一种烟曲霉LSD-1及其培养方法和应用与流程

本发明属于微生物菌株技术领域，具体涉及一种烟曲霉lsd-1及其培养方法和应用。

背景技术：

烟草中植物甾醇主要存在于细胞膜中，不但能够促进烟草的生长，而且对烟草的安全、品质都有较大的影响。烟草中甾醇主要包括豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇以及胆甾醇4种化合物，霉变的烟叶中可能还有麦角甾醇。这些甾醇类物质在烟叶成熟后对烟草品质没有多少贡献，反而是烟气中致癌物稠环芳烃(pahs)的主要前体物，卷烟烟气中61％的苯并[a]芘由它裂解产生。稠环芳烃不仅降低烟草的安全性，影响烟草的感官品质，而且对消费者的健康起到负面的影响。

技术实现要素：

本发明提供的一种烟曲霉lsd-1及其培养方法和应用。本发明的烟曲霉能够有效的降解烟草中的甾醇。

本发明提供了一种烟曲霉lsd-1，所述烟曲霉lsd-1为aspergillusfumigatus，所述烟曲霉lsd-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15985，保藏日期为2018年06月25日。

本发明提供了一种烟曲霉lsd-1的培养方法，首先，用无菌水洗涤烟叶表面2～3次，收集沉淀；然后，将沉淀用15ml生理盐水稀释后，按照10％接种量接种到分离培养基中，并在32℃，150r/min的摇床中培养3d，得到培养液；最后，将上述培养液涂于固体分离培养基平板上，并于32℃的培养箱中培养3d，得到烟曲霉lsd-1菌落。

进一步的，所述烟叶为雪茄烟烟叶。

进一步的，所述分离培养基由以下成分制得：

将1.8gna2hpo4·12h2o、1gk2hpo4·3h2o、2g(nh4)2hpo4、2gnano3、1mgcacl2·2h2o、1mgfeso4·7h2o、0.1gmgso4、1.8gznso4·7h2o、1.0g豆甾醇和1ml吐温80混合得到混合液，然后混合液进行超声震荡，并121℃下灭菌30min，得到分离培养基；

所述固体分离培养基平板由以下成分制得：

将1.8gna2hpo4·12h2o、1gk2hpo4·3h2o、2g(nh4)2hpo4、2gnano3、1mgcacl2·2h2o、1mgfeso4·7h2o、0.1gmgso4、1.8gznso4·7h2o、1.0g豆甾醇和1ml吐温80混合得到混合液；然后混合液进行超声震荡后，再向混合液中加入琼脂，并121℃下灭菌30min，得到固体分离培养基平板；其中，每100ml的混合液中加入2g琼脂。

本发明提供一种烟曲霉lsd-1在降解甾醇中的应用。

进一步的，所述甾醇为豆甾醇。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的烟曲霉lsd-1能够将豆甾醇为二氧化碳和水，且豆甾醇的降解率达到57.83％。

生物材料保藏信息说明

lsd-1，在本申请中称作烟曲霉lsd-1，已于2018年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15985，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，分类命名为烟曲霉(aspergillusfumigatus)

附图说明

图1是显微镜下实施例1烟曲霉lsd-1菌体形态特征；

图2是实施例1的烟曲霉lsd-1降解豆甾醇过程中中间产物含量图；

图3是实施例2中豆甾醇的标准曲线；

图4是实施例2中待测样品1的超高效液相色谱-质谱测试谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。本发明以下实施例中，若没有特殊说明，所用试剂皆可在市场上购买得到，若没有特殊说明，所涉及的方法皆为常规方法。

实施例1：曲霉lsd-1的分离与鉴定

1、培养基配方

(1)分离培养基的制备过程如下：

将1.8gna2hpo4·12h2o、1gk2hpo4·3h2o、2g(nh4)2hpo4、2gnano3、1mgcacl2·2h2o、1mgfeso4·7h2o、0.1gmgso4、1.8gznso4·7h2o、1.0g豆甾醇和1ml吐温80混合得到混合液，然后混合液进行超声震荡，以使豆甾醇在培养基中分散均匀，121℃灭菌30min，得到分离培养基；

(2)固体分离培养基平板的制备过程如下：

将1.8gna2hpo4·12h2o、1gk2hpo4·3h2o、2g(nh4)2hpo4、2gnano3、1mgcacl2·2h2o、1mgfeso4·7h2o、0.1gmgso4、1.8gznso4·7h2o、1.0g豆甾醇和1ml吐温80混合得到混合液；然后混合液进行超声震荡后，再向混合液中加入琼脂，121℃灭菌30min，将液体倒入培养皿，得到固体分离培养基平板。其中，每100ml的混合液中加入2g琼脂。

