一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法与流程

本发明属于未变性天然胶原的制备方法领域，具体涉及一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法。

背景技术：

制革原材料——生皮的主要成分胶原是一种非常热门的天然高分子材料。胶原分子由三条左旋的α-链组成，它们以同一轴为中心、右手螺旋方式相互缠绕形成胶原分子特有的右手三股螺旋结构，而这种特殊的三股螺旋结构赋予了胶原优异的生物学功能：低抗原性、良好的生物相容性、凝血作用、促进细胞的增殖生长。基于这些性质，胶原才能够广泛应用于组织工程、药物控释、美容护肤等领域。因此实际应用中都需以保证胶原三股螺旋结构的完整性为前提，若其结构被破坏，会完全丧失其生物活性，随之失去所具有的独特生物学性能。例如，明胶或胶原蛋白水解物，虽然其氨基酸组成与胶原无明显区别，也具有无毒无污染、可生物降解性的优点，但是由于其多肽链呈无规卷曲结构而非三股螺旋构象，物化性质与胶原不尽相同且不具有生物活性。因此，在实际应用中，制备具有三股螺旋结构的未变性胶原是发挥其生物学价值的前提。胶原主要存在于皮肤、软骨、跟腱等结缔组织中。目前，提取胶原所用的原材料主要是猪皮(m.t.sheuetal.characterizationofcollagengelsolutionsandcollagenmatricesforcellculture.biomaterials.22(2001),1713-1719)、牛皮(preethil.chandranetal.structuralmechanismforalterationofcollagengelmechanicsbyglutaraldehydecrosslinking.connectivetissueresearch.53(2012),285-297)、牛跟腱(f.wolfgangetal.effectofprocessingconditionsontherheologicalbehaviorofcollagendispersions.europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics.51(2001),259-265)和鼠尾(r.ushaetal.structureandconformationofintramolecularlycross-linkedcollagen.colloidsandsurfacesb:biointerfaces.41(2005),21-24)。在这四种原料中，牛皮和猪皮产量是最大的，提取量最多；此外，从哺乳动物皮提取的胶原具有较好的耐酶、耐热稳定性和机械性能，因此哺乳动物皮仍是目前胶原制备的主要原材料。

针对皮胶原的提取采用的原材料有鲜皮以及制革过程的中间物灰碱皮。其中，鲜皮需经刮毛、去肉、脱毛、脱脂、脱色等预处理去除非胶原成分，操作工序复杂、提取时间较长(付强,李国英,许燕.天然胶原高提取率的皮预处理方法的研究[j].中国皮革2006,(1):28-31,35.)；灰碱皮提取胶原需要先进行脱灰脱钙处理，对钙残留量要求较高，且灰碱皮本身无法长期储存(四川大学.一种从制革废皮边角料中提取未变性天然胶原的方法:cn200710300903.1.2008-05-28李东,李国英,姜德云等.从制革废灰碱牛皮中提取天然胶原(i)-预处理和提取工艺.中国皮革,2008,(9):8-11.)；而对于制革过程的另一中间物——浸酸皮，只需中和后便可提取胶原，提取工艺简单、需时较短且浸酸皮便于保存。相比之下，从浸酸皮中提取胶原是一种相对便捷的方案。国内外尚缺乏关于从浸酸皮中提取胶原的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法。该方法选用制革过程的中间物-浸酸皮为原料，通过预处理、提取和纯化后制得未变性天然胶原。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法，包括以下步骤：

