本发明涉及分子标记技术领域，尤其是涉及一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物及扩增方法。
技术背景
线粒体是细胞内的能量转换器，拥有独立于核基因组序列的线粒体基因组。不同于核基因组，线粒体基因组具有多个特征：(1)分子较小，且存在长度多态性，不同于基因组序列，线粒体基因组的序列由于串联重复序列的存在而大小不；(2)编码效率高，由于没内含子的存在，线粒体基因组序列短，但包含大量基因；(3)拷贝数多，每个细胞中含有不少于1000个线粒体基因组；(4)遗传和复制相对独立性，几乎不受细胞核的控制；(5)高突变率，由于线粒体数量的大量变化，线粒体dna几乎在整个细胞的生存过程中都在复制，这导致了线粒体dna上出现了大量的变异碱基，且这些突变不会危及到细胞的生存，突变碱基会保留下来；(6)同质性与异质性，每个个体细胞中的线粒体基因组dna序列存在原始序列和突变序列，并且存在一定分配比例；(7)母系遗传，有性繁殖的个体中仅卵细胞存在大量线粒体，精子几乎不含有线粒体，因此一个个体的线粒体基因全部来自母本。这些特征为科技工作者研究生物的生存、进化、物种迁徙等提供了有利条件。
头足类种类繁多，主要可以分为柔鱼类、枪乌贼类、乌贼类和蛸类，其中枪乌贼类(枪乌贼科)已取代乌贼类成为主要的优势种，是当前重要的渔业捕捞对象，相对于其它经济鱼类过度利用的渔业状况，其资源仍具有一定的利用潜力。不仅具有很高的经济价值，而且在海洋生态系统中起着重要作用，特别是小型枪乌贼类是能量在海洋生物中进行传递和转换的重要通道。枪乌贼线粒体基因组为环状双链dna，在细胞中存在成千上万的拷贝，尤其在生长状态较好的细胞中大量存在，线粒体dna的数量在一定程度上反映了细胞的生活状态。研究表明枪乌贼线粒体的dna非常保守，物种间的差异较小。枪乌贼线粒体基因组非常小，约为15-20kb之间，仅占整个个体全部基因信息(核基因组和线粒体基因组)的1％。枪乌贼线粒体基因组主要包括37个编码基因(13个蛋白基因，2个核糖体rna(rrna)基因，22个转运rna(trna)编码基因，2个转录和复制起始区域。基因编码的蛋白包括了与线粒体内膜相结合的酶复合体的亚单位：细胞色素、atp合成酶的亚基、细胞色素氧化酶的亚基以及氢化辅酶i脱氢酶的亚基。由于线粒体dna缺少蛋白保护，加上高复制效率，缺乏校对机制等，导致线粒体dna的序列变异效率高，而个体的异质性(突变dna和原始dna的比例)和线粒体序列的多态性(长度多态性，单个碱基位点多态性)可作为一个物种的分子标记，借此进行类群识别、物种起源进化、物种迁徙等研究。目前为止，进行线粒体基因组多态性研究的方法包括：(1)直接测序；(2)内切酶图谱；(3)扩增长度多态性；(4)探针杂交法等。随着测序技术的发展及测序费用的降低，直接测序方法已经越来越方便快捷，目前，枪乌贼线粒体基因组主要通过设计通用引物，进而获得枪乌贼线粒体dna的全序列。因此引物设计的好坏直接决定了实验的成败，因此开发一个简便、通用的枪乌贼线粒体基因组测序的方法具有重要的实用价值。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种覆盖完整线粒体基因组全序列，能对枪乌贼科物种进行整体拼接，能够与模板碱基序列结合紧密，扩增效率高，能够保证扩增结果的可信度的用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物。
本发明的目的之一在于提供一种扩增效率高、扩增片段长、保真性高，能够获得枪乌贼科物种线粒体全基因组序列的枪乌贼科物种线粒体全基因组的扩增方法。
本发明针对
背景技术：
中提到的问题，采取的技术方案为：
一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物，通用引物包括6对引物，具体包括1对扩增长片段引物和5对扩增普通片段引物。本发明通用引物覆盖完整线粒体基因组全序列，能对枪乌贼科物种进行整体拼接，同时引物f/r能有效避免形成稳定的发夹结构或二聚体，能够与模板碱基序列必须结合紧密，引物f/r的退火温度差值不超过5℃，扩增效率高，能够保证扩增结果的可信度。
作为优选，扩增长片段引物为：
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lar：5’-ggtccacagatcataacgaatatgg-3’。
作为优选，扩增普通片段引物为：
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作为优选，枪乌贼科物种包括中国枪乌贼、日本枪乌贼、剑尖枪乌贼、福氏枪乌贼、皮氏枪乌贼、莱氏拟乌贼、杜氏枪乌贼、尤氏枪乌贼、神户枪乌贼、乳光枪乌贼、火枪乌贼。
一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物的设计，从genbank数据库中下载目前所有已经公布的枪乌贼科物种线粒体全基因组序列，对这些序列进行多重比对，找出比较保守的区域以及变异较大的区域，并在两段保守区域设计通用引物。
本发明还公开一种基于上述通用引物的枪乌贼科物种线粒体全基因组的扩增方法，以提取的枪乌贼科物种基因组dna为模板，首先用扩增长片段引物进行la-pcr扩增，用扩增普通片段引物进行普通pcr扩增，pcr产物经1.0％琼脂糖电泳检测后送生物公司测序，然后对测序的结果进行序列拼接、校对，即得线粒体基因组全序列。由于常规pcr具有扩增效率低下、扩增片段较短(一般在3kb以下)、保真性不够高等缺点，进一步制约了它的发展，而la-pcr技术的扩增片段一般在5kb以上，条件适宜的情况下甚至可以达到20-30kb，且保真性也远高于普通pcr，能够获得枪乌贼科物种线粒体全基因组序列，可从组成和结构的角度对枪乌贼科物种线粒体全基因组进行分析，可以丰富枪乌贼科物种线粒体全基因组信息，为枪乌贼科物种的系统发育、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定重要的分子遗传学理论基础。
