下进行酶促转化反应48h，测定目的产物含量，计算底物转化率(图5)。结果表明：在较宽的温度范围内，上述反应体系都可以将2，6-二氨基嘌呤转化为2'-脱氧-2-氨基腺苷，在30-50℃温度范围内，随温度升高转化效率不断提高，说明提高温度可以提高酶促反应速度，在55℃时转化率达到最大值；进一步升高温度，转化率下降，温度高于60℃转化率下降迅速，表明过高的温度条件酶活失活严重，不利于转化反应。结果显示，固定化酶促合成2'-脱氧-2-氨基腺苷的最佳酶促反应温度为55℃左右。

2.2酶促反应的最适ph值

利用上述反应体系，调整溶液ph值，进行固定化酶促反应48h，测定目的产物含量，计算不同ph条件下的底物转化率(图6)。结果显示：底物转化率在ph值6.0-7.5范围内达到最大值，ph值过高或过低转化率都迅速降低。故此选择固定化酶促反应最适ph值为7.0左右。

2.3最适底物浓度配比的确定

在上述反应体系基础上，分别调整两种底物的配比进行酶促转化反应48h，测定目的产物含量，计算底物转化率(图7)。结果表明：2,6-二氨基嘌呤/胸苷摩尔比值在0.6-1.8范围内，胸苷转化率随着底物配比的增加而快速增大，大于1.8后转化率变化不明显。因此，选择2，6-二氨基嘌呤/胸苷的最佳配比值为1.8以上。

2.4最适底物浓度的确定

在上述反应体系中，分别调整底物的浓度，酶促反应48h，测定目的产物含量，计算不同条件条件下底物转化率，绘制不同浓度条件下的转化率曲线(图8)。结果表明：当胸苷浓度小于500mmol/l的范围内时，胸苷转化率变化不明显，而大于500mmol/l之后，转化率下降比较明显。根据上述结果，在底物转化率变化不大的情况下提高底物浓度，可充分利用酶的催化潜力，提高生产能力，从而降低生产成本，故此确定胸苷最适反应浓度为500mmol/l以下。

2.5最适反应时间的确定

在上述优化的反应条件下，测定转化反应不同时间的产物浓度，计算底物转化率(图9)。结果表明：随着反应时间延长，产物不断积累，底物胸苷转化率随反应时间的增加而快速增加，反应时间达到72小时之后产物浓度变化不明显。因此，收获产物的适宜时间可选择为72小时以后。

2.6最适酶量的确定

在上述最适反应条件下，固定其它条件不变，在4-18％范围改变酶量，分别进行转化反应，测定转化反应48h产物浓度，计算底物转化率(图10)。结果显示：在酶量4-12％范围内，转化率随酶量的增加而快速增加，之后变化不明显。由于固定化酶具有重复利用多次的特性，所以可选择14％或略高如16％的酶量为最适酶量。

实施例2

100l规模固定化酶促合成2'-脱氧-2-氨基腺苷

1.菌体制备

1.1菌体活化及产酶培养

活化培养基：酵母膏5g/l、氯化钠10g/l、蛋白胨10g/l、ph7.0

培养条件：38℃、200rpm、12h

产酶培养基：酵母膏75g/l、氯化钠15g/l、玉米浆60ml/l、氯化钙0.8g/l、七水硫酸镁0.6g/l、一水硫酸锰0.8g/l、氯化锌0.1g/l、ph7.0

培养条件：38℃、do≥50％、14h

1.2菌体收集

产酶培养液离心处理(5000rpm离心10min)，然后，湿菌体用ph7.0、20mmol/l的磷酸二氢钾缓冲液洗涤一次，离心所得湿菌体-20℃冷冻保存备用。

2.固定化酶制备

2.1提酶

利用超声波细胞破碎法处理菌悬液，离心上清即酶液。

超声处理条件：菌悬液配方：tris-hcl50mn、edta5mn、ph8.0、菌体浓度60％

破碎条件：1600w、35℃、30min

离心条件：7000rpm、30min

2.2活化树脂

(1)水洗

称量适量的新树脂用纯化水洗至无混浊(5-8次)，然后抽滤后用适量pbs缓冲液浸泡5-10h。

(2)戊二醛交联

抽滤除掉pbs缓冲液，然后加入10倍体积的0.5％戊二醛溶液，25℃水浴搅拌12-15h。

(3)水洗

交联后的树脂抽滤出去戊二醛溶液，然后用纯化水洗干净后待用。

2.3酶联

活化树脂与酶量按照1:1.5比例混匀，20℃水浴搅拌12-15h，然后水洗至中性待遇。

3.酶促反应

反应体系配制

胸苷:12.2kg；2，6-二氨基嘌呤13.6kg；固定化酶量:14kg；纯化水100l；ph：7.0。

反应条件

待反应体系配制完成以后200rpm搅拌，55℃水浴反应72h，抽滤后进行下一步提取工序。

4.产物提取

4.1浓缩

酶促反应结束后，抽滤得2'-脱氧-2-氨基腺苷合成液，检测2'-脱氧-2-氨基腺苷含量为10.81kg，旋蒸浓缩干燥得18.83kg粗品。

4.2热溶

按照粗品中2'-脱氧-2-氨基腺苷含量用适量碱乙醇热溶，抽滤后得粗品溶液。

4.3干燥

将粗品溶液旋蒸干燥后，称重得11.62kg2'-脱氧-2-氨基腺苷粗品。

4.4精制

根据粗品中杂质含量，将2'-脱氧-2-氨基腺苷粗品溶于适量的碱水溶液中，然后，抽滤得沉淀，干燥后称重得2'-脱氧-2-氨基腺苷成品9.72kg。

4.5质检

精制后产品经检查合格，hplc：99.97％，hnmr和cnmr与标准样品核磁一致。