s1、原料预处理

将浸酸皮加入至氯化钠溶液中，搅拌的过程中加入弱碱以调整ph值至5.5～6.5，取出并清洗皮块，剪碎后备用，得到预处理后的皮块；

s2、未变性天然胶原的提取

将s1预处理后的皮块加入至含有蛋白酶的醋酸溶液中，搅拌后获得混合液；

s3、未变性天然胶原的纯化

(1)离心处理s2制得的混合液，得到上清液后加入盐进行盐析，制得悬浊液，离心分离悬浊液后得到沉淀物；将沉淀物溶解于醋酸溶液中制得胶原粗溶液；

(2)在胶原粗溶液中加入盐进行盐析，制得悬浊液，离心分离悬浊液后得到沉淀物，将沉淀物溶解于醋酸溶液中，制得胶原溶液；

(3)将步骤(2)重复0～2次；

(4)离心分离最后一次的胶原溶液，得到沉淀物，将沉淀物溶解于醋酸溶液中进行透析，透析后得到纯化后的未变性天然胶原溶液；

(5)冷冻干燥未变性天然胶原溶液后制得未变性天然胶原海绵。

本发明的进一步改进在于：

优选的，s1中，氯化钠溶液的质量浓度为6～10％；浸酸皮与氯化钠溶液的料液比为1g：(2～10)l；搅拌温度＜25℃。

优选的，s1中，弱碱选用碳酸氢钠、碳酸钠或醋酸钠中的至少一种。

优选的，s2中，含有蛋白酶的醋酸溶液的制备过程为，将预处理后皮块皮重的1～10％的蛋白酶加入至0.1～2mol/l醋酸溶液中；搅拌时间为48～72h，搅拌温度＜10℃。

优选的，s2中，蛋白酶为胃蛋白酶、酸性蛋白酶或真菌复合酶中的任一种或两种复配制得。

优选的，s3的步骤(1)中，加入盐使其在上清液中的浓度为0.7～3mol/l；沉淀物溶解于浓度为0.1～1mol/l的醋酸溶液中。

优选的，s3的步骤(2)中，加入盐使其在溶液中的浓度0.7～3mol/l；沉淀物溶解于浓度为0.1～1mol/l的醋酸溶液中。

优选的，s3的步骤(4)中，沉淀物溶解在浓度为0.01～1mol/l的醋酸溶液中进行透析，透析液为0.01～1mol/l的醋酸溶液，透析时间为3～5天；透析过程中，每7～9小时更换一次透析液。

优选的，其特征在于，s3中，盐为氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或硫酸镁中的任一种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法，该方法选用制革过程的中间物——浸酸皮为原料并进行简单的中和预处理，提取阶段以醋酸-蛋白酶浸提得到酶溶胶原，纯化阶段利用高速离心和多次盐析除杂，最后透析除盐、冻干得到海绵状胶原，干重提取率＞25％，提取出的产品纯度高，品质优良。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图显示胶原含有一条β链和两条α链，保留有完整的三股螺旋结构，分子量分别约为20万和10万，无其他杂蛋白条带，表明所得到的胶原保留了典型的三股螺旋结构并具有较好的纯度。此外，采用红外图谱分析样品结构的结果显示样品具有典型的胶原特征吸收峰：酰胺i、ii、iii带。提取过程中除特殊说明外操作温度均在10℃以下，得到的产品溶液透明澄清、冻干海绵色白，易于保存且储存时间长，整个处理方法简单，提取周期较短。

进一步的，通过酸酶结合法提取胶原中的蛋白酶能够为胃蛋白酶、酸性蛋白酶或真菌复合酶中的任一种或两种复配制得。这三类酶可作用于胶原分子的非螺旋区域，切断端肽保留胶原分子的三股螺旋区域，一方面使得胶原分子从胶原纤维中脱离出来，另一方面去除端肽可降低胶原分子的抗原性，利于其在生物医药中的应用；而这三类酶虽然均作用于非螺旋区域但作用位点不同，在提取过程中，两种酶的复配使用可以提高提取效率。

【附图说明】

图1为本发明实施例2制得的未变性天然皮胶原的sds-page电泳图谱；

其中a为浸酸皮胶原，b为鲜皮胶原，c为蛋白质标样；

图2为本发明实施例2制得的未变性天然皮胶原的ftir图谱。

【具体实施方式】

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细描述：

本发明公开了一种从浸酸皮中提取未变性天然胶原的方法，该方法具体包括以下步骤：

s1、原料预处理

将浸酸皮加入至质量浓度为6～10％的氯化钠溶液中，浸酸皮与氯化钠溶液的料液比为1g：(2～10)l，浸酸皮选用牛皮或猪皮等哺乳类动物的皮；搅拌上述溶液，搅拌的过程中分多次加入弱碱调整至ph至5.5～6.5，加入的弱碱选用碳酸氢钠、碳酸钠或醋酸钠中的至少一种；整个处理过程中，需保证溶液的温度＜25℃；调整ph值后通过去离子水水洗去除皮中残留的酸、碱、盐，得到预处理后的皮块，剪碎备用。

s2、未变性天然胶原的提取

将蛋白酶加入至0.1～2mol/l醋酸溶液中，蛋白酶的质量为预处理皮量的1～10％；将预处理后的皮块加入至含有蛋白酶的醋酸溶液中，搅拌48～72h后，皮块部分溶解于醋酸溶液中，获得混合液；整个提取过程的醋酸溶液温度＜10℃；蛋白酶为胃蛋白酶、酸性蛋白酶或真菌复合酶中的任一种或两种复配制得。

