一种抗胃肠道消化的改善记忆肽及其用途的制作方法

本发明属于保健品领域，特别涉及一种可抗胃肠道消化的、具有改善痴呆鼠记忆能力的三肽及其应用。

背景技术：

在目前的研究中，生物活性多肽需要经历人体或小鼠胃肠道消化，并经过小肠吸收之后到达目标位置，进而发挥其生理作用。由于胃肠道消化作为人体和动物的重要屏障，会影响到多肽的结构和活性，因此，只有一部分的生物活性多肽在体内试验中具有和体外一样的生物活性。尤其是长链多肽，容易受到胃肠道酶系的酶解，断裂为短肽或者氨基酸。而短链多肽受到胃肠道酶系的影响较小，容易被吸收。

有研究发现，来源于曼彻格奶酪(manchegocheese)的活性多肽，经过模拟胃肠道消化后，tqpktnaipy的血管紧张素转换酶(ace)抑制活性提高了6倍，而vryl和kkynvpql两条多肽的ace抑制活性却出现了部分下降。

另外的研究发现，太平洋鳕鱼蛋白酶解产物(fph)在体外具有较强抗氧化及ace抑制活性，经过体外模拟胃肠道消化及小肠上皮细胞吸收后的fph及fph分离多肽组分的抗氧化活性维持不变，但ace抑制活性均存在不同程度的改变。

由此可知，多肽经过体内的消化吸收对其活性具有一定的影响。

东莨菪碱作为毒蕈碱受体拮抗剂，会影响人体和动物的短时程记忆和学习获取过程。因此，东莨菪碱多用于构建老年痴呆症病理模型。有研究表明，东莨菪碱处理后的痴呆鼠脑内抗氧化酶系发生变化，出现脑内谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和超氧化物酶(sod)活性降低，mda含量上升等现象。

现报道的药物中，除中草药提取物及dha外，仅脑活素是天然活性物质。脑活素其具有制备工艺简单，无毒副作用等特点，它是由猪脑水解得来的水解产物，作为临床用药用于治疗脑损伤等神经退化类疾病的药物，具有神经营养活性。然而，人们对于脑活素中起作用的具体多肽序列的研究并不深入，且该药物采用注射方式进入体内，无法日常补充。

中国专利申请cn107325154a和cn107226836a分别公开了一种具有改善记忆功效的多肽，其氨基酸序列分别是tyr-ser-gly-val-cys和tyr-asn-glu。值得注意的是，生物活性多肽需经过胃肠道消化、小肠上皮细胞吸收后，进入体内并到达靶点位置发挥作用。这一系列复杂的过程，尤其是胃肠道蛋白酶消化的过程，会影响到多肽的序列，进而影响多肽的生物活性。但是，上述两份申请并未进行体外模拟胃肠道消化试验验证其是否具有抗胃肠道消化特性，且并未进行动物实验验证其能否在痴呆鼠模型体内发挥改善记忆作用。

技术实现要素：

为了克服现有的改善记忆肽在经过胃肠道时可能发生降解或部分降解而影响改善记忆功效的缺陷，本发明的首要目的在于提供一种抗胃肠道消化的改善记忆肽pay。

本发明的另一目的在于提供上述改善记忆肽的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种三肽，其氨基酸序列是pro-ala-try，可通过现有技术的固相化学合成方法获得。

本发明的三肽，在经过胃肠道后，仍具有改善痴呆模型小鼠记忆能力的功效，具有抵抗胃肠道消化的能力，可以用于制备改善记忆的药物和保健品；

所述的药物和保健品还含有其他具有改善记忆功效的活性成分和/或可接受的辅料；

所述的药物和保健品可以是现有技术的各种剂型，比如口服液、胶囊剂、片剂、粉剂或颗粒剂。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明的改善记忆肽是通过固相化学合成获得，能够抵抗胃肠道消化，并且在痴呆鼠模型中具有明显的记忆改善效果，既能够单独用于制备改善记忆药物或改善记忆保健品，也能够与现有技术的改善记忆相关物质复配使用，以便取得更好的协同改善记忆的效果。

附图说明

图1是pep-paycs的一级质谱图。

图2是pepsin-paycs的一级质谱图。

图3是pancreatin-paycs的一级质谱图。

图4是digestion-paycs的一级质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：多肽pay的抗胃肠道消化特性

1、体外模拟消化

两步体外模拟消化方法操作。将合成多肽(paycs)配制成10mg/ml水溶液。首先使用胃蛋白酶(sigma，ec3.4.4.1；1:60,000,3,400umg^-1)水解多肽溶液(酶与底物的比例为1:50，w/w)，在37℃下酶解120min，ph为2.0。水解结束后，缓慢调节ph至7.5，加入胰酶(sigma，酶与底物比例为1:25，w/w)，在37℃下继续酶解240min。整个酶解过程在水浴恒温摇床中进行，胰酶酶解结束后，将酶解物加热至95℃，维持10min灭酶，并将体外消化终产物及中间产物存放在-20℃用于后续指标测定。

