本发明属于生物发酵技术领域，尤其是一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法。
背景技术：
牛樟芝简称樟芝，俗名牛樟菇、红樟芝、樟内菇、樟菇、血灵芝等，野生牛樟芝唯一赖以生存的宿主是台湾牛樟树，牛樟树为台湾独有之原生珍贵树种，生长在海拔450~2000公尺之间；牛樟芝生长于老龄树干腐朽的中空内部或倒伏树干的潮湿表面，数量非常稀少，且生长速度非常缓慢，已被立法为国家级保护树种，由于数量稀少、采集不易，价值远远高于灵芝、人参，被称作药材中的王中王；牛樟芝气芳香、味辛、苦、平，含有许多生理活性成分，如多糖体、三萜类化合物、腺苷等，具有护肝、抗癌、调节免疫、去过敏、解毒和抗炎等功效，被视为独特而珍贵的药用真菌、神芝、森林中的红宝石，因此具有极高的研究和商业价值。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明旨在提供一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将牛樟芝菌种接种于斜面培养基，在温度为31~33℃的条件下恒温培养2~3天，在温度为26~28℃的条件下恒温培养7~8天，菌丝体长满斜面、微带白色，得菌丝体斜面；
所述的斜面培养基，配方为：马铃薯汁760~770ml、葡萄汁120~130ml、葡萄糖29~31g、蛋白胨15~17g、硫酸镁1.6~1.8g、磷酸二氢钾3.4~3.8g、琼脂17~19g；
（2）将菌丝体斜面接种于盛有800ml液体培养基的1000ml三角瓶中，置于转速为1000~1100r/min的磁力搅拌器上，在温度为31~33℃的条件下恒温培养2~3天，在温度为26~28℃的条件下恒温培养5~6天，长满菌丝体，得菌丝体培养液；
所述的液体培养基，配方为：黄豆粉0.75%~0.85%、玉米淀粉0.4%~0.5%、马铃薯淀粉0.4%~0.5%、葡萄糖1.4%~1.6%、蔗糖1.4%~1.6%、磷酸二氢钾0.14%~0.16%、硫酸镁0.07%~0.08%、维生素b10.001%~0.002%、余量为水；
（3）种子罐种子培养，接种量16%~18%、温度26~28℃连续黑暗条件、搅拌速度260~280r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0.41~0.45v/v，罐压72~78kpa，发酵培养3~4天，ph降至3.2~3.4，菌种种子发酵成熟；
（4）发酵罐培养，接种量16%~18%、温度26~28℃、搅拌速度为310~330r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0.53~0.57v/v，罐压60~64kpa，培养5~6天，发酵液和菌丝球对比度清晰，发酵液变稠，ph降至3.2~3.4，液体菌种发酵完成，得牛樟芝菌丝体发酵液。
作为发明进一步的方案：步骤（1）所述的马铃薯汁，按以下步骤进行制备：将马铃薯洗净，加入其重量3.4~3.8倍量、温度为38~40℃的水混合打浆，在功率为177~189w、频率为83~89khz的条件下超声处理11~13min，暂停3~5min，在功率为258~270w、频率为144~150khz的条件下超声处理18~20min，过滤，取滤液，在磁场强度为670~690g的条件下磁化处理9~11min，得马铃薯汁。
作为发明进一步的方案：步骤（1）所述的葡萄汁，按以下步骤进行制备：将葡萄洗净，加入其重量2.7~2.9倍量、温度为41~43℃的水混合打浆，在功率为146~156w、频率为94~98khz的条件下超声处理8~10min，在功率为287~297w、频率为168~172khz的条件下超声处理14~16min，过滤，取滤液，在磁场强度为890~910g的条件下磁化处理10~12min，得葡萄汁。
作为发明进一步的方案：步骤（2）所述的黄豆粉，按以下步骤进行制备：将黄豆粉碎，置入温度为48~50℃的旋转炒锅内恒温炒制6~7min，升温至76~78℃继续恒温炒制10~11min，降温至61~63℃继续恒温炒制6~7min，超微粉碎至粒径为40~50μm，得黄豆粉。
作为发明进一步的方案：一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法制备的牛樟芝菌丝体发酵液。
本发明的有益效果：本发明提供的一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法，易于操作和工厂化，制备成本低，提供的斜面培养基和液体培养基能够有效满足牛樟芝菌丝体生长所需的氮源、碳源、无机盐等营养需求，且各培养基的原料成分配合作用，有效营养物质生物活性强，易于被牛樟芝菌丝体吸收利用和转化，能够有效促进牛樟芝菌丝体的快速分裂、分化和增殖，有效提高牛樟芝菌丝体发酵液的生物活性，促进牛樟芝菌丝体的营养代谢能力和营养代谢效率，促进牛樟芝菌丝体发酵液中多糖体、总三萜和腺苷等营养成分的转化合成和积累，提高牛樟芝菌丝体发酵液的应用价值和经济价值。