s3、未变性天然胶原的纯化

(1)离心分离混合液，离心速度为6000～10000rpm，除去不溶物后获取上清液；

(2)在上清液中加入盐，至盐在上清液中的浓度为0.7～3mol/l进行盐析，制得悬浊液，以转速6000～10000rpm离心分离悬浊液，得到沉淀物；

(3)将沉淀物溶解于0.1～1mol/l的醋酸溶液中，制得胶原粗溶液；

(4)在溶液[此处的溶液，当第一次进行该步骤时，为步骤(3)制得的胶原粗溶液，当第二次进行该步骤时，为步骤(5)制得的溶液]中加入盐，至盐在溶液的浓度为0.7～3mol/l进行盐析，制得悬浊液，以转速8000～12000rpm离心分离悬浊液，得到沉淀物；

(5)将沉淀物溶解于0.1～1mol/l的醋酸溶液中，制得溶液；

(6)依次重复步骤(4)和步骤(5)0～2次，将最后一次得到的溶液通过转速8000～12000rpm离心分离混合溶液，得到沉淀物，将沉淀物溶解在0.01～1mol/l的醋酸溶液中进行透析，透析处理3～5天，每7～9小时更换透析液依次，透析液即为浓度为0.01～1mol/l的醋酸溶液，得到纯化后的未变性天然胶原溶液；

(7)采用冷冻干燥机冻干后得到未变性天然胶原海绵。

上述步骤中的盐为氯化钠、硫酸钠、硫酸铵或硫酸镁中的任一种。

整个纯化过程中任意步骤的温度均＜10℃，任意步骤包括离心、盐析、溶解和透析。

实施例1：

s1、原料预处理

将浸酸皮加入浓度为6％的氯化钠溶液中，浸酸皮与氯化钠溶液的料液比为1g：5l，浸酸皮选用牛皮；搅拌上述溶液的过程中分三次加入碳酸氢钠，调整溶液的ph值至5.6；整个处理过程中，溶液水浴处理，以保证溶液的温度＜25℃；调整ph值至5.6后通过去离子水以大液比(1:20)洗去皮中残留的酸、碱、盐，得到预处理后的皮块，剪碎备用。

s2、未变性天然胶原的提取

取上述皮量的5％的酸性蛋白酶加入至质量浓度为0.5mol/l的醋酸溶液中，冰水浴中搅拌72h，获得混合溶液；

s3、未变性天然胶原的纯化

(1)以转速6000rpm离心分离混合液，除去滤渣并获取上清液；在上清液中加入氯化钠至氯化钠的浓度为3mol/l进行第一次盐析，以转速6000rpm离心分离混合溶液，得到沉淀物；

(2)将沉淀物溶解于1mol/l的醋酸溶液中，制得溶液；在溶液中再次加入氯化钠至氯化钠的浓度为0.7mol/l进行第二次盐析，以转速8000rpm离心分离沉淀；

(3)将沉淀溶于0.1mol/l醋酸溶液中，以该浓度的醋酸溶液作为透析液透析处理3天，每8小时更换一次透析液，冷冻干燥后得到海绵状胶原；该实施例的干重提取率为27.2％。

实施例2

s1、原料预处理

将浸酸皮加入浓度为8％的氯化钠溶液中，浸酸皮与氯化钠溶液的料液比为1g：10l，浸酸皮选用牛皮；搅拌上述溶液的过程中分两次加入碳酸钠，调整溶液的ph值至5.8；整个处理过程中，溶液水浴处理，以保证溶液的温度＜25℃；调整ph值至5.8后通过去离子水以大液比(1:20)洗去皮中残留的酸、碱、盐，得到预处理后的皮块，剪碎备用。

s2、未变性天然胶原的提取

取上述皮量的3％的胃蛋白酶加入至质量浓度为0.5mol/l的醋酸溶液中，冰水浴中搅拌64h，获得混合溶液；

s3、未变性天然胶原的纯化

(1)以转速10000rpm离心分离混合液，除去滤渣并获取上清液；在上清液中加入氯化钠至氯化钠的浓度为1.5mol/l进行第一次盐析，以转速8000rpm离心分离混合溶液，得到沉淀物；

(2)将沉淀物溶解于0.1mol/l的醋酸溶液中，制得溶液；在溶液中再次加入氯化钠至氯化钠的浓度为0.7mol/l进行第二次盐析，以转速12000rpm离心分离沉淀；