2、uplc-ms/ms分析paycs消化产物

采用acquityuplci-class系统联合acquityuplchsst3柱(2.1×100mm,1.8μm,waters,ireland)对paycs及其体外模拟消化产物进行分离鉴定。洗脱样品上样量为5μl，浓度为1mg/ml。流速设定为0.2ml/min。流动相a为含有0.1％甲酸的超纯水，流动相b为乙腈。洗脱程序设定为0-2min，10％b；2-10min，10-50％b；10-13min，50-10％b；13-15min，10％b；柱温设定为25℃。洗脱组分在220nm下进行检测。

其中，样品中(纯肽与消化产物)多肽序列鉴定以及精确分子量测定采用电喷雾电离四极杆飞行时间质谱仪(esi-q-tof-ms/ms)进行分析并由brukermaxisimpact超高分辨率质谱仪采集数据。质谱相关参数设定如下，四级杆电子能量为3.0ev；在碰撞池中，碰撞能量、转移时间和预脉冲存储分别为20ev、50μs和8μs。esi相关参数为：毛细管电压3.5kv，200℃干燥气体温度，4.0l/min干燥气体流速，以及0.5baresi雾化器压力。

本实验采用dataanalysis3.0软件进行手动从头测序分析，得到目标多肽序列。测定的多肽分子质量应与其理论值相匹配(error±0.002da)。本研究分别检测了paycs、胃蛋白酶消化paycs产物，胰酶消化paycs产物及完整的胃肠道消化paycs产物的质谱信号(图1至图4)。

paycs及其胃消化2h、肠道消化4h后，消化产物质谱分析结果如图1所示。

图1表示paycs纯肽一级质谱图，其精确分子量为540.1936da(+h)。

图2表示由胃蛋白酶消化后paycs消化产物(pepsin-paycs)的一级质谱图，由图中可知，经过胃蛋白酶消化后，检测到paycs纯肽562.1915da(+na)信号，且可检测到的消化产物有pay精确分子量为350.1710da(+h)及信号较弱的pa等。

图3则表示经过胰酶消化后的paycs消化产物(tripsin-paycs)，其中检测到的多肽有pay和pa等，并检测到精氨酸(r)的一级质谱信号。

图4则是经过胃肠道消化后的paycs消化产物(digestion-paycs)一级质谱图，由图可知，paycs被部分降解，得到paycs，pay两条多肽的一级质谱信号。

由上述结果可知，paycs不能完全抵抗胃肠道消化，在胃蛋白酶的酶解作用下，paycs已经部分断裂为pay等序列。paycs和pay等序列在接下来的消化过程中都存在，因此pay是能够抵抗胃肠道消化的paycs消化产物。

口服多肽在经过胃肠道消化时会受到胃蛋白酶和胰酶的作用而产生断裂。在胃部的消化过程中，胃蛋白酶更倾向于切割疏水性和芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等)之间的肽键。因此，paycs在胃蛋白酶作用下会在酪氨酸处出现断裂，出现pay多肽序列。pay在胃肠道消化过程中都能够保持完整。因此，pay是一条具有抗胃肠道消化功能的多肽。

实施例2：pay对痴呆模型小鼠记忆能力的影响

选取spf级昆明小鼠48只，雌雄各半，体重为18-22g，由广州中医药大学实验动物中心提供。试验小鼠饲养环境为室温(21±2)℃，相对湿度控制在50％-60％，12/12h明暗交替，试验期间小鼠自由饮食、摄水。小鼠于试验前7d置于实验室适应环境。将48只小鼠随机分成4组(每组12只，n＝12)，分别为空白对照组、东莨菪碱组(模型组)、吡拉西坦组(阳性对照组)、pay(0.2mmol/kg)。空白组及模型组灌服等体积蒸馏水，阳性对照组灌服吡拉西坦(400mg/kg)，受试组按上面剂量灌服相应的多肽样品，每天灌胃1次，连续灌胃20天。

通过morris水迷宫法评价pay对东莨菪碱致学习记忆获得障碍模型小鼠学习记忆能力的影响。morris水迷宫试验包括定位航行试验(placenavigation)和空间探索试验(probetest)两个部分。

