一种神经氨酸酶多肽抑制剂及其应用的制作方法

本发明属于药物技术领域，具体涉及具有抑制神经氨酸酶活性的多肽抑制剂，以及所述多肽抑制剂在预防、处理、减轻或治疗病毒感染疾病中的应用。

背景技术：

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，严重危害人类的健康和生命。流感病毒表面具有糖蛋白血凝素(ha)、神经氨酸酶(na)和m2蛋白，其中，na对流感病毒的传染性有多方面的作用。1)有助于病毒颗粒的释放。na能催化裂解宿主细胞表面受体末端的唾液酸残基与糖蛋白、糖脂和寡聚糖之间的α-糖苷链，协助新生病毒颗粒从被感染宿主细胞表面游离下来，促进病毒颗粒在感染细胞周围的扩散，引起或加重流感症状；2)防止新生流感病毒的聚集。新生病毒的ha能够识别并结合临近病毒表面的唾液酸，有自我聚集倾向，而na能够切断病毒表面的唾液酸，阻止病毒从宿主细胞释放后的凝聚，提高了流感病毒的传播能力；3)提高病毒感染宿主细胞的效率。在流感病毒感染宿主细胞的早期，病毒表面的ha极易与细胞表面的诱导受体(如黏液素、纤毛、细胞表面糖蛋白等)非特异性结合，若这种连接键不被打断，病毒被固定而无法移动，而na能水解ha与诱导受体间的连接，使病毒迁移到正确的位点与ha受体结合，感染细胞。(airgm，laverwg.theneuraminidaseofinfluenzavirus.proteins-structurefunction&bioinformatics，2010，6(4)：341-356)(ohuchi，m，etal.rolesofneuraminidaseintheinitialstageofinfluenzavirusinfection.microbes&infection2006，8(5)：1287-1293)因此，病毒的扩散必须依赖na的生物活性，通过对na特异性的抑制，能够有效的抑制流感病毒的传播，从而起到抗流感的作用。

现在，常用的na抑制剂有oseltamivir和zanamivir等类型化合物。但是zanamivir口服生物利用度低，给药不便(cassdlmr，efthymiopoulosc，byea.pharmacokineticsofzanamivirafterintravenous，oral，inhaledorintranasaladministrationtohealthyvolunteers.clinicalpharmacokinetics，1999，36(1)：1-11)；而应用较为广泛的oseltamivir则在一些病毒株中产生耐药性(meijera，lackenbya，hungneso，etal.oseltamivir-resistantinfluenzavirusa(h1n1)，europe，2007-08season[j].emerginginfectiousdiseases，2009，15(4)：552-560)。本专利所涉及的多肽是针对na靶点，na是流感病毒特有的酶，宿主细胞中没有类似的酶类，因此以此为靶点对于人体毒性风险较低。因此，开发针对流感病毒na的多肽抑制剂，可以达到抗病毒的疗效。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种神经氨酸酶多肽抑制剂，并提供其在预防、处理、减轻或治疗病毒感染疾病中的应用。

本发明提供一种神经氨酸酶多肽抑制剂，其特征在于，所述的多肽抑制剂由4-14个氨基酸组成。

作为优选，所述多肽抑制剂氨基酸序列为：ghrkpaqp、errkpaqp、gwrkpaqp、eeekpaqp、viskhaqa、edrkhaqa、kefhktaqp、hsfhhkpaqa、ehdpktahq、grrskpaqp、ddhktahq、efrtmvhpk、frrrplra、sfnarlpr、vrkhhkpaqa、mwrvhpkp、ieertmhh、wkrlhhkpa、wrsptmvh、yerkpaqp。