具体实施方式
下面用具体实施例说明本发明，但并不是对本发明的限制。
实施例1
本发明实施例中，一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将牛樟芝菌种接种于斜面培养基，在温度为31℃的条件下恒温培养2天，在温度为26℃的条件下恒温培养7天，菌丝体长满斜面、微带白色，得菌丝体斜面；
所述的斜面培养基，配方为：马铃薯汁760ml、葡萄汁120ml、葡萄糖29g、蛋白胨15g、硫酸镁1.6g、磷酸二氢钾3.4g、琼脂17g；
（2）将菌丝体斜面接种于盛有800ml液体培养基的1000ml三角瓶中，置于转速为1000r/min的磁力搅拌器上，在温度为31℃的条件下恒温培养2天，在温度为26℃的条件下恒温培养5天，长满菌丝体，得菌丝体培养液；
所述的液体培养基，配方为：黄豆粉0.75%、玉米淀粉0.4%、马铃薯淀粉0.4%、葡萄糖1.4%、蔗糖1.4%、磷酸二氢钾0.14%、硫酸镁0.07%、维生素b10.001%、余量为水；
（3）种子罐种子培养，接种量16%、温度26℃连续黑暗条件、搅拌速度260r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0.41v/v，罐压72kpa，发酵培养3天，ph降至3.2~3.4，菌种种子发酵成熟；
（4）发酵罐培养，接种量16%、温度26℃、搅拌速度为310r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0.53v/v，罐压60kpa，培养5天，发酵液和菌丝球对比度清晰，发酵液变稠，ph降至3.2~3.4，液体菌种发酵完成，得牛樟芝菌丝体发酵液。
作为发明进一步的方案：步骤（1）所述的马铃薯汁，按以下步骤进行制备：将马铃薯洗净，加入其重量3.4倍量、温度为38℃的水混合打浆，在功率为177w、频率为83khz的条件下超声处理11min，暂停3min，在功率为258w、频率为144khz的条件下超声处理18min，过滤，取滤液，在磁场强度为670g的条件下磁化处理9min，得马铃薯汁。
作为发明进一步的方案：步骤（1）所述的葡萄汁，按以下步骤进行制备：将葡萄洗净，加入其重量2.7倍量、温度为41℃的水混合打浆，在功率为146w、频率为94khz的条件下超声处理8min，在功率为287w、频率为168khz的条件下超声处理14min，过滤，取滤液，在磁场强度为890g的条件下磁化处理10min，得葡萄汁。
作为发明进一步的方案：步骤（2）所述的黄豆粉，按以下步骤进行制备：将黄豆粉碎，置入温度为48~50℃的旋转炒锅内恒温炒制6min，升温至76℃继续恒温炒制10min，降温至61℃继续恒温炒制6min，超微粉碎至粒径为40~50μm，得黄豆粉。
作为发明进一步的方案：一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法制备的牛樟芝菌丝体发酵液。
实施例2
本发明实施例中，一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将牛樟芝菌种接种于斜面培养基，在温度为32℃的条件下恒温培养2.5天，在温度为27℃的条件下恒温培养7.5天，菌丝体长满斜面、微带白色，得菌丝体斜面；
所述的斜面培养基，配方为：马铃薯汁765ml、葡萄汁125ml、葡萄糖30g、蛋白胨16g、硫酸镁1.7g、磷酸二氢钾3.6g、琼脂18g；
（2）将菌丝体斜面接种于盛有800ml液体培养基的1000ml三角瓶中，置于转速为1050r/min的磁力搅拌器上，在温度为32℃的条件下恒温培养2.5天，在温度为27℃的条件下恒温培养5.5天，长满菌丝体，得菌丝体培养液；
所述的液体培养基，配方为：黄豆粉0.8%、玉米淀粉0.45%、马铃薯淀粉0.45%、葡萄糖1.5%、蔗糖1.5%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.075%、维生素b10.0015%、余量为水；
（3）种子罐种子培养，接种量17%、温度27℃连续黑暗条件、搅拌速度270r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0.43v/v，罐压75kpa，发酵培养3.5天，ph降至3.2~3.4，菌种种子发酵成熟；
（4）发酵罐培养，接种量17%、温度27℃、搅拌速度为320r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0.55v/v，罐压62kpa，培养5.5天，发酵液和菌丝球对比度清晰，发酵液变稠，ph降至3.2~3.4，液体菌种发酵完成，得牛樟芝菌丝体发酵液。