分组前进行动物筛选，剃除不会游泳或游泳异常的动物，自给药开始第14天，进行定位航行实验。让动物通过空间线索学习来记忆平台位置，实验进行5天，每天训练4次。实验前一天将小鼠置于水迷宫中自由游泳2min以熟悉水性。训练时，水池分为4个象限(第ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ象限)。训练第一天为可见移动平台，此时平台高于水面1-2cm，并在平台上插入红色小旗子，便于动物识别。每训练一次，平台顺序移动一次。第2-5天为固定隐藏平台期，低于水面1-2cm。实验时按照第ⅰ、ⅲ、ⅳ象限的顺序，将小鼠面向并靠近池壁放入水中，采用视频跟踪系统记录其在60s内首次寻找到平台并且停留3秒以上所需的时间，记为逃避潜伏期(escapelatency)。训练期间，阳性对照及给药各组腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射液1.0mg/kg，模型和正常组给予等量生理盐水，30min后入水训练，连续5天。

空间探索实验，用于测试动物的学习记忆能力，在定位航行实验结束次日开始，此间需撤掉水池中的安全平台。给药第15天起，小鼠从测试点放入水池中，测定其60s内在平台象限的游泳时间。末次给药1h后，小鼠放入水中游泳，采用计算机定位跟踪系统记录小鼠60s内的游泳轨迹，并记录其穿越平台次数、平台周围游泳时间(s)以及平台周围活动路程(mm)。

测定结果如表1及表2所示。

表1pay对获得记忆障碍小鼠morris水迷宫定位航行航的影响

^#代表与正常对照组比较，p<0.05，^##代表与正常对照组比较，p<0.01。^*表示与模型对照组比较，p<0.05，^**表示与模型对照组比较，p<0.01。

由表1可以看出经过记忆获得性训练后，模型组小鼠的逃避潜伏期及总的游泳路程显著高于空白对照(p<0.01)，说明东莨菪碱所致小鼠记忆障碍模型造模成功。由结果可知，与模型组比较，吡拉西坦组(阳性对照)及pay组的小鼠逃避潜伏期及游泳总路程显著缩短(p<0.05或p<0.01)。吡拉西坦片是一种临床药物，主要用于治疗记忆衰退和不同程度的脑功能障碍。由结果可知，摄入pay之后，小鼠逃避潜伏期及游泳总路程缩短程度显著高于吡拉西坦组(p<0.05)。

表2pay对获得记忆障碍小鼠morris水迷宫空间探索的影响

^#代表与正常对照组比较，p<0.05。^*表示与模型对照组比较，p<0.05，^**表示与模型对照组比较，p<0.01。

由表2可知，与对照组小鼠相比，模型组小鼠在平台周围的游泳时间及游泳路程显著缩短(p<0.05)，该结果说明模型组小鼠无法准确记忆平台位置。产生空间记忆障碍。而pay的摄入显著增加了小鼠在平台周围的游泳时间(p<0.01、0.05)，能增加小鼠在平台周围的活动路程。

实施例3：pay对小鼠脑组织抗氧化相关指标的影响

实施例2的水迷宫试验结束后将各组小鼠处死断头，于冰上分离大脑、用冰冷生理盐水清洗血迹，按1:9质量比加入生理盐水匀浆。匀浆液在4℃下以3500r/min离心10min，吸取上清液作为待测样品，-20℃保存备用。严格按照试剂盒说明书测定sod和gsh-px活性，另外用bca试剂盒测定待测样品的总蛋白浓度。

结果如表3所示。

表3pay对小鼠脑组织抗氧化相关指标的影响

^##代表与正常对照组比较，p<0.01。^**表示与模型对照组比较，p<0.01。

与正常组比较，东莨菪碱所致记忆障碍模型小鼠脑组织的sod活性显著下降(p<0.01)，表明记忆受损小鼠脑组织中出现氧化应激反应。与模型组比较，吡拉西坦片组及pay处理组均能增加小鼠脑组织中的sod活性(p<0.01)。

综上所述，本发明的三肽pay不仅能够抵抗胃肠道消化，且在经过胃肠道消化之后仍然具有良好的体内活性，其改善记忆功效并未丧失。该三肽pay在东莨菪碱诱导的小鼠获得记忆障碍模型中具有良好的记忆改善作用，且该改善作用可能与其调控抗氧化酶系中的sod活性有关，该抗氧化作用可能与pay中酪氨酸(作为)的存在有关。酪氨酸中的活性酚醛结构以及半胱氨酸中的巯基结构可以作为氢供体，为含有这些氨基酸的多肽提供较强的自由基清除能力以改善痴呆鼠脑内氧化应激损伤状态。

实施例4

一种改善记忆的药片，含有15wt％的pay和85wt％的辅料，辅料为淀粉、蔗糖、麦芽糊精或硬脂酸镁中的一种以上。

实施例5

一种改善记忆的软胶囊，含有10wt％的pay和90wt％的辅料，辅料为磷脂酰丝氨酸，明胶，甘油，山梨糖醇液，二氧化钛，焦糖色和纯化水等。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。