作为优选，la-pcr扩增采用50ul体系，包括1ul20umf引物、1ul20umr引物、8ul2.5mmdntp、5ul10×buffer、0.5ul5u/ulla-taq酶、2.5ngdna模板、灭菌蒸馏水加至50ul。
作为优选，la-pcr扩增的反应条件为：93℃预变性5min；92℃变性30s，53℃退火30s，70℃延伸600s，扩增20个循环；然后继续在93℃变性30s，53℃退火30s，70℃延伸610s，扩增20个循环；70℃总延伸10min。
作为优选，普通pcr扩增采用50ul体系，包括1ul20umf引物、1ul20umr引物、4ul2.5mmdntp、5ul10×buffer、3ul25mmmgcl2、0.25ul5u/ultaq酶、2.5ngdna模板、灭菌蒸馏水加至50ul。
作为优选，普通pcr扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，扩增30个循环；72℃总延伸7min。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通用引物覆盖完整线粒体基因组全序列，能对枪乌贼科物种进行整体拼接，同时引物f/r能有效避免形成稳定的发夹结构或二聚体，能够与模板碱基序列必须结合紧密，引物f/r的退火温度差值不超过5℃，扩增效率高，能够保证扩增结果的可信度；本发明扩增方法扩增效率高、扩增片段长、保真性高，能够获得枪乌贼科物种线粒体全基因组序列，可从组成和结构的角度对枪乌贼科物种线粒体全基因组进行分析，可以丰富枪乌贼科物种线粒体全基因组信息，为枪乌贼科物种的系统发育、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定重要的分子遗传学理论基础。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物，通用引物包括6对引物，具体包括1对扩增长片段引物和5对扩增普通片段引物。通用引物覆盖完整线粒体基因组全序列，能对枪乌贼科物种进行整体拼接，同时引物f/r能有效避免形成稳定的发夹结构或二聚体，能够与模板碱基序列必须结合紧密，引物f/r的退火温度差值不超过5℃，扩增效率高，能够保证扩增结果的可信度。
扩增长片段引物为：
laf：5’-taatcctcagtgagaccaatgaatct-3’，
lar：5’-ggtccacagatcataacgaatatgg-3’。
扩增普通片段引物为：
f1：5’-tagagcatagtagggtatctaatcctagt-3’，
r1：5’-tgtacaacatcactgtaacccgttca-3’；
f2：5’-ggtcaacagatcatacagttattgg-3’，
r2：5’-catacttcagggtgaccatagactct-3’；
f3：5’-ctccagatatagctatcacg-3’，
r3：5’-tgcgtctcctccacctcat-3’；
f4：5’-ttacttctattctgagtcct-3’，
r4：5’-tcgatatacaattgcgtctacg-3’；
f5：5’-ggtcgacacatcatagagatattgg-3’，
r5：5’-taacttcagcgtgaccaaggcatcc-3’。
上述枪乌贼科物种包括中国枪乌贼、日本枪乌贼、剑尖枪乌贼、福氏枪乌贼、皮氏枪乌贼、莱氏拟乌贼、杜氏枪乌贼、尤氏枪乌贼、神户枪乌贼、乳光枪乌贼、火枪乌贼。
一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物的设计，从genbank数据库中下载目前所有已经公布的枪乌贼科物种线粒体全基因组序列，对这些序列进行多重比对，找出比较保守的区域以及变异较大的区域，并在两段保守区域设计通用引物。设计引物时须注意两对相邻引物扩增片段重叠区域在200bp以上，方便后续实验对其进行整体拼接。
一种基于上述通用引物的枪乌贼科物种线粒体全基因组的扩增方法，具体包括如下步骤：
1)枪乌贼科物种线粒体全基因组dna的提取
a.取冰冻肌肉组织300mg，用小剪刀剪至肌肉组织呈粉末状，并转入2ml的eppendorf管中，放入电热鼓风干燥箱，50℃干燥10min使组织中酒精完全挥发；
b.将ep管取出，加入550ul组织裂解液(edta:sds＝10:1比例预先配好)，然后分别加入30ul蛋白酶k和5ulrna酶，震荡3min后，转入恒温水浴锅中，55℃裂解5h，期间每隔30min颠倒混匀一次；
c.取出ep管，转至超净工作台，冷却至室温，加入500ul平衡酚(4℃预冷)，缓慢颠倒10min，使组织液与平衡酚充分混匀；
d.将ep管转入离心机中，12000rpm常温离心10min，转上层水相于新的ep管中；
e.向ep管中加入4℃预冷的酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液500ul，缓慢颠倒混匀10min后，12000rpm常温离心10min，并转上层水相于新ep管中；
f.向ep管中加入氯仿:异戊醇＝24:1的混合液500ul，缓慢颠倒混匀10min后，12000rpm常温离心10min；