作为发明进一步的方案：步骤（1）所述的马铃薯汁，按以下步骤进行制备：将马铃薯洗净，加入其重量3.6倍量、温度为39℃的水混合打浆，在功率为183w、频率为86khz的条件下超声处理12min，暂停4min，在功率为264w、频率为147khz的条件下超声处理19min，过滤，取滤液，在磁场强度为680g的条件下磁化处理10min，得马铃薯汁。
作为发明进一步的方案：步骤（1）所述的葡萄汁，按以下步骤进行制备：将葡萄洗净，加入其重量2.8倍量、温度为42℃的水混合打浆，在功率为151w、频率为96khz的条件下超声处理9min，在功率为292w、频率为170khz的条件下超声处理15min，过滤，取滤液，在磁场强度为900g的条件下磁化处理11min，得葡萄汁。
作为发明进一步的方案：步骤（2）所述的黄豆粉，按以下步骤进行制备：将黄豆粉碎，置入温度为49℃的旋转炒锅内恒温炒制6.5min，升温至77℃继续恒温炒制10.5min，降温至62℃继续恒温炒制6.5min，超微粉碎至粒径为40~50μm，得黄豆粉。
作为发明进一步的方案：一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法制备的牛樟芝菌丝体发酵液。
实施例3
本发明实施例中，一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将牛樟芝菌种接种于斜面培养基，在温度为33℃的条件下恒温培养3天，在温度为28℃的条件下恒温培养8天，菌丝体长满斜面、微带白色，得菌丝体斜面；
所述的斜面培养基，配方为：马铃薯汁770ml、葡萄汁130ml、葡萄糖31g、蛋白胨17g、硫酸镁1.8g、磷酸二氢钾3.8g、琼脂19g；
（2）将菌丝体斜面接种于盛有800ml液体培养基的1000ml三角瓶中，置于转速为1100r/min的磁力搅拌器上，在温度为33℃的条件下恒温培养3天，在温度为28℃的条件下恒温培养6天，长满菌丝体，得菌丝体培养液；
所述的液体培养基，配方为：黄豆粉0.85%、玉米淀粉0.5%、马铃薯淀粉0.5%、葡萄糖1.6%、蔗糖1.6%、磷酸二氢钾0.16%、硫酸镁0.08%、维生素b10.002%、余量为水；
（3）种子罐种子培养，接种量18%、温度28℃连续黑暗条件、搅拌速度260~280r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0.45v/v，罐压78kpa，发酵培养4天，ph降至3.2~3.4，菌种种子发酵成熟；
（4）发酵罐培养，接种量18%、温度28℃、搅拌速度为330r/min，无菌空气通气量为每分钟1:0.57v/v，罐压64kpa，培养6天，发酵液和菌丝球对比度清晰，发酵液变稠，ph降至3.2~3.4，液体菌种发酵完成，得牛樟芝菌丝体发酵液。
作为发明进一步的方案：步骤（1）所述的马铃薯汁，按以下步骤进行制备：将马铃薯洗净，加入其重量3.8倍量、温度为40℃的水混合打浆，在功率为189w、频率为89khz的条件下超声处理13min，暂停5min，在功率为270w、频率150khz的条件下超声处理20min，过滤，取滤液，在磁场强度为690g的条件下磁化处理11min，得马铃薯汁。
作为发明进一步的方案：步骤（1）所述的葡萄汁，按以下步骤进行制备：将葡萄洗净，加入其重量2.9倍量、温度为43℃的水混合打浆，在功率为156w、频率为94~98khz的条件下超声处理10min，在功率为297w、频率为172khz的条件下超声处理16min，过滤，取滤液，在磁场强度为910g的条件下磁化处理12min，得葡萄汁。
作为发明进一步的方案：步骤（2）所述的黄豆粉，按以下步骤进行制备：将黄豆粉碎，置入温度为50℃的旋转炒锅内恒温炒制7min，升温至78℃继续恒温炒制11min，降温至63℃继续恒温炒制7min，超微粉碎至粒径为40~50μm，得黄豆粉。
作为发明进一步的方案：一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法制备的牛樟芝菌丝体发酵液。
对比例1
一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法，与实施1的区别在于，将步骤（1）所述的马铃薯汁用所述的葡萄汁代替，其他条件均相同。
对比例2
一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法，与实施1的区别在于，将步骤（1）所述的葡萄汁用所述的马铃薯汁代替，其他条件均相同。
对比例3
一种牛樟芝菌丝体发酵液的制备方法，与实施1的区别在于，步骤（2）不加入所述的黄豆粉，其他条件均相同。
将同一批牛樟芝菌种使用实施例和对比例的制备方法制成牛樟芝菌丝体发酵液，检测其多糖体、总三萜和腺苷主要成分含量，检测结果如表1：
表1实施例和对比例牛樟芝菌丝体发酵液主要成分含量对比（brix=18%，g/100ml）
从表1可以看出，本发明制得的牛樟芝菌丝体发酵液多糖体、总三萜和腺苷等主要成分含量丰富，且含量明显高于对比例。