一种利用dI引物进行基因定点饱和突变的方法与流程

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用di引物进行基因定点饱和突变的方法。

背景技术：

基因工程与基因改造对于获得特定性能的蛋白质和功能基因至关重要。传统的基因突变技术有随机突变、定点突变等。这些技术很难保证在特定位点进行4种碱基的饱和突变。随机突变的突变种类与位点随机性太大，基本上完全不可控，后期需要大量筛选获得目的突变体。定点突变虽然能够在特定位点引入特定碱基突变，但一次只能引入一种突变碱基，若进行饱和突变需要合成多条突变引物，导致工作量和成本大大增加。

技术实现要素：

本发明主要解决的技术问题是提供一种利用di引物进行基因定点饱和突变的方法，大大提高了单次引入基因突变的数量，同时突变位点精确可控，可用于大规模基因定点突变。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种利用di引物进行基因定点饱和突变的方法，包括步骤为：（1）用突变位点碱基为di碱基的引物扩增含目标基因的质粒载体，得到扩增产物；（2）对步骤（1）得到的扩增产物用限制性核酸内切酶dpni消化，再进行热裂解，切断硫代修饰处的dna链，得到裂解产物；（3）将步骤（2）得到的裂解产物静置，使所述裂解产物两端的3’突出端的单链dna彼此杂交配对，得到含饱和突变的目标基因的带缺口环状重组质粒载体；（4）步骤（3）得到的含饱和突变的目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组质粒载体。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述突变位点碱基为di碱基的引物的序列特征为：（a）扩增目标基因的正向引物和扩增目标基因的反向引物的5’端前10-20个碱基彼此互补配对；（b）所述引物的突变位点碱基为脱氧肌苷di碱基；（c）扩增目标基因的正向引物和扩增目标基因的反向引物的5’端互补配对区含有分散存在的硫代修饰。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述扩增中采用的是聚合酶链式反应pcr，扩增反应缓冲液中包括有扩增目标基因的正向引物、扩增目标基因的反向引物、目标核酸模板分子、dna聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述热裂解是采用碘酒进行热裂解，所述热裂解是在60-80度下进行热裂解1-30分钟。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述静置是先使所述裂解产物降温至室温，再放置1～15分钟。

在本发明一个较佳实施例中，所述利用di引物进行基因定点饱和突变的方法还包括对含目标基因的完整重组质粒载体的鉴定，所述鉴定是挑取单菌落，培养后抽提含目标基因的完整重组质粒载体，测序鉴定突变种类。

本发明的有益效果是：

（1）所述利用di引物进行基因定点饱和突变的方法不需要合成多条引物，利用di与4种正常碱基配对原则，只要一条引物就能够实现基因特定位点的饱和突变；

（2）所述利用di引物进行基因定点饱和突变的方法能够做连续多个位点的饱和突变，减少了引物数量与突变操作次数，加快了突变过程，大大节约了时间成本；

（3）所述利用di引物进行基因定点饱和突变的方法能在特定位点选择性断裂dna链，形成长度可控的单链尾巴，将饱和突变与载体自环耦联在一起，消除了基因突变后的克隆操作，极大的提高了突变效率；

（4）所述利用di引物进行基因定点饱和突变的方法能够克服现有技术中随机突变与定点基因突变的缺陷，能够应用于基因突变体构建、蛋白体外进化方面。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明的利用di引物进行基因定点饱和突变的方法一较佳实施例的流程图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：枯草芽孢杆菌单链dna结合蛋白ssb的s69与d74残基的随机饱和突变体构建

请参阅图1，提供一种利用di引物进行基因定点饱和突变的方法，包括步骤为：

（1）设计合成用于扩增目标基因和质粒载体的引物，所述引物的序列特征为：（a）扩增目标基因的正向引物和扩增目标基因的反向引物的5’端前12个碱基彼此互补配对；（b）所述引物的突变位点碱基为3个连续的脱氧肌苷di碱基；（c）扩增目标基因的正向引物和反向引物的5’端的第6,12位磷酸二酯键为硫代修饰。

扩增ssb的s69与d74残基随机饱和点突变的引物序列如下：

d74-f：5’cttgca-ggcgta-dididiggccgtttacaaacaagaaa

s69-r:5’tacgcc-tgcaag-dididitccttttttcaagaagtttg

其中大写字母为dna碱基，di为脱氧肌苷碱基，-为硫代修饰。

（2）采用聚合酶链式反应pcr扩增含目标基因的线性化质粒dna片段。将扩增目标基因的正向引物、扩增目标基因的反向引物、目标核酸模板分子（含枯草杆菌ssb野生型目标基因的质粒载体dna）、高忠实度耐高温dna聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸（dntps）加入pcr反应缓冲液，进行反应。pcr反应体系（50微升）组成如下：正向引物(0.2μm)、反向引物(0.2μm)、野生型质粒模板分子（5纳克）、dna聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸(0.2mm)，所述dna聚合酶为koddna聚合酶（1个单位）。pcr条件为98度3分钟；（95度0.5分钟，52度0.5分钟，72度3分钟）×30循环；72度×6分钟；16度3分钟。其中所述高忠实度耐高温dna聚合酶可以为koddna聚合酶。

（3）线性化质粒载体dna片段的限制性内切酶dpni消化。对扩增的线性化质粒载体pcr产物，用限制性核酸内切酶dpni消化野生型环状质粒模板。直接在20微升pcr产物中加入dpni为10个单位，37度反应时间为5分钟至2小时。所述限制性核酸内切酶dpni能特异性识别切割模板质粒双链dna中a甲基化的g^matc序列，dpni的处理使得质粒模板变成很多段短的dna双链，这些短的dna双链转化大肠杆菌不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性突变体。

（4）pcr片段的环化。在20微升pcr产物中加入2微升碘酒，在70度进行热裂解10分钟，在硫代修饰处切断dna链，断裂的短片段dna链与互补链分离，从而在双链dna片段的两端产生长度为12个核苷酸的3’突出端。

（5）目标基因与线性化质粒载体dna片断间的杂交配对。碘酒裂解产物缓慢降温至室温，放置5分钟，使两端的3’突出端的的单链dna彼此杂交配对，形成含饱和突变的目标基因的带缺口环状重组质粒载体。

（6）含饱和突变的目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌。含饱和突变的目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。含有目标基因的重组质粒载体的缺口会被大肠杆菌修复，形成含目标基因的完整重组质粒载体。

（7）饱和突变质粒载体的测序的鉴定。挑取单菌落，培养后抽提含目标基因的完整重组质粒载体，测序鉴定突变种类。

本发明利用突变位点碱基为di碱基的引物对，以携带目标基因的环状质粒或基因组dna作为模板，pcr扩增目标基因，pcr产物经碘酒裂解，会产生3’单链dna尾巴（长度可以在引物设计中确定，即距离引物5’末端最远的硫代修饰所处的位置距离，一般长10-15个核苷酸）。由于产生的3’单链dna尾巴的碱基序列互补配对，二者形成稳定的完全配对双链，环化成带缺口的环状质粒，质粒上的目标基因的特定位点含有4种碱基的饱和突变，转化大肠杆菌后，质粒载体上的dna缺口被大肠杆菌dna修复系统修复，形成完整的含有饱和突变的目标基因的重组dna分子。引物序列上可以含有一处或几处随机饱和突变的di核苷酸。

本发明利用脱氧肌苷di修饰引物扩增目标基因，基于di碱基与四种正常碱基，将突变位置的碱基全覆盖成4种正常碱基，从而达到利用单一引物实现定点饱和突变的目的。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。