g.转上层水相于新的ep管中，加入50ul的naac(浓度＝3mol/l，ph＝5.2)，同时加入1000ul于超低温冰箱预冷(-20℃)的无水乙醇，彻底颠倒混匀10min，然后放置在超低温冰箱(-20℃)沉淀1-2h；
h.此时已经可以观察到dna絮状沉淀，于10000rpm离心15min，弃去上清液；
i.向ep管中加入1000ul浓度为70％的冷乙醇(4℃)，并于10000rpm离心20min，使dna沉淀在ep管底部，倒掉上清液，于室温敞口放置直至可见的乙醇挥发殆尽；
j.向ep管中加入100ulte缓冲液，放入超低温冰箱(-20℃)保存，静置一天以上方可使用，使dna完全溶解。
2)la-pcr扩增
用扩增长片段引物进行la-pcr扩增，la-pcr扩增采用50ul体系，包括1ul20umf引物、1ul20umr引物、8ul2.5mmdntp、5ul10×buffer、0.5ul5u/ulla-taq酶、2.5ngdna模板、灭菌蒸馏水加至50ul；la-pcr扩增的反应条件为：93℃预变性5min；92℃变性30s，53℃退火30s，70℃延伸600s，扩增20个循环；然后继续在93℃变性30s，53℃退火30s，70℃延伸610s，扩增20个循环；70℃总延伸10min。
3)普通pcr扩增
用扩增普通片段引物进行普通pcr扩增，普通pcr扩增采用50ul体系，包括1ul20umf引物、1ul20umr引物、4ul2.5mmdntp、5ul10×buffer、3ul25mmmgcl2、0.25ul5u/ultaq酶、2.5ngdna模板、灭菌蒸馏水加至50ul；普通pcr扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，扩增30个循环；72℃总延伸7min。
4)pcr产物的纯化
经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，符合预期片段长度的目的条带，进行产物纯化，即切胶回收，切胶回收实验方法按照康为世纪公司生产的快速琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(gelextractionkit)进行纯化实验，具体操作步骤如下：
a)将单一目的产物条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)，放入干净的离心管中，称取重量；
b)向胶块中加入3倍体积bufferpg；
c)3.50℃孵育10min，其间不断温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解；
d)加入1倍胶体积的异丙醇，上下颠倒混匀；
e)柱平衡：向已装入收集管(collectiontube)中的吸附柱(spincolumndm)中加入200ulbufferps，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
f)将步骤c或者步骤d中所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
g)向吸附柱中加入500ulbufferpg，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
h)向吸附柱中加入650ulbufferpw，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
i)12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干；
j)将吸附柱放到一个新的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30ul-50ulbuffereb(ph8.5)，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集产物溶液，-20℃保存溶液。
5)将经1.0％琼脂糖电泳检测后的pcr产物送生物公司测序。
6)序列拼接、校对
十个片段碱基序列核对无误后，利用dnastar7.1软件对其进行分段拼接，因为设计引物时每相邻两段序列，都保留有200-500bp的重复区域，故这十个测序片段均可以拼接起来，拼接完整线粒体全序列后，组装成一条首尾相接的序列，并仔细检查，对照测序峰图人工校正序列中相冲突的位点，校正完后再利用seqman把首尾的重复序列去除其中一个，最终得到完整的线粒体基因组全序列。由于常规pcr具有扩增效率低下、扩增片段较短(一般在3kb以下)、保真性不够高等缺点，进一步制约了它的发展，而la-pcr技术的扩增片段一般在5kb以上，条件适宜的情况下甚至可以达到20-30kb，且保真性也远高于普通pcr，能够获得枪乌贼科物种线粒体全基因组序列，可从组成和结构的角度对枪乌贼科物种线粒体全基因组进行分析，可以丰富枪乌贼科物种线粒体全基因组信息，为枪乌贼科物种的系统发育、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定重要的分子遗传学理论基础。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>浙江海洋大学
<120>种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物及扩增方法
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