2、烟曲霉lsd-1的分离和培养

首先，用无菌水洗涤雪茄烟烟叶(采集自海南省五指山市)表面2～3次，收集沉淀；然后，将沉淀用15ml生理盐水稀释后，按照10％接种量接种到分离培养基中，并在32℃，150r/min的摇床中培养3d，得到培养液；最后，将上述培养液涂于固体分离培养基平板上，并于32℃的培养箱中培养3d，得到烟曲霉lsd-1菌落。

3、烟曲霉lsd-1的鉴定

(1)显微观察

用无菌的接种针从固体分离培养基平板上挑取一环菌体，置于载玻片上的水体中，用显微镜观察，如图1所示，菌落为绿色球形菌落。

(2)分子鉴定

提取dna，通用引物its1(5'-tccgtaggtgaacct-gccg-3')和its4(5'-tcctccgcttattgatatgc-3')扩增整个its序列，并进行pcr产物的纯化和扩增，然后由天津金唯智公司完成测序，测序结果经dnaman软件去除载体后，把所得的itsrdna序列提交到genbank数据库，利用blast工具进行序列比对，对样品进行鉴定。

4、结果与分析

本发明筛选到的霉菌为烟曲霉lsd-1，序列长度为574bp，序列如序列表所示。其与烟曲霉(asperqillusfumigatus)的同源性达99％，其培养特征及显微形态特征与烟曲霉(asperqillusfumigatus)最相似。该菌株已于2018年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.15985；地址为：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所。

实施例2：烟曲霉lsd-1对甾醇的降解能力

1、一级种子的制取

取一支烟曲霉lsd-1菌株斜面，用无菌接种环轻轻刮下表面的孢子，置于含有100ml无菌无机盐培养液中，150r/min，32℃培养3-5天，待孢子球长至2mm左右，进入快速生长期，备用，此为一级种子。

2、实验过程

用灭菌过的纱布过滤上述孢子液体，并用灭菌过的生理盐水洗涤两次孢子，取湿重为5g的孢子接种到甾醇含量为0.1％的100ml的液体培养基中，瓶口用无菌透气封口膜封口，放置恒温振荡培养箱中150r/min，32℃培养，每培养7d进行取样，在每个样品中加入等体积二氯甲烷萃取三次，旋涡振荡10min以萃取充分，萃取液转入分液漏斗中分液，合并二氯甲烷萃取液，并用旋转蒸发仪蒸干，干燥后的样品溶入色谱级甲醇以备后期液相色谱-质谱分析使用。

3、结果分析

(1)中间产物的分析判断

采用薄层层析(tlc)法：采用分析用硅胶板，展层剂为石油醚:乙酸乙酯＝3:1(v/v)。硅胶g板，以豆甾醇、甾-4-烯-3,17-二酮(ad)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(add)的标准品为对照，取一定量的二氯甲烷萃取样品依次点样于薄板上，用电吹风冷风吹干后在层析缸中进行薄层层析，展层后吹干，再以显色剂(20％硫酸)均匀喷淋硅胶板，于110℃烘烤10min使板上各组分显色，从而对烟曲霉lsd-1对样品中豆甾醇降解的中间产物进行初步鉴定，结果如图2所示。通过观察图2可知，被烟曲霉lsd-1降解后的样品中只有豆甾醇，而没有甾-4-烯-3,17-二酮(ad)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(add)，这就说明豆甾醇没有降解，或者豆甾醇降解了，但是降解产物不是甾-4-烯-3,17-二酮(ad)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(add)，而是完全降解为二氧化碳和水，也可以通过后面的液质结果再次证明这种猜测。

(2)降解与否以及降解率的分析

i、前期准备

a、超高效液相色谱-质谱测试条件

为了进一步确定样品中的豆甾醇是否降解，我们用超高效液相色谱-质谱联用仪(ab)对溶解在色谱级甲醇中的样品进行测定。

色谱与质谱条件：色谱柱：c18(填料粒径1.7μm，内径2.1mm×长度100mm，waters公司)毛细管柱；流速：0.4ml/min；柱温：40℃；进样量：1μl；流动相a：去离子水，流动相b：甲醇。流速：0.4ml/min；柱温：40℃；进样量：1μl；流动相a：超纯水，流动相b：甲醇。梯度洗脱程序为，0-3min：0-100％b，3-4min：100％b；4min-5min：100％-95％；5min-8min：95％b-0。柱温40℃，流速0.4ml/min，进样体积：1ul，使用大气压化学离子源(大气压化学电离，apci)，正离子扫描，多反应监测(多反应监测，mrm)模式；离子源温度：500℃。

