本发明属于生物工程与食品技术领域，涉及到酶的分离与应用技术，特别涉及到利用脂肪酶水解鱼油中dha和epa的方法。
背景技术：
w-3型多不饱和脂肪酸(epa、dha)具有优良的降血酯、抗炎和降胆固醇等多种生理活性，因此近年来受到了广泛关注，成为广受追捧的抗心脑血管疾病的功能性保健品。据统计，其全球市场销售额已从2004年的1.5亿美元猛增至2016年的16亿美元。然而天然鱼油中，epa、dha的含量低，无法满足相关需求，需通过酶解、醇解、分子蒸馏等方法对天然鱼油中的epa、dha进行精炼富集，除去饱和脂肪酸等相对有害的成分。现阶段工业上常常采用碱催化酯交换的办法，将天然状态下的鱼油转化为多不饱和脂肪酸乙酯，并利用分子蒸馏等方法富集epa和dha。但此产品终产物为非天然的乙酯型多不饱和脂肪酸，研究以证明其生物利用度低(仅为epa、dha甘油三酯的30％)且存在体内代谢产生乙醇，对人体不利等问题。因此，研究高浓度甘油酯型多不饱和脂肪酸的相关生产方法意义重大。工业上采用生物酶法生产甘油酯型产品，其反应条件温和，底物不易氧化，副产物少，能耗低，环境友好等优点受到了领域内的青睐。然而，在生物酶法生产过程中，存在酶分离难，重复利用难的问题，因而导致生物酶法成本偏高等问题。如何将反应后的酶进行分离并重复利用，已经成为了相关研究领域的重点与难点。
最近几十年，科学家在脂肪酶的分离、重复多次利用进行了一系列的尝试，但是，成本控制和反应质量难于兼容是其大规模工业生产的主要瓶颈。例如，lyberg等研究了不同脂肪酶醇解和分子蒸馏结合富集鱼油中的多不饱和脂肪酸，将脂肪酶通过固态载体进行固定化，实现了酶的分离，并可以进行重复连续利用；但该方法存在固定化载体昂贵，能耗大，酶从载体上洗脱而失活等问题(eur.j.lipidsci.technol.2008,110,317–324)。郑毅等利用固定剂戊二醛与硅藻土，采用吸附与交联相结合的方法固定化米曲霉脂肪酶，在富集了dha、epa的前提下实现了酶的重复利用；但是该办法存在酶失活，反应时间长等问题(journalofchemicalindustryandengineering(china)vol.57no.2feb2006,353-358)。所以，脂肪酶的有效分离，重复利用过程中的酶活力保持以及固定化载体的成本控制已经成为了目前研究的重点。
技术实现要素：
本发明的目的是针对目前生物酶法富集epa、dha，存在的脂肪酶分离困难，脂肪酶易失活、难以重复利用以及固定化成本高等问题，提供了一种基于新型液态固定化，用来高效重复利用酶法富集鱼油中的epa、dha的方法。
本发明的技术方案：
一种基于固定化酶富集鱼油中dha和epa的方法，包括以下步骤：
(1)配置脂肪酶浓度为2-20000u/ml的酶液，向酶液中添加可溶性盐和亲水性溶剂，形成两相体系，分液得到液态固定化脂肪酶上相和富盐下相；所述可溶性盐、亲水性溶剂与酶液的质量比分别为0.05-1、0.03-1.2；
(2)将得到的液态固定化脂肪酶与可溶性盐溶液、鱼油配成三液相体系，于搅拌条件下进行酶催化反应，反应结束后，静置或离心至分成三层，上相为鱼油产物，中相为液态固定化脂肪酶，下相为富含甘油水解物的反应介质；所述可溶性盐溶液、鱼油与液态固定化酶的质量比分别为0.1-5和0.05-7；
(3)将上相鱼油产物萃取后取上相，经蒸馏得到富epa和dha的甘油酯产物。
优选地，步骤(1)所述亲水性溶剂为聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、乙二醇和丙酮中的一种或两种以上；或者所述亲水性溶剂为[bmim]br、[bmim]bf4、[emim]etso4和[omim]cl中的一种或两种以上。
优选地，步骤(2)所述可溶性盐溶液为步骤(1)的富盐下相。
优选地，步骤(2)可溶性盐溶液的质量浓度为25％～70％。
优选地，步骤(1)和(2)所述可溶性盐是氯化钠、硫酸铵、碳酸钠、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或两种以上。
优选地，步骤(1)所述脂肪酶为tl-100l(thermomyceslanuginosuslipase)、pl20000l(rhizomucormieheilipase)、ays(candidarugosalipase1)、ay30(candidarugosalipase2)的一种或两种以上，所述脂肪酶浓度为10-2000u/ml。
优选地，步骤(2)所述三液相体系的ph值为3-13，优选地，ph值为4-10。
优选地，步骤(2)所述搅拌的转速为100-1000转/分，反应温度为25-40℃，反应时间为0.5-3h。
优选地，步骤(1)所述可溶性盐、亲水性溶剂与酶液的质量比分别为0.1-0.3、0.1-0.5；步骤(2)所述可溶性盐溶液、鱼油与液态固定化酶的质量比分别为0.5-3、0.6-2。
优选地，步骤(3)所述萃取是向鱼油产物中加入碱液，然后加入疏水性有机溶剂，静置；
优选地，所述鱼油产物与碱液的质量体积比为0.2～2g/ml，所述疏水性有机溶剂的体积为碱液的0.3-5倍，碱液浓度为0.2-8mol/l；
优选地，所述碱液为氢氧化钠溶液，氢氧化钾溶液，碳酸钾溶液，氨水溶液中的一种或几种；
优选地，所述疏水性有机溶剂为正己烷、石油醚、乙酸乙酯、异辛烷的一种或几种。
本发明酶活测定方法选自橄榄油乳液电位滴定法，橄榄油乳液指示剂滴定法，对硝基苯酚辛酸酯比色法的一种或两种以上。