所述神经氨酸酶多肽抑制剂，其特征在于，所述多肽抑制剂氨基酸序列从c端至n端可减少2-4个氨基酸。

所述神经氨酸酶多肽抑制剂，其特征在于，所述多肽抑制剂氨基酸序列从c端至n端可增加2-4个氨基酸，所增加的氨基酸包括天然氨基酸或非天然氨基酸。

所述神经氨酸酶多肽抑制剂，其特征在于，其氨基酸可为d型或l型，并可在单个或多个氨基酸上进行包括但不限于甲基化、乙酰化、磷酸化等修饰，修饰方法为常规修饰。

所述神经氨酸酶多肽抑制剂，其特征在于，所述多肽为线性结构或环合结构。

本发明提供一种神经氨酸酶多肽抑制剂的药物制剂，所述多肽抑制剂可制成药学上可接受的各种剂型，包括但不限于注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂及其他口服液、栓剂等。

本发明还提供一种或多种神经氨酸酶多肽抑制剂单独或联合抗氧化类药物在预防、处理、减轻或治疗病毒感染疾病中的应用。

作为优选，所述病毒为流感病毒，但不限定范围。

作为优选，所述抗氧化类药物为维生素c、维生素e，但不限定范围。

用h1n1流感病毒与狗肾传代细胞(mdck)共孵育1小时后弃去病毒液，加入不同浓度的多肽抑制剂，共孵育48小时，采用mtt法检测细胞活性，计算多肽药物抑制50％病毒感染细胞的浓度，记作ic50。实验结果显示筛选的多肽抑制剂对h1n1有较低的ic50。证实，所筛选的多肽抑制剂对病毒感染细胞具有较强的抑制作用。

本发明的神经氨酸酶活性的多肽抑制剂有以下特点：

1)相比与化学药物来说，多肽药物具有更高的选择性，多肽降解后形成氨基酸，不易在体内蓄积，不会造成异物代谢引起的毒理学问题。

2)筛选的多肽抑制剂对正常细胞无毒性；在较低的浓度下即可有效抑制流感病毒对细胞的感染，对神经氨酸酶活性的抑制呈现时间和剂量依赖性。

附图说明

图1为多肽药物抑制流感病毒h1n1感染细胞的作用

图2为多肽药物对正常细胞hek293t(人胚胎肾细胞)

图3为多肽药物对神经氨酸酶活性的抑制作用(a)浓度依赖，(b)时间依赖

实施例

实施例1抗神经氨酸酶多肽抑制剂的筛选

利用分子对接(docking)模块从小分子库中筛选能够与神经氨酸酶对接的小分子，根据对接的分值筛选出最佳的20个蛋白序列，并采用增加或减少2-4个氨基酸，以获得更高抗病毒能力的多肽抑制剂。筛选结果如下：

采用0.01moi流感病毒(h1n1)与狗肾传代细胞(mdck)37℃共孵育1小时，弃去病毒液，并用pbs清洗细胞两次。加入不同浓度的多肽抑制剂(分值较高的10种多肽p1、p2、p4、p5、p8、p9、p13、p14、p16、p18)，共孵育48小时，采用mtt法检测细胞活性，计算多肽药物抑制50％病毒感染细胞的浓度，记作ic50。实验结果如图1所示，筛选的10种多肽药物对流感病毒(h1n1)都有较低的ic50。其中p2、p8对h1n1的ic50仅有2.24、2.99μm。结果证实，所筛选的多肽抑制剂对病毒感染细胞具有较强的抑制作用。

实施例2多肽抑制剂对正常细胞的毒性测定

将不同浓度的多肽药物(p1、p2、p4、p9、p16)与人胚胎肾细胞(hek293t)共孵育48小时，采用cck8检测多肽抑制剂的细胞毒性。

结果如图2所示，多肽药物对hek293t无毒性作用。

实施例3抗流感病毒活性的测定

按照神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒使用说明检测多肽抑制剂(p1、p2、p4、p9、p16)对神经氨酸酶活性的抑制作用。

结果如图3所示，多肽抑制剂(p1、p2、p4、p9、p16)对神经氨酸酶活性的抑制具有时间依赖性和浓度依赖性。