(3)将沉淀溶于0.01mol/l醋酸溶液中，以该浓度的醋酸溶液作为透析液透析处理4天，每8小时更换一次透析液，冷冻干燥后得到海绵状胶原；该实施例的干重提取率为30.2％。

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)测定所制得产物的分子量分布及纯度。如图1所示，电泳图谱中显示有一条β链和两条α链，分子量分别约为20万和10万，无其他杂蛋白条带，表明所得到的胶原保留了典型的三股螺旋结构并具有较高的纯度。此外，图2是浸酸皮胶原与鲜牛皮胶原的红外图谱。由图可知，浸酸皮胶原的主要吸收峰有3326cm^-1、3077cm^-1、1658cm^-1、1552cm^-1和1238cm^-1，分别为胶原的特征吸收峰：酰胺a带、酰胺b带、酰胺i带、酰胺ii带和酰胺iii带。

实施例3

s1、原料预处理

将浸酸皮加入浓度为10％的氯化钠溶液中，浸酸皮与氯化钠溶液的料液比为1g：2l，浸酸皮选用牛皮；搅拌上述溶液的过程中分三次加入三水醋酸钠，调整溶液的ph值至5.5；整个处理过程中，溶液水浴处理，以保证溶液的温度＜25℃；调整ph值至5.5后通过去离子水以大液比(1:20)洗去皮中残留的酸、碱、盐，得到预处理后的皮，剪碎备用。

s2、未变性天然胶原的提取

取上述皮量的8％的胃蛋白酶和酸性蛋白酶的混合物(胃蛋白酶和酸性蛋白酶的质量比为1:1)，加入至质量浓度为0.5mol/l的醋酸溶液中，冰水浴中搅拌72h，获得混合溶液；

s3、未变性天然胶原的纯化

(1)以转速8000rpm离心分离混合液，除去滤渣并获取上清液；在上清液中加入氯化钠至氯化钠的浓度为2mol/l进行第一次盐析，以转速8000rpm离心分离混合溶液，得到沉淀物；

(2)将沉淀物溶解于1mol/l的醋酸溶液中，制得溶液；在溶液中再次加入氯化钠至氯化钠的浓度为0.7mol/l进行第二次盐析，以转速8000rpm离心分离沉淀；

(3)将步骤(2)重复操作2次；将最后一次得到的沉淀溶于0.01mol/l醋酸溶液中，以该浓度的醋酸溶液作为透析液透析处理3天，每8小时更换一次透析液，冷冻干燥后得到海绵状胶原；该实施例的干重提取率为27.8％。

实施例4

s1、原料预处理

将浸酸皮加入浓度为7％的氯化钠溶液中，浸酸皮与氯化钠溶液的料液比为1g：6l，浸酸皮选用牛皮；搅拌上述溶液的过程中分三次加入碳酸钠，调整溶液的ph值至6.5；整个处理过程中，溶液水浴处理，以保证溶液的温度＜25℃；调整ph值至6.5后通过去离子水以大液比(1:20)洗去皮中残留的酸、碱、盐，得到预处理后的皮，剪碎备用。

s2、未变性天然胶原的提取

取上述皮量的10％的真菌复合酶，加入至质量浓度为0.1mol/l的醋酸溶液中，冰水浴中搅拌48h，获得混合溶液；

s3、未变性天然胶原的纯化

(1)以转速8000rpm离心分离混合液，除去滤渣并获取上清液；在上清液中加入硫酸钠至硫酸钠的浓度为3mol/l进行第一次盐析，以转速10000rpm离心分离混合溶液，得到沉淀物；

(2)将沉淀物溶解于0.5mol/l的醋酸溶液中，制得溶液；在溶液中再次加入硫酸钠至硫酸钠的浓度为0.7mol/l进行第二次盐析，以转速12000rpm离心分离沉淀；

(3)将步骤(2)重复1次后，将最后一次的沉淀溶于1mol/l醋酸溶液中，以该浓度的醋酸溶液作为透析液透析处理5天，每9小时更换一次透析液，冷冻干燥后得到海绵状胶原。