b、试验组和对照组

试验组：

用灭菌过的纱布过滤上述孢子液体，并用灭菌过的生理盐水洗涤两次孢子，取湿重为5g的孢子，接种到甾醇含量为0.1％的100ml的液体培养基中，瓶口用无菌透气封口膜封口，放置恒温振荡培养箱中150r/min，32℃培养，第7天进行取整瓶发酵液，并过滤掉lsd-1的菌体得到样品1，在样品1中加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋涡振荡10min以萃取充分，萃取液转入分液漏斗中分液并用旋转蒸发仪蒸干，干燥后的样品1溶入色谱级甲醇得到待测样品1，待测样品1用于后期色谱-质谱分析使用。

对照组：取100ml甾醇含量为0.1％的液体培养基，为样品2，向样品2中加入等体积二氯甲烷萃取两次，旋涡振荡10min以萃取充分，萃取液转入分液漏斗中分液并用旋转蒸发仪蒸干，干燥后的样品2溶入色谱级甲醇得到待测样品2，待测样品2用于后期色谱-质谱分析使用。

ii、标准曲线的绘制

a、标准曲线和标准曲线公式

首先，将购买得到的豆甾醇溶解于色谱级甲醇中，得到不同浓度的豆甾醇甲醇溶液；然后，采用超高效液相色谱-质谱联用仪对配置得到的不同浓度的豆甾醇溶液进行测试，得到每一种浓度的豆甾醇甲醇溶液均在3.110处出现显著的峰(说明3.110为豆甾醇的特征峰)，并通过multiquant得出不同浓度的豆甾醇甲醇溶液在3.110处的峰面积；最后，以豆甾醇甲醇溶液的浓度为纵坐标，以不同浓度的豆甾醇甲醇溶液在3.110处的峰面积为横坐标，得到豆甾醇的浓度与特征峰峰面积之间的标准曲线图以及公式，标准曲线图如图3所示，标准计算公式为：

y＝8.9651x-2.3616r²＝0.9999；

b、降解率

豆甾醇的降解率计算公式为：

w％＝[(c2-c1)/c2]*100％；

其中w％为豆甾醇的降解率；c1为添加微生物的培养基中豆甾醇的浓度；c2为未添加微生物的培养基中豆甾醇的浓度。

iii、检测结果

采用超高效液相色谱-质谱联用仪分别对待测样品1和待测样品2进行测试，结果如图4所示，从图4可以看出，待测样品1在3.109处有特征峰，且通过multiquant得出其峰面积4.96×10⁶，而待测样品2在3.109处的峰面积为1.14×10⁷。将待测样品1的峰面积4.96×10⁶带入到标准曲线公式中，得到y＝8.9651×4.96-2.3616＝42.1052ppm，即待测样品1中豆甾醇的浓度为42.1052ppm；将待测样品2的峰面积为1.14×10⁷带入到标准曲线中，得到y＝8.9651×11.4-2.3616＝99.841ppm，即待测样品2中豆甾醇的浓度为99.841ppm。通过豆甾醇的降解率计算公式能够得出，待测样品1中豆甾醇的降解率w％＝[(c1-c2)/c2]*100％＝[(99.841-42.1052)/99.841]*100％＝57.83％。

得出如下结论：(1)待测样品1中的豆甾醇发生了降解，且因为待测样品1中除了豆甾醇的特征峰以及溶剂的特征峰外，没有其他明显特征峰，再次说明待测样品1中豆甾醇降解产物为二氧化碳和水。(2)将本申请的烟曲霉lsd-1在甾醇含量为0.1％的100ml的液体培养基中培养7天后，豆甾醇的降解率高达57.83％，说明烟曲霉lsd-1能够很好得降解豆甾醇。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120>一种烟曲霉lsd-1及其培养方法和应用

<141>2018-07-24

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>574

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcgcaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcg60

taccttgttgcttcggcgggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgccccc120

gggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctgttctgaaagtatgcagtctgagt180

tgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgatgaa240

gaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctt300

tgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctg360

ccctcaagcacggcttgtgtgttgggcccccgtccccctctcccgggggacgggcccgaa420

aggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgagcgtatggggctttgtcacctgctctgta480

ggcccggccggcgccagccgacacccaactttatttttctaaggttgacctcggatcagg540

tagggatacccgctgaacttaagcatatcaataa574