步骤(2)所述下相用酸调ph值至2以下，然后经0.5-10倍体积疏水性有机溶剂萃取，得到水解后副产物脂肪酸，可用于生产皂、饲料或生物柴油等。
上述脂肪酶催化反应中，脂肪酶可以来自天然，也可以通过人工发酵产生。可以是发酵液，可以是经简单纯化后的粗酶，也可是经纯化后纯酶。
本发明的效果和益处：
(1)本发明提供了一种基于液态固定化酶技术，用于鱼油高效可重复富集epa和dha的方法，克服了目前酶法富集鱼油中epa和dha过程中，存在的脂肪酶难以分离，重复利用困难，易于失活的问题。通过该技术一方面使固定化酶成本大幅降低，克服传统固定化酶高速搅拌下，载体易破碎，酶易脱落等难题，使脂肪酶的失活大幅减弱，另一方面，可大幅增高酶的催化效率，降低酶的应用成本。
(2)本发明利用液态固定化酶可与鱼油产物和反应介质自动分相的优良特性，做到了产物与催化剂的快速分离，并可实现脂肪酶的连续多次重复使用，同时还可以提高催化效率，从而大幅降低酶的损耗与纯化成本；同时得到副产物脂肪酸。
(3)本发明方法具有能耗小、原料利用率高、反应条件温和等优点，解决了现有固定化酶水解法富集鱼油中epa和dha难于工业化的技术难题。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。本实施例中所用脂肪酶ays购自amano公司，脂肪酶mas1为本实验室将mas1脂肪酶基因(基因库编号:ay260764,fromgeobacilluszalihae)在毕赤酵母宿主中表达，并以甲醇诱导发酵生产获得。
实施例1
取6.5g含脂肪酶ays和20mm的磷酸盐缓冲体系的粗酶液(75u/ml,ph为6)，加入1.9g的硫酸钠，混匀后加入1.6g聚乙二醇400，分液取上层得3g液态固定化脂肪酶；将液态固定化脂肪酶置于反应器中，加入6.8g的30％硫酸钠溶液(含有1mm的磷酸缓冲盐，ph为6)，2g鱼油，在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下反应1h。反应结束后，设定3000rpm转速离心3min，实验组分为上，中，下三液相，中液相为液态固定化酶，取出后加入新的5ml上述体系的富盐下相溶液，2g鱼油，在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下重复反应1h，如此类推，共重复3次，通过对硝基苯酚法进行酶活力测定，三次反应后，酶活保留率为初始反应酶活为99.5％，甘油酯上epa和dha的富集率为127.2％和139.8％，仅比初次反应降低了1.10％和1.73％。
实施例2
取6.5g含脂肪酶ays和20mm的磷酸盐缓冲体系的粗酶液(75u/ml,ph为6)，加入1.9g的硫酸钠，混匀后加入1.6g聚乙二醇400，分液取上层得3g液态固定化脂肪酶；将液态固定化脂肪酶置于反应器中，加入7g的35％硫酸钠溶液，2g鱼油，在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下反应1h。反应结束后，设定3000rpm转速离心3min，实验组分为上，中，下三液相，中液相为液态固定化酶，取出后加入新的5ml上述体系的富盐下相溶液，2g鱼油，在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下重复反应1h，如此类推，共重复7次，通过对硝基苯酚法进行酶活力测定，七次反应后，酶活保留率为初始反应酶活为99.5％，甘油酯上epa和dha的富集率为126.3％和139.0％，仅比初次反应降低了1.81％和2.34％。
实施例3
取6.5g含脂肪酶mas1的粗酶液(80u/ml)，加入1.5g的硫酸钠，混匀后加入2g[bmim]bf4，分液取上层得3.5g液态固定化脂肪酶；将液态固定化脂肪酶置于反应器中，加入6.2g的36％硫酸钠溶液，2g鱼油，在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下反应2h。反应结束后，设定3000rpm转速离心3min，实验组分为上，中，下三液相，中液相为液态固定化酶，取出后加入新的5ml上述体系的富盐下相溶液，2g鱼油，在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下重复反应2h，通过对硝基苯酚法进行酶活力测定，反应后，酶活保留率为初始反应酶活为90％，甘油酯上epa和dha的富集率为106.5％和97.6％。
实施例4
取6.5g含脂肪酶ays和20mm的磷酸盐缓冲体系的粗酶液(75u/ml,ph为6)，加入1.9g的硫酸钠，混匀后加入1.6g聚乙二醇400，分液取上层得3g液态固定化脂肪酶；将液态固定化脂肪酶置于反应器中，加入5ml的40％的硫酸钠溶液，2g鱼油，在200rpm搅拌下反应，控制在37℃下反应1h。反应结束后，设定3000rpm转速离心3min，实验组分为上，中，下三液相，取上相加入1.25ml浓度5mol/l的氢氧化钠溶液，然后加入2.5ml正己烷，静置后取萃取，萃取后的上相经蒸馏得到富epa和dha的鱼油产品，然后加入中液相液态固定化酶，最后加入新的5ml上述体系的富盐下相溶液，在1000rpm搅拌下反应，控制在37℃下重复反应1h，如此类推，共重复5次，通过对硝基苯酚法进行酶活力测定，五次反应后，酶活保留率为初始反应酶活为97％，甘油酯上epa和dha的富集率为236.3％和148.6％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。