实施例5

s1、原料预处理

将浸酸皮加入浓度为9％的氯化钠溶液中，浸酸皮与氯化钠溶液的料液比为1g：8l，浸酸皮选用猪皮；搅拌上述溶液的过程中分两次加入碳酸钠，调整溶液的ph值至6；整个处理过程中，溶液水浴处理，以保证溶液的温度＜25℃；调整ph值至6后通过去离子水以大液比(1:20)洗去皮中残留的酸、碱、盐，得到预处理后的皮，剪碎备用。

s2、未变性天然胶原的提取

取上述皮量的10％的胃蛋白酶和酸性蛋白酶的混合物(胃蛋白酶和酸性蛋白酶的质量比为1:1)，加入至质量浓度为2mol/l的醋酸溶液中，冰水浴中搅拌60h，获得混合溶液；

s3、未变性天然胶原的纯化

(1)以转速9000rpm离心分离混合液，除去滤渣并获取上清液；在上清液中加入硫酸铵至硫酸铵的浓度为2mol/l进行第一次盐析，以转速8000rpm离心分离混合溶液，得到沉淀物；

(2)将沉淀物溶解于0.2mol/l的醋酸溶液中，制得溶液；在溶液中再次加入硫酸铵至硫酸铵的浓度为1mol/l进行第二次盐析，以转速10000rpm离心分离沉淀；

(3)将沉淀溶于0.05mol/l醋酸溶液中，以该浓度的醋酸溶液作为透析液透析处理3天，每7小时更换一次透析液，冷冻干燥后得到海绵状胶原。

实施例6

s1、原料预处理

将浸酸皮加入浓度为6％的氯化钠溶液中，浸酸皮与氯化钠溶液的料液比为1g：7l，浸酸皮选用牛皮；搅拌上述溶液的过程中分三次加入碳酸氢钠，调整溶液的ph至6.2；整个处理过程中，溶液水浴处理，以保证溶液的温度＜25℃；调整ph值至6.2后通过去离子水以大液比(1:20)洗去皮中残留的酸、碱、盐，得到预处理后的皮，剪碎备用。

s2、未变性天然胶原的提取

取上述皮量的8％的真菌复合酶和酸性蛋白酶的混合物(真菌复合酶和酸性蛋白酶的质量比为1:1)，加入至质量浓度为1.5mol/l的醋酸溶液中，冰水浴中搅拌50h，获得混合溶液；

s3、未变性天然胶原的纯化

(1)以转速7000rpm离心分离混合液，除去滤渣并获取上清液；在上清液中加入硫酸镁至硫酸镁的浓度为2.5mol/l进行第一次盐析，以转速9000rpm离心分离混合溶液，得到沉淀物；

(2)将沉淀物溶解于0.8mol/l的醋酸溶液中，制得溶液；在溶液中再次加入硫酸镁至硫酸镁的浓度为2mol/l进行第二次盐析，以转速8000rpm离心分离沉淀；

(3)将步骤(2)重复2次后，将最后一次的沉淀溶于0.08mol/l醋酸溶液中，以该浓度的醋酸溶液作为透析液透析处理4天，每9小时更换一次透析液，冷冻干燥后得到海绵状胶原。

实施例7

s1、原料预处理

将浸酸皮加入浓度为8％的氯化钠溶液中，浸酸皮与氯化钠溶液的料液比为1g：6l，浸酸皮选用牛皮；搅拌上述溶液的过程中分两次加入三水醋酸钠，调整溶液的ph值至6.4；整个处理过程中，溶液水浴处理，以保证溶液的温度＜25℃；调整ph值至6.4后通过去离子水以大液比(1:20)洗去皮中残留的酸、碱、盐，得到预处理后的皮，剪碎备用。

s2、未变性天然胶原的提取

取上述皮量的6％的胃蛋白酶和酸性蛋白酶的混合物(胃蛋白酶和酸性蛋白酶的质量比为1:1)，加入至浓度为1mol/l的醋酸溶液中，冰水浴中搅拌50h，获得混合溶液；

s3、未变性天然胶原的纯化

(1)以转速8000rpm离心分离混合液，除去滤渣并获取上清液；在上清液中加入硫酸钠至硫酸钠的浓度为2mol/l进行第一次盐析，以转速8000rpm离心分离混合溶液，得到沉淀物；

(2)将沉淀物溶解于0.6mol/l的醋酸溶液中，制得溶液；在溶液中再次加入硫酸钠至硫酸钠的浓度为1mol/l进行第二次盐析，以转速10000rpm离心分离沉淀；

(3)将步骤(2)重复操作2次，将最后一次得到的沉淀溶于0.02mol/l醋酸溶液中，以该浓度的醋酸溶液作为透析液透析处理3天，每8小时更换一次透析液，冷冻干燥后得到海绵状胶原。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。